专利名称：：检测洋葱腐烂病菌的核苷酸序列和试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及检测洋葱腐烂病菌的核苷酸序列和试剂盒，属于植物检验检疫领域。
背景技术：
：洋葱腐烂病菌QBurkholderiagladioliρv.aWiicoh)隶属于原核生物界(Procaryoces)、薄壁菌门(Gracilicutes)、肠杆菌禾斗(Enterobacteriaceae)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、唐菖蒲伯克霍尔德菌(Murkholderiagladioli)。唐菖蒲伯克霍尔德嵬〔Burkholderiagladioli)是一种引起唐菖蒲球茎腐烂的病原菌，Severini在1913年的文献中最早描述了这种病原菌，并将其命名为作洲而膨/？浙gladioli01992ip，Pseudomonasgladioli与胃它7^{同属于fiUfi属(.Pseudomonas)rRNAGroupII的菌种一起被划分到了一个新属——伯克霍尔德菌属Ofcrf^Aferia),从而被命名为Burkholderiagladioli。洋葱腐烂病菌最初只是被当成一种植物病原菌。寄主植物主要是葱属植物{Alliumc^a)和郁金香属(TWiA3spp.)。主要致病症状是鳞茎的内部鳞片腐烂，初期外观看不到症状，但后期整个鳞茎变软，可看到大量细菌分泌物。在叶片上也可产生干燥的坏死斑。洋葱腐烂病菌侵染洋葱叶片后，一到两片叶片会枯萎变白，并且脱落，病原菌由叶片再侵染至球茎。受侵染的洋葱鳞球茎，先期外部无明显特征，只在鳞球茎颈部出现腐烂，剖开后，发现内部一到两个小鳞茎已呈水浸状。后期肉质鳞状组织出现水浸状，由白黄色变为浅褐色，逐渐腐烂变软，在病害发病后期会有粘性、腐烂难闻液体流出，直至整个球茎变干、枯萎。田间发病率可达到89.1%。传播途径包括带菌种子、鳞球茎，土壤等。1985年，Christenson^ΜΜΙBurkholderiagladioli感染囊性纤维化(CF，CisticFibrosis)病人呼吸道的病例。接着，陆续在慢性肉芽肿和免疫功能减弱的病人体RM7Burkholderiagladioli.Burkholderiagladioli感染的病症还包括败血病、脓肿、骨髓炎、角膜炎和淋巴腺炎。^zr姑Weriagladioli可能主要导致CF病人的急性感染以及肺移植术后的血液感染，目前还没有^zr姑Weria^/ai/iWi在病人与病人之间传播的报道。洋葱腐烂病菌是引起洋葱腐烂的高风险检疫性病菌，其准确检测和鉴定在检验检疫工作中具有重要意义。鉴于我国目前没有洋葱腐烂病的发生危害报道，为了减少境外洋葱腐烂病菌传入的风险、保护公众健康，本发明研究开发出一种特异的洋葱腐烂病菌检测技术。
发明内容本发明要解决的第一个技术问题是提供检测洋葱腐烂病菌的核苷酸序列。本发明要解决的另一个技术问题是提供检测洋葱腐烂病菌的试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测引物，为序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列。检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR探针，为序列表SEQIDNo.3的寡核苷酸序列。所述探针的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团BHQ1。本发明根据NCBI数据库中Burkholderiagladiolipv.alliicolaITS基因序列保守区，设计并经大量筛选得到最佳引物和探针。探针5'端标记报告荧光染料6-Carboxyfluorescein(FAM)，3'端标记淬灭荧光染料BHQl。引物和探针由宝生物工程有限公司合成。上游引物PBAF:5'-GCTTCCGCTATCCAAATTACTACTTC-3'(SEQIDNo.1)；下游引物PBAR:5'-ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGAC-3'(SEQIDNo.2);探针为FAM_ATTGTTAAAGAACGACAGCCGATAAGCACAC-BHQ1(SEQIDNo.3)。检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测引物和检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR探针；所述检测引物为序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列，所述探针为序列表SEQIDNo.3的寡核苷酸序列，探针的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团BHQ1。一种检测洋葱腐烂病菌的试剂盒，由以下组分组成(1)PCR反应液由2X反应液I^remixEXTaq、引物PBAF、引物PBAR和探针组成；反应液I^remixEXTaq的终浓度为1X，引物PBAF的终浓度为0.3uM、引物PBAR的终浓度为0.3uM，探针的终浓度为0.IuM；2X反应液I^remixEXTaq购于Takara公司；引物和探针均委托iTakara公司合成，其中，引物PBAF(引物1)为序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR(引物2)为序列表SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，探针为序列表SEQIDN0.3所示的核苷酸序列，探针5'端标记报告荧光染料6-Carboxyfluorescein(FAM)，3'端标记淬灭荧光染料BHQl；(2)无DNA酶的灭菌纯化水用自来水两次蒸馏，经过MilliporeMILLI-QPFPLUS纯水仪纯化，收取电阻率彡18.0ΜΩ.cm的水，贮于无菌瓶中。Millipore-Q纯化水151bf/in2(1.034X105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟；(3)阴性对照lmLX1管；研磨无菌健康洋葱鳞球茎，用0.01mol/LpH7.2PBS缓冲盐溶液制成20%悬液，121°C灭活30min；(4)阳性对照=ImLXl管；为含有洋葱腐烂病菌ifea核糖体基因保守区序列(SEQIDN0.4)的重组质粒，Ct值为22.0沘.0。阳性对照的制备方法为用SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的引物序列对洋葱腐烂病菌进行PCR反应，回收PCR扩增产物，获得高纯度的138bp核糖体基因保守区序列(SEQIDNo.4)，与pGEM-Teasy载体(购自Promega公司)进行连接，转化Ε.coliCompetentCellsDH5α感受态细胞(购自Promega公司)，使用TakaraMiniBESTPlasmidPurificationKitVer2.O(购自TaKafci公司)质粒提取试剂盒提取DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒作为阳性对照，命名为pGEM-Bga。10倍连续梯度稀释裂解液，测定Ct值，Ct值为22.O观.O均可作为阳性对照。核糖体基因保守区序列如下(SEQIDNo.4):ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGACTCGAGTCTTTGTCATTGGCGATTGAGCCAGTCAGAGTGATGAGTACACAAGTGTGCTTATCGGCTGTCGTTCTTTAACAATCTAGAAGAAGTAGTAATTTGGATAGCGGAAGC。本试剂盒还可以含有细菌基因组DNA提取试剂，其目的是从培养的待测细菌中提取得到基因组DNA，属于本领域常规操作。多种商业来源的细菌基因组DNA提取试剂盒均可满足要求。例如本发明还可以包括(5)细菌基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，货号DP302-02。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法能在摇培12h后，从模拟的最低含菌量的洋葱种子中检出洋葱腐烂病菌。研究表明，在3000粒洋葱种子表面，最低带菌量118个、制样时完全被从种子表面洗脱下来的情况下，通过本发明建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速有效地检出洋葱腐烂病菌。本发明的优点是本发明建立了特异、灵敏、快速的TaqMan探针荧光定量PCR方法和试剂盒用于检测洋葱腐烂病菌。利用洋葱腐烂病菌保守基因序列设计引物和TaqMan探针并进行筛选，优化PCR反应条件和体系，对BurkholderiagladioliW.alIiicola菌、对照菌进行检测，验证该方法和试剂盒的特异性、敏感度、重复性等。该方法利用高特异性引物对目的基因进行扩增，实现了快速、高特异性和高灵敏度的结合，检测灵敏度达1个拷贝/反应，反应时间仅需1h左右。实验结果表明该方法和试剂盒适合于口岸对洋葱腐烂病菌的快速检测。以下通过实施例和说明书附图详细说明本发明技术方案，并不以此限定本发明的实施范围。图1为实施例1的荧光定量PCR标准曲线。图2为实施例1的Burkholderiagladiolipv.alliicola菌iTaciMan探针荧光定量PCR特异性检测结果。图3为实施例IBurkholderiagladiolipv.alliicola菌TaqMan探针荧光定量PCR灵敏度检测结果。图4为实施例3各个梯度不同时间点荧光定量PCR检测结果。图5为实施例3各个梯度不同时间点荧光定量PCR检测结果。具体实施例方式实施例1洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测一.材料与方法1.材料试剂Burkholderiagladiolipv.alliicolaATCC20157、ATCC20159、ATCC20160、ATCC20161由美国CampbellVegetableResearch&DevelopmentCenter的HasanBolkan博士提共。BurkholderiaandropogonisATCC23060,BurkholderiacaryohpyATCC11441,BurkholderiaglumaeATCC33617购自中国菌种保藏中心。^/rlCepaciaY3,Burk.MultivoransPW99,Burk.cenocepaciaY10,Burk.cenocepacia317,Burk.stabilisJlOO,Burk.vietnamiensis419,Burk.anthinaYP46,Burk.pyrrocinia？m，Burk.arborismi,Burk.seminalisMb,Burk.contaminansY4DNA由浙江大学谢关林教授提供。细菌培养使用NA培养基、反应液ft~emiXEXTaq等试剂均购自Takara公司；PCR所用探针引物合成自Takara公司。2.仪器SLAN荧光定量PCR仪，超低温冰箱(Thermo)，超净台(苏净集团)，培养箱(Memmert)。3.特异性探针及引物设计根据NCBI数据库中Burkholderiagladiolipv.alliicola核糖体基因序列保守区，设计引物和探针。探针5'端标记报告荧光染料6-Carboxyfluorescein(FAM)，3'端标记淬灭荧光染料BHQ1。引物和探针由宝生物工程有限公司合成。上游引物PBAF:5,-GCTTCCGCTATCCAAATTACTACTTC-3'；下游引物PBAR5'-ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGAC-3‘；探针为FAM-ATTGTTAAAGAACGACAGCCGATAAGCACAC-BHQ1。4.标准曲线将摇培的菌悬液进行10倍倍比稀释作为标准品，采用3MPetrifilm菌落总数测数片对菌悬液进行计数，分别取1PL做模板，在最佳反应条件下进行定量扩增，利用荧光定量PCR仪配套软件绘制以初始模板浓度的对数为X轴，Ct值为Y轴的标准曲线。5.荧光定量PCR特异性检测荧光定量PCR扩增体系和反应条件总反应体系为20μ，包括PremixEXTaq10PL，上游引物0.5μ，下游引物0.5μ，探针0.3μ，模板菌液1μ(模板DNA采用TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取)，用ddH20补足至20μ。反应条件为95"C5mins，l个循环；95"C5s；60"C20s，40个循环。选取细菌菌液为模板进行姑oAferiagladiolipv.aBiicoh菌特异性检测，阴性对照选取伯克氏菌属的菌株作为参比菌株。6.荧光定量PCR灵敏度检测用灭菌水按十倍梯度稀释姑Weriagladiolipv.alliicola菌液进行相对灵敏度检测，取1PL菌液进行PCR检测，并同时取相同量菌液涂布平板，30°C培养36h后进行单菌落计数，以确定每稀释倍所含菌量。二.结果与分析1.标准曲线5个梯度的菌悬液，在最佳反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，利用荧光PCR仪配套软件生成扩增反应标准曲线和直线回归方程。标准曲线方程为y=-3.416x+44.287,r=-0.9999。标准曲线表明，菌悬浓度在1.02X107cfu/mL1.02X103cfu/mL范围内与Ct值之间呈良好的线性关系，荧光定量PCR的扩增效率为96.3%，也就是说，每个循环的重点，扩增子的拷贝数增加1.96倍，或96.3%的模板被扩增。标准曲线见图1。2.供试的4株洋葱腐烂病菌(ATCC20157、ATCC20159、ATCC20159、ATCC20159)、14种洋葱腐烂病菌近似种(BurkholderiaandropogonisATCC23060，BurkholderiacaryohpyATCC11441,BurkholderiaglumaeATCC33617,Burk.CepaciaY3,Burk.MultivoransPff99,Burk.cenocepaciaY10,Burk.cenocepacia317,Burk.stabilisJ100,Burk.vietnamiensis419,Burk.anthinaYP46,Burk.pyrrocinia301,Burk.arborisHT1,Burk.seminalisR45,Burk.contaminansY4)在相同条件下进行TaqMan探针荧光定量PCR检测。该方法中4株洋葱腐烂病菌均有明显的扩增曲线生6成，说明本试验TaqMan探针及引物具有高特异性(图2)。3.灵敏度检测结果供试的洋葱腐烂病菌梯度菌液在同一反应中，通过细菌总数测数片测得梯度浓度依次为1.02Χ107、1·02Χ106、1·02Χ105、1·02Χ104、1·02Χ103、1·02XIO2cfu/mL以及空白对照。本试验的检测下限为1.02X103cfu/mL，体现了该方法的高灵敏度，如图3所示。实施例2检测洋葱腐烂病菌的试剂盒一种检测洋葱腐烂病菌^zr姑Weriagladiolipv.aWiicoh的试剂盒，由以下组分组成(I)PCR反应液由2X反应液I^remixEXTaq、引物PBAF、引物PBAR和探针组成；反应液I^remixEXTaq的终浓度为1X，引物PBAF的终浓度为0.3uM、引物PBAR的终浓度为0.3uM，探针的终浓度为0.IuM；2X反应液I^remixEXTaq购于Takara公司；引物和探针均委托iTakara公司合成，其中，引物PBAF(引物1)为序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR(引物2)为序列表SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，探针为序列表SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，探针5'端标记报告荧光染料6-Carboxyfluorescein(FAM)，3'端标记淬灭荧光染料BHQl。(2)无DNA酶的灭菌纯化水用自来水两次蒸馏，经过MilliporeMILLI-QPFPLUS纯水仪纯化，收取电阻率彡18.OMΩ.cm的水，贮于无菌瓶中。MiIlipore-Q纯化水15Ibf/in2(1.034X105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。(3)阴性对照lmLX1管；研磨无菌健康洋葱鳞球茎，用0.01mol/LpH7.2PBS缓冲盐溶液制成20%悬液，121°C灭活30min。(4)阳性对照=ImLXl管；为含有洋葱腐烂病菌ifea核糖体基因保守区序列(SEQIDN0.4)的重组质粒，Ct值为22.0沘.0。阳性对照的制备方法为用SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的引物序列对洋葱腐烂病菌进行PCR反应，回收PCR扩增产物，获得高纯度的138bp核糖体基因保守区序列(SEQIDNo.4)，与pGEM-Teasy载体(购自Promega公司)进行连接，转化Ε.coliCompetentCellsDH5α感受态细胞(购自Promega公司)，使用TakaraMiniBESTPlasmidPurificationKitVer2.O(购自TaKafci公司)质粒提取试剂盒提取DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒作为阳性对照，命名为pGEM-Bga。10倍连续梯度稀释裂解液，测定Ct值，Ct值为22.0观.0均可作为阳性对照。(5)细菌基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司(天根生化科技(北京)有限公司)，货号DP302-02。操作流程详细说明如下1.切去洋葱鳞球茎的部分腐烂组织或者病健交界处组织，放入灭菌的研钵中，加入适量的0.8%的生理盐水，充分研磨，用移液器吸取研磨液转入1mLEP管中，1500rpm3000rpm低速离心去除大的颗粒，将上清液转入另一干净的1mLEP管中，13000rpm高速离心，弃上清液，加入100μL灭菌水重悬沉淀，进行划线涂板培养；从平板培养基上挑取疑似单菌落接种至14mL的液体培养基中过夜培养。2.取14mL的过夜培养菌液，10,000rpm离心2分钟，弃上清。3.按照细菌基因组DNA提取试剂盒(购自TIANGEN公司)说明书操作提取、纯化得到菌液模板DNA。4.荧光定量PCR扩增体系和反应条件总反应体系为20μ，包括IX反应液I^remixEXTaq10μ,上游引物0.5μ(0.3uM)，下游引物0.5μ(0.3uM)，探针0.3μ(0.luM)，菌液模板DNA1μ(步骤3试剂盒提取得到)，用无DNA酶的灭菌纯化水补足至20μ。按上述的PCR反应体系配制反应体系，放入荧光定量PCR仪中进行反应，程序设置为95"C5mins，l个循环；95"C5s；60°C20s，40个循环。对待检样品进行检测时，每次试验应设阴性对照和阳性对照，反应体系中菌液模板DNA分别用阴性对照和阳性对照替代。阴性对照用于判定反应体系及整个操作过程是否受污染，阳性对照用于判定整个反应过程的有效性。5.结果判定反应结束后，根据Ct值判断反应结果，Ct值在36个循环以内判定为阳性，Ct值超过36个循环判定为阴性。其中，阴性对照Ct值应为无或至少大于36个循环，阳性对照Ct值应处于2228个循环范围内，阴性对照或阳性对照任何一个不满足要求，则整个检测过程判定为无效。实施例3检测洋葱腐烂病菌的试剂盒(I)PCR反应液由2X反应液I^remixEXTaq、引物PBAF、引物PBAR和探针组成；反应液I^remixEXTaq的终浓度为1X，引物PBAF的终浓度为0.3uM、引物PBAR的终浓度为0.3uM，探针的终浓度为0.IuM；2X反应液I^remixEXTaq购于Takara公司；引物和探针均委托iTakara公司合成，其中，引物PBAF(引物1)为序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR(引物2)为序列表SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，探针为序列表SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，探针5'端标记报告荧光染料6-Carboxyfluorescein(FAM)，3'端标记淬灭荧光染料BHQl。(2)无DNA酶的灭菌纯化水用自来水两次蒸馏，经过MilliporeMILLI-QPFPLUS纯水仪纯化，收取电阻率彡18.OMΩ.cm的水，贮于无菌瓶中。MiIlipore-Q纯化水15Ibf/in2(1.034X105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。(3)阴性对照lmLX1管；研磨无菌健康洋葱鳞球茎，用0.01mol/LpH7.2PBS缓冲盐溶液制成20%悬液，121°C灭活30min。(4)阳性对照=ImLXl管；为含有洋葱腐烂病菌ifea核糖体基因保守区序列(SEQIDN0.4)的重组质粒，Ct值为22.0沘.0。阳性对照的制备方法同实施例2。本试剂盒的使用方法同实施例2，其中待测的细菌基因组DNA可采用本领域公知技术或通过任何市售的基因组提取试剂盒获得。实施例4用实施例2的试剂盒模拟带菌种子制样液的制备及荧光定量PCR检测一.材料与方法1.材料试剂Burkholderiagladiolipv.alliicolaATCC20157，进口洋葱种子(以色列)，实施例2的试剂盒(北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心提供)。2.仪器设备SLAN荧光定量PCR仪，超净台(苏净)，培养箱(Memmert)。3.菌悬液制备培养30mLBurkholderiagladioliρv.aWiicoh菌悬液，将摇培的菌悬液进行10倍梯度倍比稀释，采用3MPetrifilm菌落总数测数片对菌悬液进行计数，每个梯度取100PL，做三个重复，将测试片置于观°C温箱中培养72h，取出计算测试片所有红色菌落的数目(不论大小和颜色深浅)，同一梯度三个重复的平均值乘以稀释度作为菌悬液的浓度。4.模拟带菌种子制样液的制备及荧光定量PCR检测(1)将摇培的菌悬液进行10倍梯度稀释至10°cfu/mL，每个梯度100mL，在每个梯度菌悬液中加入3000粒不含包衣的洋葱种子，然后放在观°C培养箱中摇培，每个梯度取1mL摇培液加入1.5mLEP管中低速离心，去除大的杂质颗粒，然后高速离心沉淀，去掉上层液体，用100PL无菌水重悬沉淀，制成菌悬液，每个梯度菌悬液各取1PL作为模板，按照实施例2试剂盒使用方法进行荧光定量PCR检测。(2)将含洋葱种子的各个梯度的菌悬液分别摇培6h、12h、24h，分别取不同时间点的摇培液进行荧光定量PCR，同时取不同时间点的摇培液各1mL进行，加入1.5mLEP管中低速离心，去除大的杂质颗粒，然后13000rpm高速离心沉淀，去掉上层液体，用100μ无菌水重悬沉淀，制成菌悬液，每个梯度菌悬液各取1PL作为模板，进行荧光定量PCR检测，以比较不同摇培时间的差别。二.结果(1)不同时间点摇培液检测结果取0h、6h、12h、24h不同时间点的摇培液1μ，按实施例2操作方法进行荧光定量PCR检测结果，各个梯度各个时间点的荧光定量PCR检测结果见图4，各个梯度各个时间点的荧光定量PCR检测Ct值见表1。从检测结果的Ct值可以看出，同一梯度不同时间点的荧光定量PCR检测Ct值基本以3个Ct左右增加，在荧光扩增效率100%的情况下，模板浓度相差十倍，则Ct值相差约3.32，建立的荧光定量PCR体系扩增效率为96.3%，也就是说大致可以判断在不同时间点菌体浓度是以十倍的比例增加。加入的摇培液为100mL，菌悬液计数结果显示摇培菌悬液浓度为1.18X108CFU/mL，也就是说梯度稀释摇培液最低含菌量为118个，从荧光定量PCR检测结果可以看出，建立的荧光定量PCR体系，能在摇培Mh后从含菌量为118个的模拟带菌种子样品中检出^zr姑οAferiagladioli炉.alliicola。权利要求1.检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测引物，其特征在于为序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列。2.检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR探针，其特征在于为序列表SEQIDNo.3的寡核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR探针，其特征在于所述探针的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团BHQ1。4.检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒含有检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测引物和检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR探针；所述检测引物为序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列，所述探针为序列表SEQIDNo.3的寡核苷酸序列，探针的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团BHQ1。5.检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于由以下组分组成(1)PCR反应液由2X反应液I^remixEXTaq、引物PBAF、引物PBAR和探针组成；其中，引物PBAF为序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR为序列表SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，探针为序列表SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，探针5'端标记报告荧光染料FAM，3‘端标记淬灭荧光染料BHQl；(2)无DNA酶的灭菌纯化水；(3)阴性对照lmLX1管；研磨无菌健康洋葱鳞球茎，用0.01mol/LpH7.2PBS缓冲盐溶液制成20%悬液，121°C灭活30min；(4)阳性对照=ImLXl管；为含有洋葱腐烂病菌ifea核糖体基因保守区序列SEQIDNO.4的重组质粒，Ct值为22.0沘.0。6.根据权利要求5所述的检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述反应液I^emixEXTaq的终浓度为1X，引物PBAF的终浓度为0.3uM、引物PBAR的终浓度为0.3uM，探针的终浓度为0.luM。7.根据权利要求5所述的检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述阳性对照的制备方法为用SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的引物序列对洋葱腐烂病菌进行PCR反应，回收PCR扩增产物，获得高纯度的138bp核糖体基因保守区序列SEQIDNo.4，与pGEM-Teasy载体进行连接，转化Ε.coliCompetentCellsDH5α感受态细胞，使用TakaraMiniBESTPlasmidPurificationKitVer2·0质粒提取试剂盒提取DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒作为阳性对照，命名为pGEM-Bga；10倍连续梯度稀释裂解液，测定Ct值，Ct值为22.0观.0者作为阳性对照。8.根据权利要求5或6或7所述的检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒还含有(5)细菌基因组DNA提取试剂盒。全文摘要本发明公开了检测洋葱腐烂病菌的核苷酸序列和试剂盒，属于植物检验检疫领域。检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测引物，为序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列。本发明的优点是通过本发明建立的实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒能够特异、灵敏、快速地检出洋葱腐烂病菌。文档编号C12Q1/68GK102230015SQ201110168198公开日2011年11月2日申请日期2011年6月21日优先权日2011年6月21日发明者吕玉峰,周琦,李子龙,李建光,梁新苗,江丽辉,汪万春,王中康,王文静,边勇,邓丛良,高文娜,黄魁建申请人:北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心