专利名称：一种长链二元酸生产菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物领域，具体地说，是关于ー种长链ニ元酸生产菌株热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145及其用于发酵生产长链ニ元酸的应用。
背景技术：
长链ニ元酸是合成香料、尼龙工程塑料、热熔胶、树脂、耐寒性增塑剂、医药和农药等的重要原料。特别是十二碳ニ元酸(DC12)和十四碳ニ元酸(DC14),它们分别是合成具有特殊性能和广泛用途的高级尼龙工程塑料尼龙1212和尼龙1414等的重要原料。十二碳以上的长链ニ元酸，自然界中不存在，目前化工上也没有经济可行的合成方法，因此，利用微生物的特异性转化能力，在常温常压下转化正烷烃或脂肪酸生成相应的长链ニ元酸，是目前业内研究的重点。目前，用于转化正烷烃或脂肪酸生成相应长链ニ元酸的微生物主要是热带假丝酵母(Candida tropicalis),虽然转化生产ニ元酸的能力各有千秋,但没有关于ー株菌种对不同碳链都具有较强转化能力的报道，例如申请号为97103876. 7的中国发明专利申请，公开了ー种热带假丝酵母(Candidatropicalis),可用于同步发酵正十三烧生产相应的i^一烧1,11- ニ羧酸；申请号为02100215. 0的中国发明专利申请中，公开的热带假丝酵母(Candidatropicalis)可用于同步发酵正十四烧生产十二烧1,12- ニ羧酸；申请号为02145431.0的中国发明专利申请中，公开了ー种热带假丝酵母(Candida tropicalis),可用于生产a、w-正长链十四碳ニ元酸；申请号03105127. 8的中国发明专利申请中，公开了ー种热带假丝酵母(Candidatropicalis)，可用于同步发酵正十四烷生产十四碳ニ元酸；申请号200610127968. 6的中国发明专利申请中，公开了 ー种热带假丝酵母(Candida tropicalis),可用于生产十二碳ニ元酸；申请号89102548. 0的中国发明专利申请中，公开了ー种热带假丝酵母(Candidatropicalis),可用于发酵正烧烃生产十七碳ニ羧酸；申请号94100594. I的中国发明专利申请中，公开了ー种热带假丝酵母(Candidatropicalis)，可用于发酵正烷烃生产十五碳ニ羧酸；申请号95117436. 3的中国发明专利申请中，公开了ー种热带假丝酵母(Candidatropicalis),可用于同步发酵生产十二碳ニ羧酸。
发明内容
本申请的发明人通过以现有长链ニ元酸生产菌株NP-6-5为出发菌株，通过常规诱变方法进行诱变育种后，筛选得到了一株新的热带假丝酵母(Candida tropicalis)CATN145，其能够将不同长度的正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物高效转化为相应的ニ元酸。
因此，本发明的ー个方面，提供了一种长链ニ元酸生产菌株——热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145,其对于不同碳链长度的ニ元酸具有广泛的适用性。本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145，其保藏号为CCTCCM2011192。与热带假丝酵母ATCC 20336的CYP52A18基因相比，以其ATG起始密码子开始计算，本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis) CAT N145,其pox4基因的325位、901位和1886位碱基为A，其fao基因的539位碱基为G，其CYP52A18基因在170位和813位的碱基分别为的T和C。根据本发明，所述pox4基因的序列如SEQ ID NO 2所示，所述fao基因的序列如SEQ ID NO 4所示，所述CYP52A18基因的序列如SEQ ID NO 6所示。
根据本发明，所述长链ニ元酸包括C9 18的长链ニ元酸。本发明的另ー个方面，提供了所述菌株CAT N145用于转化正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物生产相应的ニ元酸的应用。本发明的第三个方面，提供了一种长链ニ元酸的生产方法。根据本发明，所述长链ニ元酸的生产方法是通过发酵菌株CAT N145转化C9 18正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物生成相应的长链ニ元酸。根据本发明的优选实施例，所述菌株CAT N145的发酵培养基如下玉米浆I 5g/L,酵母膏 I 5g/L, KH2PO4 4 12g/L, NaCl 0 3g/L, KNO3 4 12g/L，蔗糖10 40g/L，尿素0. 5 3g/L，正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物400 300mL/L, pH 至 7. 5 7. 6。优选的，其发酵过程描述如下取甘油管种子接入种子培养基，在28 31°C培养，摇床转速200 250rpm，当种子液的0D620达到0. 8以上(水稀释30倍)时，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，在28 31°C培养，摇床转速200 250rpm，发酵周期90 120hours。本发明中，培养基中加入的正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物的碳链长度需要与所需生产的ニ元酸的碳链长度相对应。本发明的第四个方面，提供了ー种来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)CATN145的pox4基因，其序列如SEQ ID NO 2所示。本发明的第五个方面,提供了ー种来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)CATN145的fao基因，其序列如SEQ ID NO 4所示。本发明的第六个方面,提供了ー种来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)CATN145的CYP52A18基因，其序列如SEQ ID NO 6所示。本发明的长链ニ元酸生产菌株-热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT
N145，对于不同碳链长度的正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物都具有很高的转化性能，适用性非常广泛，具有非常好的市场应用前景。
图I为本发明的菌株CAT N145的pox4基因与热带假丝酵母ATCC 20336的pox4基因的序列比对示意图，其中P0X4为ATCC 20336的pox4基因，P0X4-1为本发明的菌株CATN145的pox4基因。图2为本发明的菌株CAT N145的fao基因与热带假丝酵母ATCC 20336的fao基因的序列比对示意图，其中，faol为ATCC 20336的faol基因，fao为本发明的菌株CATN145的faol基因。图3为本发明的菌株CAT N145的CYP52A18基因与热带假丝酵母ATCC 20336的CYP52A18基因的序列比对示意图，其中，CYP52A18为ATCC 20336的CYP52A18基因，CYP18为本发明的菌株CATN145的CYP52A18基因。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明做进ー步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145已于2011年6月9日提交位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2011192。以下实施例中所使用的培养基如下I、活化培养基/甘油罐培养基YPD培养基配方(w/v)葡萄糖2.0%，酵母膏I. 0%，蛋白胨2. 0%，琼脂2. 0%，加自来水至所需体积，pH 7.0 7. 2。2、种子培养基配方(w/w)鹿糖10 20g/L,玉米衆2 4g/L,酵母膏3 8g/L, KH2PO4 4 12g/L,尿素
0.5 4g/L，正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物0 30mL/L(做不同链长的ニ元酸，用不同链长的烷烃或脂肪酸)。培养基在121 °C灭菌20分钟。30mL种子培养基接种到500mL摇瓶，在28 31°C培养。摇床转速200 250rpm培养时间36 48hours。当种子液的OD62tl在0. 8以上(水稀释30倍)，将3. 5ml种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中。3、发酵培养基配方(w/w) 玉米衆I 5g/L,酵母骨 I 5g/L, KH2PO4 4 12g/L, NaCl 0 3g/L, KNO3 4 12g/L，蔗糖10 40g/L，尿素0. 5 3g/L (115°C，20min単独灭菌)，正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物(做不同链长的ニ元酸，用不同链长的烷烃或脂肪酸)400 300mL/L，用IN NaOH溶液调节pH至7. 5 7. 6。以下实施例中所使用的ニ元酸测定方法I、ニ元酸样品的制备发酵终了，在500mL三角瓶中，用6mol/LHCl调pH值至3.0，每瓶加入120mLこ醚，摇动100次，放置30min以上，静置分层，取出40mLこ醚提取液，加到IOOmL烧杯中，除去こ醚，得到白色固体，然后进行ニ元酸的測定。2、ニ元酸产量的測定将提取得到的ニ元酸用中性热こ醇(95% )溶解，加入一滴酚酞，用标准NaOH溶液滴定，记录消耗的NaOH体积，计算DC12产量。
实施例I本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis) CAT N145,经传代实验验证,经多次传代后菌落形态及生产长链ニ元酸的能力均未出现明显变化。可见本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145的传代稳定性良好。实施例2利用TaKaRa公司的Yeast DNAiso Kit试剂盒提取菌株的基因组DNA，以基因组为模板进行PCR扩增，PCR所用的酶为Biomad公司的Pfu酶，PCR体系及条件按照说明书进行操作。PCR扩增pox4、fao和cyp52al8基因，所用引物如下表所示。pox4s AACGACATAATGACNTTNAC pox4a TTATTTGGACAAAATAGCAGfaos AAAGGCDTATGAAWCCCAGGfaoa CATTCAAACAATCTACCATCal8s GyGCTGCTCCwrTCACAAACaI8a CTArTCrAwCTTGACAATAGPCR 完成后加入 2 ii L 的 dNTP 和 0. 5 ii L 的 rTaq 酶，72°C反应 30min。利用 TaKaRa公司的Agarose Gel DNA Purification Kit试剂盒将PCR产物进行回收。将回收的产物与pMD18-T载体进行连接，连接操作按照产品说明书进行。连接产物转化大肠杆菌T0P10或DH5 a，挑取阳性克隆子送Invitrogen公司测序。将测序结果与GeneBank公布的ATCC 20336的相应基因P0X4(Genebank号为M12160)，FAOl (Genebank 号为 AY538780)，CYP52A18 (Genebank 号为 AY230505)进行比对，以下位置均按照ATCC 20336相应基因的atg开始计算，结果显示，CAT N145pox4基因在图I所示的325位、901位和1886位的G突变为A，相对应的氨基酸由301位的缬氨酸和629位的精氨酸分别突变为异亮氨酸和赖氨酸ばao基因在图2所示的539位的A突变为G，相对应的氨基酸由180位的谷氨酸突变为甘氨酸；cypl8基因在图3所示的170位的C变为T，813位的G变为C，相对应的氨基酸由57位的丙氨酸和271位的谷氨酰胺分别突变为缬氨酸和组氨酸。可见本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145的ニ元酸相关基因在序列上与现有报道的相应基因存在差异，此外从发酵性能表现来看，本菌株也与现有报道的菌株具有明显的不同，本发明的菌株CAT N145是新的菌株。实施例3取I支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121°C灭菌20分钟)，其中，正烷烃为C12。500mL摇瓶装入30mL种子培养基，在28 31°C培养，摇床转速200 250rpm，培养时间36 48hours。当种子液的0D620达到0. 8以上(水稀释30倍)时，将3. 5ml种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中。发酵培养基中所加的正烷烃为Cl2，培养基在121 °C灭菌20分钟，500ml装15mL培养基。在28 31°C培养，摇床转速200 250rpm，发酵周期90 120hours。发酵结束后，測定发酵液中的DC12 ニ元酸的含量为151.2g/L。实施例4按实施例3的方法，将C12替换为C13，其余相同。
结果显示，测定发酵液中的ニ元酸DC13的含量为124. 4g/L。实施例5按实施例3的方法，将C12替换为C14，其余相同。结果显示，测定发酵液中的ニ元酸DC14的含量为166. 9g/L。实施例6按实施例3的方法，将C12替换为C16，其余相同。结果显示，测定发酵液中的ニ元酸DC16的含量为109. 7g/L。实施例7 按实施例3的方法，将C12替换为十四碳脂肪酸甲酷，其余相同。结果显示，测定发酵液中的ニ元酸DC14的含量为133. 9g/L。
权利要求
1.一种长链ニ元酸生产菌株CAT N145，其特征在于，所述菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)，其保藏号为 CCTCC M 2011192。
2.根据权利要求I所述的菌株CATN145，其特征在于，与热带假丝酵母ATCC20336的pox4基因相比，以其ATG起始密码子开始计算，本菌株的pox4基因在325位、901位和1886位碱基为A。
3.根据权利要求2所述的菌株CATN145，其特征在于，所述pox4基因的序列如SEQ IDNO 2所示。
4.根据权利要求I所述的菌株CATN145，其特征在于，与热带假丝酵母ATCC20336的faol基因相比，以其ATG起始密码子开始计算，本菌株的fao基因在539位碱基为G。
5.根据权利要求4所述的菌株CATN145，其特征在于，所述fao基因的序列如SEQIDNO -A所示。
6.根据权利要求I所述的菌株CATN145，其特征在于，与热带假丝酵母ATCC20336的CYP52A18基因相比，以其ATG起始密码子开始计算，本菌株的CYP52A18基因在170位的碱基为T，813位的碱基为C。
7.根据权利要求6所述的菌株CATN145，其特征在于，所述CYP52A18基因的序列如SEQ ID NO 6 所示。
8.根据权利要求I所述的菌株CATN145，其特征在于，所述长链ニ元酸包括9 18碳ニ元酸。
9.权利要求I 8中任一项所述的菌株CATN145用于生产长链ニ元酸的应用，其特征在于，用于发酵转化的原料为正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物，生产相应的长链ニ元酸。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述长链ニ元酸包括9 18碳ニ元酸。
11.一种长链ニ元酸的生产方法，其特征在于，通过发酵热带假丝酵母(Candidatropicalis)CAT N145转化正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物生成相应的长链ニ元酸。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述长链ニ元酸包括9 18碳ニ元酸。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述菌株CATN145的发酵培养基如下 玉米浆 I 5g/L，酵母膏 I 5g/L, KH2PO4 4 12g/L，NaCl 0 3g/L，KN03 4 12g/L，蔗糖10 40g/L，尿素0. 5 3g/L，正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物400 300mL/L, pH 7. 5 7. 6。
14.根据权利要求11或12所述的方法，其发酵过程描述如下取甘油管种子接入种子培养基，在28 31°C培养，摇床转速200 250rpm，当种子液的0D620达到0. 8以上(水稀释30倍)时，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，在28 31°C培养，摇床转速200 250rpm,发酵周期 90 120hours。
15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，培养基中加入的正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物与所需生产的ニ元酸的碳链长度相对应。
16.ー种pox4基因，其特征在于，其与热带假丝酵母ATCC 20336的pox4基因相比，以其ATG起始密码子开始计算，本菌株的pox4基因在325位、901位和1886位碱基为A。
17.根据权利要求16所述的基因，其特征在于，所述基因来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145，其保藏号为 CCTCC M 2011192。
18.根据权利要求17所述的pox4基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQID NO 2所示。
19.ー种fao基因，其特征在于，与热带假丝酵母ATCC 20336的faol基因相比，以其ATG起始密码子开始计算，本菌株的fao基因在539位碱基为G。
20.根据权利要求19所述的pox4基因，其特征在干，所述基因来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145，其保藏号为 CCTCC M 2011192。
21.根据权利要求20所述的pox4基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQID NO 4所示。
22.ー种CYP52A18基因，其特征在于，与热带假丝酵母ATCC 20336的CYP52A18基因相比，以其ATG起始密码子开始计算，本菌株的CYP18基因在170位的碱基为T，813位的碱基为C。
23.根据权利要求22所述的基因，其特征在于，所述基因来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145，其保藏号为 CCTCC M 2011192。
24.根据权利要求23所述的CYP52A18基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQIDNO6所示。
全文摘要
本发明公开了一种长链二元酸生产菌株——热带假丝酵母(Candida tropicalis)CATN145，其保藏号为CCTCC M 2011192。本发明还公开了所述菌株的应用以及一种利用所述菌株生产二元酸的方法。本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145，对于不同碳链长度的正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物都具有很高的转化性能，而且杂酸含量低，适用性非常广泛，从而可以大大简化发酵过程控制，易于提取纯化，具有非常好的市场应用前景。
文档编号C12R1/74GK102839133SQ20111016867
公开日2012年12月26日 申请日期2011年6月21日 优先权日2011年6月21日
发明者刘驰, 李乃强, 廖锦绣, 刘文山, 汪江林 申请人:上海凯赛生物技术研发中心有限公司, 上海凯赛生物科技有限公司, 山东凯赛生物科技材料有限公司