专利名称：一种生产高活性和高纯度利福霉素sv的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程和制药领域。更具体而言，本发明涉及细胞色素P450基因或转酮酶基因或它们所编码的蛋白在调控利福霉素SV转化为利福霉素B中的用途，通过生物工程方法获得的生产高活性、高纯度利福霉素SV的菌株及制备该菌株的方法，以及利用该菌株生产高活性、高纯度利福霉素SV的方法。
背景技术：
地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)是1957年从法国圣拉斐尔 (St. Raphael)附近的土样中分离出来的一种菌种，它是一种可以生成重要抗生素利福霉素的放线菌。利福霉素属于安莎类抗生素(ansamycins)，主要用于治疗由结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)禾口麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)弓I起的结核病和麻风，对肺炎球菌(Pneumococcus)及其它革兰氏阳性菌引起的各种感染也十分有效 (Lai, Khanna等，1995)。利福霉素可以结合到原核生物中依赖于DNA的RNA聚合酶上，从而特异性地抑制依赖于DNA的RNA的合成而起到抑菌的作用(Floss和Yu 2005)。最初分离的地中海拟无枝菌酸菌能够合成一组结构相关的利福霉素混合物。后来，经过一系列物理、化学方法诱变，使得地中海拟无枝菌酸菌在工业上所合成的主要组分为利福霉素B(Floss和Yu 2005)。利福霉素B的产量比较高，但其抑菌活性比较低。在发酵得到Rf_B后，再经过化学或酶学方法转化得到高活性的利福霉素SV，最后进一步得到临床用的利福平(rifampicin)或其它药用衍生物(Floss和Yu 2005)。但是，随着对利福平有抗性的细菌的快速出现，其它化学半合成衍生物如利福布汀(rifabutin)和利福喷汀(rifapentine)相继进入临床(Floss和Yu 2005)。由于这些化学半合成药物的直接前体都是利福霉素SV，所以，得到高产量高纯度的利福霉素生物合成中间产物Rf_SV，是工业生产的重要步骤。很多实验室和利福霉素生产公司利用物理或化学方法对工业生产菌株进行诱变， 得到了一些可以直接生产利福霉素SV的地中海拟无枝菌酸菌菌株。但是，这些菌株往往产量较低，容易发生回复突变，或者还夹杂着许多其它不需要的利福霉素衍生物，给下游的分离纯化带来诸多不便。为了筛选得到能够在遗传上稳定生产高纯度Rf_SV的地中海拟无枝菌酸菌菌株， 通过解析利福霉素生物合成途径，从而利用分子生物学及基因工程方法改造获得目的生产菌株，一直是科学家们努力的目标。1998年，Floss等人以3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA) 合酶基因rifK为探针克隆了地中海拟无枝菌酸菌染色体上含有利福霉素合成基因簇的一段约1001Λ DNA片段。随后，其中的大部分基因的功能被实验鉴定(Floss和Yu 2005 ；Xu, Wan 等，2005)。利福霉素的合成是以AHBA为起始单元，丙二酰辅酶AQ分子)和甲基丙二酰辅酶 A (8分子)为延伸单元合成了第一个中间体前安莎霉素X (proansamycinX)，然后，前安莎霉素X经过氧化还原、乙酰化、甲基化等多种修饰经Rf_sv并最终得到Rf_B。利福霉素合成途径如下式所示，其中利福霉素S是利福霉素SV的氧化形式，二者之间可以相互转化。
但是，对于利福霉素合成途径中的最后一步(也可能是几步)反应，即从Rf_SV到 Rf_B转化所利用的基因以及酶催化反应机理，至今不是很明了。因此，本领域仍然迫切需要对利福霉素的合成途径和所涉及的生物过程进行深入的研究，以开发出通过对菌株中特定基因的筛选或改造实现对利福霉素SV到利福霉素B 的转化的控制从而有利于可控的利福霉素生产的方法，尤其需要开发出可高效生产高纯度 Rf_SV的菌株和利用该菌株生产Rf_SV的方法。
发明内容
本发明的主要目的之一是提供参与利福霉素SV转化为利福霉素B的基因及其用途。本发明的另一主要目的正是提供一种可生产高活性、高纯度利福霉素SV的菌株，以及制备(尤其是通过基因工程方法)和筛选该菌株的方法。本发明的另一主要目的是提供一种利用该菌株生产高活性、高纯度利福霉素SV的方法。在本发明的第一方面，提供了细胞色素P450或转酮酶基因或它们所编码的蛋白的用途，其用于调控利福霉素SV向利福霉素B的转化。在一个实施方式中，所述的细胞色素P450或转酮酶基因或它们所编码的蛋白来源于产利福霉素B的菌株。在另一个实施方式中，所述细胞色素P450或转酮酶基因或它们所编码的蛋白来源于地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)。在一个优选例中，所述菌株选自ATCC 13685和ATCC 21789或S699。在另一个实施方式中，所述的细胞色素P450或转酮酶基因或它们所编码的蛋白是单独应用或组合应用的。在另一个实施方式中，所述的细胞色素P450或转酮酶基因选自下组(i)具有 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 23 和 / 或 SEQ ID NO 24 所示序列的核苷酸序列；( )与⑴中序列同源的序列；(iii)在严格条件下与(i)或(ii)限定的序列杂交、且编码细胞色素P450或转酮酶的序列；和/或(iv)核苷酸序列与(i)或(ii)有85%以上(优选90%以上)序列相同性、且编码细胞色素P450或转酮酶的序列。在本发明的一个优选例中，所述与(i)中序列同源的序列编码细胞色素P450或转酮酶。
在本发明的一个优选例中，所述基因分别为rifl5(编码转酮酶)和rifl6(编码细胞色素P450)，这两个基因的编码产物参与了 Rf_SV到Rf_B的转化。这两个基因中的任何一个基因失活或同时失活，均能使地中海拟无枝菌酸菌菌体内的Rf_SV(以及其氧化型 Rf_S)发生累积，而不能生成Rf_B。而回补这两个基因后，能够使利福霉素SV转化到B的
表型恢复。在本发明的一个优选例中，所述同源的序列来自产利福霉素B的菌株，优选地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)。在一个优选例中，所述菌株选自ATCC 13685 和 ATCC 21789 或 S699。在另一个实施方式中，在本发明的用途中，通过分别或同时抑制细胞色素P450或转酮酶基因或其同源基因表达或抑制它们所编码的蛋白，阻断利福霉素SV转化为利福霉素B。在一个优选实施例中，产生Rf_B的地中海拟无枝菌酸菌中，rif 15和/或rif 16基因的失活能引起利福霉素SV到利福霉素B合成途径的阻断。在一个优选例中，所述抑制是通过基因敲除、基因置换、基因沉默、RNA干扰或点突变实现的。在另一优选例中，所述抑制是使得产利福霉素B的地中海拟无枝菌酸菌中rifl6 基因所编码的蛋白质中第84位的R突变为W，例如使得ATCC13685和ATCC 21789或S699 中rif 16基因所编码的蛋白质中第84位的R突变为W。在另一个实施方式中，分别或同时增强细胞色素P450或转酮酶基因或它们的同源基因的表达或增强它们所编码的蛋白的功能，使利福霉素SV转化为利福霉素B。在一个优选例中，所述增强是通过选自下组的方法实现的插入或过表达。在一个优选实施例中，在产生Rf_B的地中海拟无枝菌酸菌中，通过rif 15和/或 rifl6的基因回补能够使利福霉素SV转化到B的表型恢复。在本发明的第二方面中，提供了一种生产利福霉素SV或利福霉素S的菌株，其特征在于，所述菌株中的细胞色素P450基因和/或转酮酶基因失活或其所编码的酶失活，条件是所述菌株不是保藏号为CGMCC 4. 5720的地中海拟无枝菌酸菌。在一个优选例中，所述菌株所产生的利福霉素B的量至多为利福霉素SV产量的 50%、40%、30%、20%、10%，或甚至为 O。在另一个优选例中，所述菌株所产生的利福霉素SV可用于合成以利福霉素SV为前体的抗生素，所述抗生素可为选自下组中的一种或多种利福布汀、利福喷汀、利福平或利福霉素B。在本发明的一个实施方式中，所述细胞色素P450基因和/或转酮酶基因选自下组⑴具有 SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :23 和 / 或 SEQ ID NO 24 所示序列的核苷酸序列；(ii)与(i)中序列同源的序列；(iii)在严格条件下与(i)或(ii)限定的序列杂交、且编码细胞色素P450或转酮酶的序列；和/或(iv)核苷酸序列与(i)或(ii)有 85%以上(优选90%以上)序列相同性、且编码细胞色素P450或转酮酶的序列。在本发明的另一个实施方式中，所述菌株是天然的菌株或是经遗传工程改造的菌株。在一个优选例中，所述遗传工程改造通过选自下组的方法进行基因敲除、基因置换、基因沉默、RNA干扰或点突变。在本发明的另一个实施方式中，所述菌株是产利福霉素的地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)或由产利福霉素的地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)经遗传工程改造而得。在一个优选例中，所述产利福霉素的地中海拟无枝菌酸菌选自ATCC 21789、ATCC 13685 或 S699，更优选 ATCC 21789。在本发明的第三方面中，提供了一种获得生产利福霉素SV或利福霉素S的菌株的方法，所述方法包括步骤(a)提供生产利福霉素的菌株；(b)使得所述菌株中的细胞色素 P450基因和/或转酮酶基因失活或其所编码的酶失活。在本发明的一个实施方式中，所述失活是通过选自下组的遗传工程改造实现的 基因敲除、基因置换、基因沉默、RNA干扰、点突变。在一个优选例中，所述生产利福霉素的菌株是生产利福霉素B的菌株，优选产利福霉素的地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)，更优选ATCC21789、ATCC 13685 或 S699。在本发明的第四方面中，提供了一种筛选生产利福霉素SV或利福霉素S的菌株的方法，所述方法包括(a')提供生产利福霉素的菌株；(b')对所述菌株的细胞色素P450 基因和/或转酮酶基因进行检测，或对其所编码的酶的活性进行测定，如果所述菌株中没有细胞色素P450基因和/或转酮酶基因或其所编码的酶的活性，或该活性显著低于生产利福霉素B的阳性对照菌株，则表明该菌株可用于生产利福霉素SV。在本发明的一个实施方式中，所述基因的检测是通过选自下组的方法测定的PCR 测序或Southern杂交。在一个优选例中，所述生产利福霉素B的阳性对照菌株选自ATCC 21789、ATCC 13685 或 S699。在本发明的第四方面中，提供了一种生产利福霉素SV、利福霉素S或以它们的衍生物的方法，所述方法包括A)提供本发明的菌株、用本发明的方法产生的菌株、或用本发明方法筛选得到的菌株；B)用所述菌株生产利福霉素SV或利福霉素S ；以及C)任选地，用步骤B)所得的利福霉素SV或利福霉素S进一步生产选自下组的利福霉素衍生物。在一个优选例中，所述利福霉素SV或利福霉素S的衍生物选自利福布汀、利福喷汀、利福平或利福霉素B。在另一个优选例中，所述生产包括接种、发酵、萃取、浓缩等步骤。 在另一个优选例中，所述方法还包括根据菌株的稳定性和产量进行菌株的进一步选择。本发明的其它方面中涉及一种制备高活性利福霉素SV的方法，该方法包括对产利福霉素B的地中海拟无枝菌酸菌菌株中rifl5和/或rifl6基因，或与其高度同源且具有相同或相似功能的同源基因(相同性至少为30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95% 或99% )进行操作，使所述rif 15和/或rif 16基因或所述同源基因失活，得到突变的菌株，该突变菌株即为生产利福霉素Rf_SV的菌株。在一个优选实施例中，所述菌株选自生产利福霉素B的地中海拟无枝菌酸菌。在一个优选实施例中，将所述rifl5和/或rifl6基因或与其高度同源的基因失活，得到突变的菌株。在一个优选实施例中，所述方法还包括步骤培养所述突变菌株，鉴定其产生利福霉素SV的能力，筛选出进一步高产量，高纯度利福霉素SV的菌株。本发明又一方面涉及一种采用本发明所述的方法制得的菌株，它选自地中海拟无枝菌酸菌，其中，该菌株包含rif 15和/或rif 16基因或与其高度同源的基因，rif 15和/或 rifl6基因或与其高度同源的基因已失活。本发明的另一方面涉及一种制备利福霉素B的方法，该方法包括在产利福霉素SV的地中海拟无枝菌酸菌菌株中，回补产利福霉素B的地中海拟无枝菌酸菌菌株中的 rifl5和/或rif 16基因，或与其高度同源的基因(相同性至少为30%、40%、50 %、60%、 70%、80%、90%、95%或99%)，使所述1^打5和/或1^打6基因或与其高度同源的基因产生功能，得到突变的菌株，该突变菌株即为生产利福霉素Rf_B的菌株。在一个优选实施例中，所述菌株选自生产利福霉素SV的地中海拟无枝菌酸菌。在一个优选实施例中，将所述rif 15和/或rif 16基因或与其高度同源的基因回补，得到突变的菌株。在一个优选实施例中，所述方法还包括步骤培养所述突变菌株，鉴定其产生利福霉素B的能力，筛选出进一步高产量，高纯度利福霉素B的菌株。本发明又一方面涉及一种采用本发明所述的方法制得的菌株，它选自地中海拟无枝菌酸菌，其中，该菌株包含rif 15 和/或rifl6基因或与其高度同源的基因。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1 地中海拟无枝菌酸菌ATCC 21789染色体上rif 15突变体初筛PCR鉴定图。泳道1为11Λ分子量标记，泳道2-8为挑取的rifl5突变体克隆1_7，泳道9为阴性对照(未加DNA模板)，泳道10为阳性对照。图2 :rifl5基因失活和失活后回补对利福霉素Rf_B和Rf_SV生产的影响。图2A为ATCC 21789发酵液的BPC图谱分析，2B为ATCC 21789 rif 15突变体(图 1中的克隆1)发酵液的BPC图谱分析，2C为rif 15突变体克隆1转入空质粒pDXM4的菌株发酵液的BPC图谱分析，而2D为rif 15突变体克隆1回补菌株发酵液的BPC图谱分析。图3 地中海拟无枝菌酸菌ATCC 21789染色体上rif 16突变体初筛PCR鉴定图。泳道1为Ikb分子量标记，泳道2-16为挑取的rif 16突变体克隆1，1，2，2，3，3， 4，4，5，5，6，6，7，7，8，泳道17为阴性对照(未加DNA模板)，泳道18为阳性对照(基因组 DNA)。图4 :rifl6基因的失活和失活后回补对利福霉素Rf_B和Rf_SV生产的影响。图4A为ATCC 21789发酵液的BPC图谱分析，图4B为rif 16基因失活后(图3中的克隆2)的地中海拟无枝菌酸菌ATCC 21789发酵液乙酸乙酯萃取液的BPC图谱分析。图 4C为rif 16突变体转入空质粒pDXM4的菌株发酵液的BPC图谱分析，而图4D为rif 16突变体克隆2回补了 rifl6的菌株发酵液的BPC图谱分析。图 5 :5a 为 rif 基因簇的缩略图，5b 是 ATCC 13685，ATCC 21789，S699 和 U32 中 P450的蛋白序列比对图(右上)，以及各个菌株的产利福霉素表型ATCC13685野生型， ATCC 21789 野生型；U32 野生型；U32 (pDXM4_P450) ；U32 (转空质粒 pDXM4)。图6:图6a为在培养基加安普霉素抗生素(6a中虚线)或者不加安普霉素抗生素(6a中实线)的产利福霉素表型。图6b为pDXM4-P450质粒在不同培养基中的丢失情况。直条形柱代表U32(pDXM4-P450)培养基中未添加安普霉素抗生素，波浪形柱代表 U32 (pDXM4-P450)培养基中添加安普霉素。图7 用Swiss-PdbViewer模拟的U32中P450的三维结构。球棒模式表示的氨基酸为Rifl6 R84位氨基酸(Arg或Trp)，该SNP位点恰好在一个β折叠的末尾，推测为结合底物的口袋口部。图8 :S699、U32、ATCC13685和ATCC 21789氨基酸序列比对图。将地中海拟无枝菌酸菌菌株S699、U32、ATCC 13685,ATCC 21789的细胞色素P450蛋白的氨基酸序列用CLUST 软件相互做比对(Alignment)。可以看到U32与其它三者在84位氨基酸不同(R84W)；但在 295位处，U32只与S699不同(G^5E)，而与其它两者ATCC 13685,ATCC 21789 —致。故我们可以推测R84W的变化影响了 U32菌株中利福霉素SV向利福霉素B的转化。注意U32的起始密码子预测比S699等提前了 31个氨基酸，这并不影响其蛋白的真实表达情况。
图9 利福霉素的合成途径。
发明内容
本发明人通过长期而深入的研究发现细胞色素P450基因(如rifl6)和/或转酮酶基因(如rifl5)的活性对由利福霉素SV向利福霉素B的转化有决定性的作用，利用这些关键基因的失活可获得用于高效制备高纯度利福霉素SV的菌株，或利用对这些关键基因活性的测定可筛选可用于高效制备高纯度利福霉素SV的菌株，也可利用这些关键基因的回补使产利福霉素SV的菌株转化为产利福霉素B的菌株。在此基础上，本发明人提供了细胞色素P450基因(如rifl6)和/或转酮酶基因(如rif 15)及其编码蛋白的用途，包括这两个基因分别或同时失活，阻断利福霉素SV转化为利福霉素B，以及这两个基因的回补使利福霉素SV进一步转化为利福霉素B。另外，发明人还提供了生产高活性和高纯度利福霉素SV的菌株、其制备和筛选方法，以及利用该菌株制备高活性和高纯度利福霉素SV 的方法，从而完成了本发明。具体而言，本发明人通过失活参与利福霉素SV到利福霉素B的转化过程的两个关键酶的基因(尤其是基因rif 15和/或rif 16)，使Rf_SV到Rf_B合成途径发生阻断，从而实现高活性利福霉素Rf_SV的产量得到提高，并使得发酵产物的组分得到纯化。rifl6基因是本发明人在对一株产利福霉素Rf_SV的地中海拟无枝菌酸菌菌株 U32的全基因组测序后，与三株野生型产利福霉素B的菌株进行序列比对分析的过程中发现的。将地中海拟无枝菌酸菌菌株S699、U32、ATCC 13685、ATCC 21789的细胞色素P450蛋白的氨基酸序列用CLUST软件相互做比对。研究表明编码细胞色素P450的rif 16基因中的1个位点在U32里是W(84位氨基酸，其编码序列为tgg)，而在ATCC 13685和ATCC 21789 及S699里均为R(其编码序列为egg表1)。但在295位处，U32只与S699不同(G295E)， 而与其它两者ATCC 13685, ATCC 21789 —致。(注意U32的起始密码子预测比S699等提前了 31个氨基酸，这并不影响其蛋白的真实表达情况)由此发明人认为rif 16基因在U32里的突变极有可能是引起Rf_SV到Rf_B阻断的关键原因。故发明人在U32中回补含野生型ATCC 21789 rifl6基因的质粒(pDXM4_P450)， 同时用空质粒作对照，发现在rif 16回补株可大量产生利福霉素B，而空质粒株的发酵液中仍然只有利福霉素SV以及其氧化型Rf_S，没有Rf_B的产生(图5)。这证明了 rif 16在 Rf_SV到Rf_B的转化中起到关键作用。
发明人进一步通过回补质粒pDXM4-P450的稳定性对不同利福霉素衍生物产量的影响进行了研究。结果发现，随着回补质粒PDXM4-P450的丢失，发酵液中的Rf_SV和Rf_S 迅速累积(图6)。从而，从另一角度验证了 rifl6在Rf_SV到Rf_B的转化中起作用。同时，发明人还对产利福霉素B的野生型ATCC 21789中rifl6基因进行中断突变，发现利福霉素B不再合成，进一步回补试验发现，回补菌株恢复了利福霉素Rf_B的生产，而检测不到任何Rf_SV的产生(图4)，这表明rifl6基因确实在利福霉素SV到B的转化中不仅非常重要，而且起到了必要作用。经研究发现rifl6编码的P450蛋白为胞质蛋白，没有过膜区，而U32中的SNP位点恰好在一个β折叠的末尾且位于Ρ450的活性口袋周围，这就提示了它重要的位阻作用 (图 7)。发明人进一步对ATCC 21789中编码转酮酶的rif 15基因进行敲除。结果发现，此转酮酶的失活和回补能产生和P450失活和回补相同的表型(图幻。证明rifl5的功能对于从Rf_SV到Rf_B的转化也是必需的。由此，本发明人确定了由利福霉素SV向利福霉素B的转化中的关键基因，即细胞色素P450基因(如rif 16)和/或转酮酶基因(如rif 15)，并通过对这些基因的活性的调控和筛选成功获得了高产高纯度利福霉素SV的菌株，从而可用于工业生产。细胞饩素P450基因和转酮酶基因如本文所用，术语“细胞色素P450基因”或“rifl6基因”可互换使用，均是指产利福霉素菌中编码细胞色素P450的基因，其优选具有SEQ ID N0:2(例如ATCC 21789或ATCC 13685中所具有的相同的rifl6基因)或SEQ ID NO J4所示(例如S699中的rif 16基因)的ORF序列、或可与该序列高度同源(例如同源性至少为50%、60%、70%、80%、90%、 95% )、或可为在严格条件下与所述基因序列杂交的分子或与上述分子高度同源的家族基因分子，该基因的表达受到抑制可阻碍利福霉素SV向利福霉素B的转化，从而可用于高效生产高纯度的利福霉素SV，而该基因的回补可促使产利福霉素SV的菌株产生利福霉素B。如本文所用，术语“转酮酶基因”或“rif 15基因”可互换使用，均是指产利福霉素菌中编码转酮酶的基因，其优选具有SEQ ID N0:1所示(例如ATCC21789或ATCC 13685中所具有的相同的rif 15基因)或SEQ ID NO :23所示(例如S699中的rif 15基因)的ORF序列、或可与该序列高度同源(例如同源性至少为50%,60%,70%,80%,90%,95%,98%, 99%，或这些数值之间的任何区间)、或可为在严格条件下与所述基因序列杂交的分子或与上述分子高度同源的家族基因分子，该基因的表达受到抑制可阻碍利福霉素SV向利福霉素B的转化，从而可用于高效生产高纯度的利福霉素SV，而该基因的回补可促使产利福霉素SV的菌株产生利福霉素B。如本文所用，术语“严格条件”是指⑴在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0. 2XSSC，0. SDS，60°C;或⑵杂交时加有变性剂，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 1% 小牛血清/0. Ficoll，42°C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%，优选 55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上时才发生杂交。例如，在严格条件下与某特定序列杂交的序列可为所述特定序列的互补序列。本发明的基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成等常规方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。应理解，本发明的细胞色素P450基因和转酮酶基因优选是产利福霉素B的地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)的基因，获自其它产利福霉素B菌类的与地中海拟无枝菌酸菌高度同源(如具有50%以上，优选55%以上、60%以上、65%以上、70% 以上、75%以上、80%以上，更优选85%以上如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。基于本发明所揭示的rifl5和rifl6基因对利福霉素SV转化为利福霉素B的调控作用，本领域普通技术人员很容易理解与本方面中所揭示的具体rifl5基因(即编码转酮酶的基因)和rif 16基因(即编码细胞色素P450的基因)同源的序列，尤其是产利福霉素B的地中海拟无枝菌酸菌中的同源序列也具有同样的功能，即具有调控利福霉素SV转化为利福霉素B的作用，只要这些同源序列在所述地中海拟无枝菌酸菌中负责编码转酮酶或细胞色素P450。基因的失活及其失活菌株的鉴定如本文所用，术语“失活”是指细胞色素P450基因和/或转酮酶基因不能正常表达出其所对应的酶或表达的酶量或酶活性显著降低。术语“失活菌株”是指不能正常表达细胞色素P450基因和/或转酮酶或所表达的相应酶量或酶活性显著降低的菌株。例如，在采用遗传工程改造菌株时，经遗传工程改造的菌株中细胞色素P450基因和/或转酮酶基因表达量或所表达的酶的活性与未经改造的菌株相比降低了 70%、80%、 90%、95%、98%、99%，甚至 100%。可采用本领域现有技术已知的方法使相关基因失活，例如可采用相关基因敲除、 基因置换、基因沉默、RNA干扰、或使其发生突变(优选基因敲除、点突变)等方法。例如， 可利用DNA同源重组的方法，构建相关基因中断载体，将目的基因敲除(丁晓明等，利用同源重组建立地中海拟无枝菌酸菌U32染色体的基因置换/中断系统，生物工程学报，2002， 18(4) :431-437)。可采用本领域现有技术已知的方法来判断基因是否已失活，例如用Southern杂交或用PCR扩增的方法来检验目的基因是否突变；利用HPLC-MS检测突变株的表型变化 (如，利福霉素的组分变化)的方法或通过相关生理生化实验来判断突变的基因是否失活。本发明提供了一种可以生产高活性利福霉素SV的菌株，该菌株中rifl5和/或 rifl6基因或与其高度同源的基因已失活。该菌株是可以产Rf_B的地中海拟无枝菌酸菌 (Amycolatopsis mediterranei)或由其经遗传工程改造获得。本发明还提供了一种可以生产利福霉素B的菌株，该菌株是由产利福霉素SV的菌株中插入rif 15和/或rif 16基因或与其高度同源的基因，而且该基因及其编码的细胞色素P450基因和/或转酮酶具有正常功能。优选地，该菌株是由可以产Rf_SV的地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)经遗传工程改造获得。本领域技术人员可采用现有技术公开的知识筛选失活菌株。例如在构建中断载体的时候引入抗性基因，用中断载体中断相关基因。利用含有抗性的培养基来筛选基因失活菌株，并用上述验证基因失活的方法对所筛选的菌株进行验证。测定菌株生产抗生素的能力的方法可用HPLC-MS分析。失活菌株的培养和利用在制备或筛选得到细胞色素P450基因和/或转酮酶基因失活菌株后，可在本领域常规使用的条件下培养和扩增所得的菌株，例如，地中海拟无枝菌酸菌可在26 V -30°C用本氏固体或液体培养基培养(Wang W等，2002)。本发明还提供了利用失活菌株高效制备高纯度利福霉素SV或以其为前体的非利福霉素B抗生素的方法。术语“以利福霉素SV为前体的非利福霉素B抗生素”或“利福霉素SV的衍生物”是指在工业生产上需首先制得利福霉素SV，然后以利福霉素SV为前体进行进一步合成的抗生素，例如利福布汀、利福喷汀或利福平。可在工业条件下，利用制得或筛选得到的失活菌株进行利福霉素SV的生产，例如通过发酵等工艺。可进一步利用所制得的利福霉素SV生产以利福霉素SV为前体的非利福霉素B抗生素，例如利福布汀、利福喷汀或利福平。本领域普通技术人员可根据常识对培养和生产条件进行选择和优化。回补菌株或活件增强菌株的培养和利用如本文所用，术语“活性增强”是指过细胞色素P450基因和/或转酮酶基因的表达活性提高或表达的酶量或酶活性显著增强。术语“活性增强菌株”是指过细胞色素P450 基因和/或转酮酶基因表达活性提高或所表达的相应酶量或酶活性显著提高的菌株。例如，在采用遗传工程改造菌株时，经遗传工程改造的菌株中细胞色素P450基因和/或转酮酶基因表达量或所表达的酶的活性与未经改造的菌株相比提高了 50%、60%、 70^^80^^85%,90%或以上。可采用本领域现有技术已知的方法使相关基因活性增强，例如可采用插入或过表达等方式。可采用本领域现有技术已知的方法来判断基因或酶活性是否增强，例如利用HPLC-MS检测菌株的表型变化。在制备得到细胞色素P450基因和/或转酮酶基因回补菌株或活性增强菌株后， 可在本领域常规使用的条件下培养和扩增所得的菌株，例如，地中海拟无枝菌酸菌可在 260C _30°C用本氏固体或液体培养基培养(Wang W等，2002)。本发明还提供了利用回补菌株或活性增强菌株制备利福霉素B或将利福霉素B转化为利福霉素SV及以其为前体的非利福霉素B抗生素的方法。术语“以利福霉素SV为前体的非利福霉素B抗生素”是指在工业生产上需首先制得利福霉素SV，然后以利福霉素SV 为前体进行进一步合成的抗生素。可在工业条件下，利用制得的回补菌株或活性增强菌株进行利福霉素B的生产， 例如通过发酵等工艺。可进一步利用所制得的利福霉素B转化为利福霉素SV并生产以利福霉素SV为前体的非利福霉素B抗生素，例如利福布汀、利福喷汀和利福平。本领域普通技术人员可根据常识对培养和生产条件进行选择和优化。本发明的优点本发明具有如下的主要优点(1)明确了产利福霉素菌中细胞色素P450基因和转酮酶基因及其编码的酶与利福霉素SV到利福霉素B的转化之间的关系，从而为高效生产高活力、高纯度利福霉素SV或利福霉素B提供了一种新的方法；(2)提供了可高效生产高活力、高纯度利福霉素SV的菌株及其制备或筛选方法， 为利福霉素SV及其下游产品(如利福布汀、利福喷汀或利福平)的生产和加工提供了有力保障；(3)为利福霉素合成途径的进一步研究提供了新的思路。应理解，本发明的优点并不限于上述所列举的主要优点，本领域普通技术人员基于说明书的描述可理解和知晓本发明的其它优点。
实施例下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，涉及DNA的操作参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)；涉及染色体总 DNA 的提取参考文献(D. A. Hopwood, M. J. Bibb, K. F. Chater 等，Genetic Manipulation of Srteptomyces. ALaboratory Manual. England :John Innes Foundation Press, 1985.)，或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。方法与材料菌株及其培养在实验中使用到的地中海拟无枝菌酸菌U32[保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国北京，CGMCC)，保藏号CGMCC 4. 5720，保藏日期2010年2月10 日]；ATCC13685 和 ATCC 21789 购自 ATCC0地中海拟无枝菌酸菌的培养采用本氏培养基(Bermet Medium, Wang W等，2002)； 大肠杆菌培养用LB培养基。培养基中所添加抗生素的终浓度为氨苄青霉素ΙΟΟμ g/ml， 安普霉素 apramycin 30 μ g/ml，红霉素 200 μ g/ml。发酵萃取地中海拟无枝菌酸菌发酵液萃取方法参照(Xu，Wan等，2005)。工具酶及分子量标记实验中使用到的限制性内切酶、T4DNA连接酶、RNase A、Klenow酶、11Λ DNA分子量标记物为MBI公司产品，高保真DNA聚合酶KOD-plus为Tc^oBo公司产品。实施例1 产利福霉素Rf_SV菌株U32的全基因组测序及其与产利福霉素B菌株的序列比对rifl6基因是本发明人在对一株产利福霉素Rf_SV的地中海拟无枝菌酸菌菌株 U32的全基因组测序后，与三株野生型产利福霉素B的菌株进行序列比对分析的过程中发现的。具体而言利用第二代妨4测序仪，结合SOLID，Sanger测序方法，以及6- 质粒文库、 fosmid文库构建，最终得到error值小于0. 5/100，000的10，236，715bp的地中海拟无枝菌酸菌U32的全基因序列。BLASTP注释得到利福霉素合成基因簇rif后，与Floss研究的产Rf_B菌株S699的rif合成基因簇进行比对。发明人发现了 41个SNP，8个INDEL位点， 它们一共影响了 13个编码蛋白和2个基因的启动子区域(表1)。通过文献查询和功能分析，初步确定可能与Rf_SV到Rf_B的转化有关的候选基因。表1.地中海拟无枝菌酸菌U32与S699、ATCC13685和ATCC 21789的比较
权利要求
1.一种生产利福霉素SV或利福霉素S的菌株，其特征在于，所述菌株中的细胞色素P450基因和/或转酮酶基因失活或其所编码的酶失活，条件是所述菌株不是保藏号为 CGMCC 4. 5720的地中海拟无枝菌酸菌。
2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述细胞色素P450基因和/或转酮酶基因选自下组(i)具有 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 23 和 / 或 SEQ ID NO 24 所示序列的核苷酸序列；( )与(i)中序列同源的序列；(iii)在严格条件下与(i)或(ii)限定的序列杂交、且编码细胞色素P450或转酮酶的序列；和/或(iv)核苷酸序列与(i)或(ii)有85%以上序列相同性、且编码细胞色素P450或转酮酶的序列。
3.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株是天然的菌株或是经遗传工程改造的菌株。
4.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株是产利福霉素的地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)或由产利福霉素的地中海拟无枝菌酸菌 (Amycolatopsis mediterranei)经遗传工禾呈改造而得。
5.如权利要求3所述的菌株，其特征在于，所述遗传工程改造通过选自下组的方法进行基因敲除、基因置换、基因沉默、RNA干扰或点突变。
6.一种获得生产利福霉素SV或利福霉素S的菌株的方法，所述方法包括步骤(a)提供生产利福霉素的菌株；(b)使得所述菌株中的细胞色素P450基因和/或转酮酶基因失活或其所编码的酶失活。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述失活是通过选自下组的遗传工程改造实现的基因敲除、基因置换、基因沉默、RNA干扰、点突变。
8.一种筛选生产利福霉素SV或利福霉素S的菌株的方法，所述方法包括(a')提供生产利福霉素的菌株；(b')对所述菌株的细胞色素P450基因和/或转酮酶基因进行检测，或对其所编码的酶的活性进行测定，如果所述菌株中没有细胞色素P450基因和/或转酮酶基因或其所编码的酶的活性，或该活性显著低于生产利福霉素B的阳性对照菌株，则表明该菌株可用于生产利福霉素SV。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述基因的检测是通过选自下组的方法测定的PCR测序或Southern杂交。
10.一种生产利福霉素SV、利福霉素S或以其衍生物的方法，所述方法包括A)提供权利要求1-5中任一项所述的菌株、用权利要求6-7中任一项所述的方法产生的菌株、或用权利要求8-9中任一项所述的方法筛选得到的菌株；B)用所述菌株生产利福霉素SV或利福霉素S；以及C)任选地，用步骤B)所得的利福霉素SV或利福霉素S进一步生产选自下组的利福霉素衍生物利福布汀、利福喷汀或利福平。
11.细胞色素P450基因或转酮酶基因或它们所编码的蛋白的用途，其用于调控利福霉素SV转化为利福霉素B。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的细胞色素P450或转酮酶基因或它们所编码的蛋白来源于地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei) 0
13.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的细胞色素P450基因或转酮酶基因或它们所编码的蛋白来自产利福霉素B的菌株。
14.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的细胞色素P450或转酮酶基因或它们所编码的蛋白是单独应用或组合应用的。
15.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的细胞色素P450或转酮酶基因选自下组(i)具有 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 23 和 / 或 SEQ ID NO 24 所示序列的核苷酸序列；( )与(i)中序列同源的序列；(iii)在严格条件下与(i)或(ii)限定的序列杂交、且编码细胞色素P450或转酮酶的序列；和/或(iv)核苷酸序列与(i)或(ii)有85%以上序列相同性、且编码细胞色素P450或转酮酶的序列。
16.如权利要求11所述的用途，其特征在于，在所述用途中，通过分别或同时抑制细胞色素P450或转酮酶基因或其同源基因表达或抑制它们所编码的蛋白，阻断利福霉素SV转化为利福霉素B。
17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述抑制是通过基因敲除、基因置换、基因沉默、RNA干扰、点突变或蛋白抑制剂实现的。
18.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述抑制是使得产利福霉素B的地中海拟无枝菌酸菌中rifl6基因所编码的蛋白质中第84位的R突变为W。
19.如权利要求11所述的用途，其特征在于，分别或同时增强细胞色素P450或转酮酶基因或它们的同源基因的表达或增强它们所编码的蛋白的功能，使利福霉素SV转化为利福霉素B。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述增强是通过选自下组的方法实现的 插入或过表达。
全文摘要
本发明涉及一种生产高活性和高纯度利福霉素SV(rifamyicn SV，Rf_SV)的方法。本发明具体涉及细胞色素P450基因或转酮酶基因或它们所编码的蛋白在用于调控利福霉素SV转化为利福霉素B中的用途。本发明的方法通过失活利福霉素B(rifamyicn B，Rf_B)生产菌株内参与利福霉素合成途径中Rf_SV转化为Rf_B所需的两个(Rif15和Rif16)或者其中一个关键酶，得到高活性和高纯度的利福霉素SV。
文档编号C12N15/09GK102286398SQ201110168410
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月21日 优先权日2010年6月21日
发明者袁华, 覃重军, 赵国屏, 赵维, 钟怡 申请人:中国科学院上海生命科学研究院