专利名称：一种促进微生物发酵生产1，3-丙二醇的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，主要涉及ー种促进微生物发酵生产1，3_丙ニ醇的方法。
背景技术：
1，3_丙ニ醇(l，3-Propanediol，PD0)主要用于生产性能优异的新型聚酯PTT(Polytrimethylene Terephthalate)。PTT既具有PET的化学稳定性，又具有尼龙的良好弹性回复性能和抗污染性。随着低成本1，3_丙ニ醇生产エ艺的开发，PTT在纺织品领域拥有广阔的应用前景。另外，1，3_丙ニ醇还是ー种重要的化工原料和医药中间体，在聚酯纤维生产以及聚氨基甲酸こ酯和环状化合物的制造中具有广泛的应用，可替代こニ醇生产其它聚酷(如聚萘ニ甲酸丙ニ醇，PTN)、制备新型聚氨酯(包括发泡产品、弾性体、粘合剂等)、防冻液、乳化剂等精细化工产品。由它合成的聚酯有独特的性质和优异的性能，而且可以使聚酯 塑料具有易于自然循环的可生物降解特性。近年来，作为重要的有机合成原料和中间体，因其独特性能以及广泛的用途成为研究开发的热点。1,3-丙ニ醇エ业生产方法主要有化学法和生物法两大类。化学法包括以丙烯醛为原料，经水合、加氢的丙烯醛水合エ艺和以环氧こ烷(EO)为原料，经氢甲酰化、再加氢的环氧こ烷氢甲酰化工艺。生物法是目前研究的热点，根据原料不同可分为葡萄糖一步转化法和甘油转化法。生物法虽然起步较早，但是直到二十世纪八十年代才逐渐引起人们的重视。尽管目前的主要方法仍然是化学法，但是与化学法相比，微生物转化法具有条件温和、操作简便、选择性好、节省能源、设备投资少和环境良好等特点，是ー种生产成本最低、污染最少的方法，符合当今“绿色化工”和“可持续性发展”的要求。通过微生物发酵生产1，3_丙ニ醇的生产エ艺主要分为两类以葡萄糖为原料利用基因工程菌转化生产1，3-丙ニ醇及以甘油为原料利用克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae)、弗氏朽1 樣杆菌(Citrobacter freundii)、成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)、丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)和巴氏梭状芽孢杆菌(Clostridium pasteuianu)等细菌转化生产1,3-丙ニ醇。生物法生产1，3-丙ニ醇，目前存在产物浓度低、生产周期长和甘油转化率低等问题，直接影响生物法生产1，3_丙ニ醇的规模化应用。解决上述问题，既可以通过生物化工上游技术，利用基因工程等技术手段，对发酵菌种加以改造，以提高菌种的发酵水平、产物的转化能力，也可以在生物发酵阶段，连续、分批补料、反应分离相耦合的培养方式，优化发酵条件，提高发酵水平。CNOl117282. 7公开了ー种微生物微氧发酵生产1，3_丙ニ醇的方法，其所使用的微生物细胞不仅在厌氧条件下，而且在微氧条件下都能将甘油转化为1，3-丙ニ醇。其优点是发酵エ艺简单经济，既简化了操作条件，降低了生产成本，又缩短了发酵时间，提高了生产效率，而且微氧条件下发酵液中1，3-丙ニ醇的浓度与厌氧发酵相当或略高ー些，为微生物发酵法生产1，3-丙ニ醇的エ业化提供了简单经济的发酵エ艺。但是，微氧发酵的方法对于兼性厌氧微生物来说，促进效应具有局限性，仅对菌体生长阶段具有増益作用。而对于以甘油为底物，发酵生产1，3-丙ニ醇这一代谢过程而言，是ー个严格的还原反应，因此微氧条件并不利于底物甘油的转化及产物1，3_丙ニ醇的积累。CN03119280. 7公开了ー种采用两段双底物集成发酵生产1，3_丙ニ醇的方法，其ニ级种子培养是以葡萄糖和甘油为混合双底物，将耗氧条件下的ニ级种子培养和厌氧条件下的甘油厌氧转化集成在同一个发酵罐中进行。该方法能够减少エ艺步骤，提高设备的利用率，缩短了エ艺周期。虽然空气的通入有利于兼性厌氧菌种生物量的积累，但是底物中引入的葡萄糖，葡萄糖代谢产物会影响到甘油发酵生产1，3-丙ニ醇的反应，以致影响最终1，3_丙ニ醇的产率。CN200510047540. 6公开了ー种微生物利用甘油厌氧发酵生产1，3_丙ニ醇的方法，其特征在于通过在发酵培养基中或在菌体生长的指数期添加适量的有机中间代谢成分，实现了 1，3_丙ニ醇发酵过程中底物与产物间理想的通量分布，进而实现高效的1，3_丙ニ醇发酵。虽然优化培养基中添加营养条件可以对菌体生长及发酵水平起到改善作用，但是很多营养分子的摄入完全取决于生物代谢的需求，诸如TCA循环中的有机中间分子在厌氧途径中需求量并不大，其促进发酵的效果并不明显。 上述方法虽然能够起到简化流程、缩短培养周期等优点，但是以上方法对于促进甘油的的转化、提高1，3-丙ニ醇的生产效率等方面作用效果不明显。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种促进微生物发酵生产1，3_丙ニ醇的方法。该方法能够有效促进甘油的转化，大幅提高最终产物中1，3_丙ニ醇的浓度。本发明ー种促进微生物发酵生产1，3-丙ニ醇的方法，包括种子液培养过程和发酵过程，所述发酵过程使用的发酵培养基中含有浓度为O. lg/L O. 4g/L丙酮酸和/或α -酮戊ニ酸，发酵过程依次分为微氧发酵和厌氧发酵，当光密度OD值大于7时由微氧发酵转变为厌氧发酵(通过浊度法測量发酵罐中菌体浓度，根据所测的OD值与细胞浓度成正比的关系，以OD值判断发酵罐中菌体浓度)。本发明方法中种子液的培养过程如下将菌种保藏液与种子培养基按体积I :100 I :500比例混合于培养反应器内，培养温度为30°C 40°C，搅拌速度为IOOrpm 400rpm, pH控制在6 8之间，种子培养过程中保持厌氧或微氧条件。本发明方法中发酵过程如下以甘油为底物发酵，种子液体积和发酵培养基体积按I :10 I 20比例在生物反应器内混合，培养温度为30°C 40°C，搅拌速度为200rpm 500rpm, pH控制在6 8之间。本发明方法中，微氧发酵时通入流速为O. Ivvm O. 5vvm的空气；厌氧发酵时通入流速为2 vvm 4vvm的氮气。本发明方法中，发酵初始甘油底物浓度控制在25g/L 45g/L ;发酵过程中，可以通过流加形式补充甘油，使发酵体系中甘油浓度控制在25g/L 45g/L。本发明方法中，转化1，3_丙ニ醇的微生物主要为兼性厌氧菌，如克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏梓樣杆菌(Citrobacter freundii)等。与现有技术相比，本发明ー种促进微生物发酵生产1，3_丙ニ醇的方法具有如下优点I、本发明方法中通过在发酵培养基中加入丙酮酸和/或α -酮戊ニ酸，并将发酵过程适宜的分为微氧和厌氧两阶段，提高了甘油的转化率及最终产品中1，3_丙ニ醇的浓度。2、本发明方法可以使用単一的甘油碳源，既可以作为菌体生长底物，又可以作为转化用底物生产1，3_丙ニ醇，可以减少发酵过程中的副反应，減少副反应物的生成；此外，通过发酵过程中微氧和厌氧的转换，強化了微生物菌体生长的微氧增殖阶段和1，3_丙ニ醇积累的发酵阶段，更利于有针对性的提高两个阶段的生物效率。
具体实施例方式下面结合实施例进ー步说明本发明的效果，但不构成对本发明的限制。本发明实施例中，以Waters 2695分离系统与Waters 2414示差检测器构成液相分析系统，其中分离柱选用Aminex HPX-87H有机酸和醇分析柱用于酸类和醇类的分离。以琥珀酸、乳酸、甘油、こ酸、1，3_丙ニ醇、こ醇标准样品建立标准图谱，反应过程中定时测量反应体系中甘油的消耗情况、产物1，3_丙ニ醇的积累情况。 本发明实施例中，所用的菌种为克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae),来自中国石化抚顺石油化工研究院专利菌种，菌种在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)保藏，菌种保藏号=0798。本发明方法中种子培养基及发酵用基本培养基的基本组成如下；
权利要求
1.一种促进微生物发酵生产1，3-丙ニ醇的方法，包括种子液培养过程和发酵过程，其特征在于所述发酵过程使用的发酵培养基中含有浓度为O. lg/L O. 4g/L丙酮酸和/或α -酮戊ニ酸，发酵过程依次分为微氧发酵和厌氧发酵，当OD值大于7时由微氧发酵转变为厌氧发酵。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述微氧发酵时通入流速为O.Ivvm ·O.5vvm的空气；厌氧发酵时通入流速为2 vvm 4vvm的氮气。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述的发酵过程如下以甘油为底物发酵，种子液体积和发酵培养基体积按I :10 I :20比例在生物反应器内混合，培养温度 为30°C 40°C,搅拌速度为200rpm 500rpm, pH控制在6 8之间。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵初始甘油底物浓度控制在25g/L 45g/L ;发酵过程中，通过流加形式补充甘油，使发酵体系中甘油浓度控制在25g/L 45g/L。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述种子液的培养过程如下将菌种保藏液与种子培养基按体积I :100 I :500比例混合于培养反应器内，培养温度为30°C 40°C,搅拌速度为IOOrpm 400rpm, pH控制在6 8之间。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的菌种为兼性厌氧克雷伯杆菌、弗氏朽1檬杆菌。
全文摘要
本发明公开一种促进微生物发酵生产1，3-丙二醇的方法，包括种子液培养过程和发酵过程，所述发酵过程使用的发酵培养基中含有浓度为0.1g/L～0.4g/L丙酮酸和/或α-酮戊二酸，发酵过程依次分为微氧发酵和厌氧发酵，当OD值大于7时由微氧发酵转变为厌氧发酵。该方法能够有效促进甘油的转化，大幅提高最终产物中1，3-丙二醇的浓度。
文档编号C12R1/22GK102864177SQ20111018842
公开日2013年1月9日 申请日期2011年7月7日 优先权日2011年7月7日
发明者张霖, 师文静, 李晓姝, 王领民 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院