专利名称：从葱白中提取葱酶的方法
技术领域：
本发明属于葱白提取物的方法，具体涉及一种从葱白中提取葱酶的方法。
背景技术：
葱白是百合科(Liliaceae)植物分葱 Allium fistulosum L. var. caespitosum Makino.的鳞茎。药理学研究表明，葱白中所含的化学成分主要是有机含硫化合物和不饱和脂肪酸。葱白提取物能够明显改善冠心病心绞痛患者心绞痛发作的次数和程度，具有良好的扩张冠状动脉，改善心肌缺血作用；降血脂和胆固醇，抗氧化损伤、保护血管内皮，抗动脉粥样硬化的作用；具有明显的抗氧化损伤，抑制血管平滑肌细胞增生，保护内皮细胞，减轻球囊损伤后再狭窄的功效，葱白提取物中有效物质的其作用机理尚不得而知。葱白中存在着一种酶，和其相应有机硫化物底物，当葱白细胞破碎的条件下，二者即结合，反应生成丙酮酸和硫代亚磺酸酯类物质。硫代亚磺酸酯类化合物是葱属众多植物中含硫化合物的前体物质，也是该属物质中众多生物活性的关键物质。该物质非常不稳定， 很容易分解为各种含硫化合物。因此对葱白生物活性的研究及开发利用过程中，对含硫化合物的前体物质的研究则成了关键之一，所以对其起重要作用的酶的研究具有重要的意义。而如何从葱白提取得到葱酶上没有任何文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从葱白中提取葱酶的方法，以解决上述问题。本发明的技术方案是从葱白中提取葱酶的方法，它是将葱白在_4°C至4°C冷却后，加入提取液在_4°C至4°C均浆后，过滤，在0°C至5°C分离得第一固相和第一液相；在 0°C至5°C下，向第一液相中加入第一液相质量的15% 30%聚乙二醇，静置，0°C至5°C离心，得到第二固相和第二液相；将第二固相用PH6 pH6. 8的磷酸盐缓冲液溶解，经透析后冷冻干燥便可得到葱酶；所述提取液由PH6 pH6. 8的磷酸盐缓冲液、磷酸缓冲液体积 9% 12%的甘油，1 4克/千毫升磷酸盐缓冲液的乙二胺四乙酸二钠和0. 002 0. 01 克/千毫升磷酸盐缓冲液的5’ -磷酸吡哆醛和/或磷酸吡哆醛组成。所述加入提取液在_4°C至4°C均浆是先将pH6 pH6. 8的磷酸盐缓冲液、甘油， 乙二胺四乙酸二钠与葱白混合，在-4°C至4°C冷却不少于5小时后，再加入5’-磷酸吡哆醛和/或磷酸吡哆醛。所述磷酸盐缓冲液是Na2HPO4和KH2PO4的混合液。所述Na2HPO4和KH2PO4的磷酸盐缓冲液中1000毫升磷酸盐缓冲液含7 12克 Nei2HPO4、含 3 8 克 KH2PO4。所述透析是在_4°C至4°C利用透析袋截留分子量8000-14000的分子。其步骤是(1)葱白在温度为_4°C至4°C，时间为5小时至M小时；(2)在冷却的葱白加入pH6 ρΗ6· 8的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液，及磷酸缓冲液体积9% 12%的甘油，1 4克/千毫升磷酸盐缓冲液的乙二胺四乙酸二钠混合，-4°C至4°C预冷5小时至M小时，再加入0. 002 0. 01克/千毫升磷酸盐缓冲液的 5’-磷酸吡哆醛和/或磷酸吡哆醛；在_4°C至4°C勻浆后；0°C至5°C在离心，得到第一固相和第一液相；(3)在第一液相中加入第一液相质量的15% 30%聚乙二醇，搅拌后静置；0°C至 5°C在离心，得到第二固相和第二液相；(4)将第二固相用pH6 pH6. 8的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液溶解后；使用的透析袋截留分子量8000-14000分子；透析操作的温度为_4°C至4°C ；(5)将步骤(4)透析后的溶液在是低于_45°C -30°C温度冷冻后，升华，升华最高温度< 35°C ；得到葱酶。步骤中透析过程中更换pH6 pH6. 8的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲。提取得到的葱酶经过SDS-PAGE分析得到的图谱显示，该葱酶为混合物，其中浓度较高的成分主要集中在相对分子量40 55kDa之间。本发明葱白中酶的方法操作简便易行工艺质量稳定。
图1葱白中提取葱酶的SDS-PAGE图。
具体实施例方式实施例1(1)将葱白在温度为_4°C至4°C，时间为12小时至M小时；(2)在冷却的葱白350克加入ρΗ6· 5的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液500毫升，45 毫升的甘油，0. 5克乙二胺四乙酸二钠(EDTA)混合，_4°C至4°C预冷12小时，再加入0. 001 克5’-磷酸吡哆醛；在_4°C至4°C勻浆后；0°C至5°C在转速为6000转/分至8000转/分， 时间为20分钟至30分钟进行离心，得到第一固相和第一液相；500毫升的Na2HPO4和KH2PO4 磷酸盐缓冲液含有Na2HP043. 5克，含KH2PO4L 5克。(3)在第一液相中加入第一液相质量的15%聚乙二醇8000，搅拌后静置；0°C至 5°C在转速为6000转/分至8000转/分，时间为20分钟至30分钟进行离心，得到蛋白质沉淀和上清液；(4)将蛋白质沉淀用pH6. 5的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液250毫升溶解后；使用的透析袋截留分子量8000-14000分子；透析操作的温度为_4°C至4°C ；透析2次，总透析时间为6小时至8小时。250毫升的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液含有Na2HPO4L 25克， 含 KH2PO4O. 75 克。(5)将步骤(4)透析后的溶液在是低于_45°C -30°C温度冷冻后，升华，升华最高温度< 35°C ；得到葱酶。得葱酶冻干粉末4. Sg实施例2按上述工艺步骤步骤2中，原料葱白350克，pH6. 5的500毫升的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液含有Na2HP046克，含KH2P044克；60毫升的甘油，2克乙二胺四乙酸二钠，0. 005克5’ -磷酸吡哆醛
步骤3中第一液相质量的25%聚乙二醇.步骤4中pH6. 5的250毫升的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液含有Νει2ΗΡ046克，含 ΚΗ2Ρ044克。透析3次。得葱酶冻干粉末6. Og实施例3按上述工艺步骤步骤2中，原料葱白350克，ρΗ6· 5的500毫升的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液含有Na2HP044. 8克，含ΚΗ2Ρ042· 8克；100毫升的甘油，1克乙二胺四乙酸二钠，0. 0025克 5’ -磷酸吡哆醛步骤3中第一液相质量的30%聚乙二醇8000步骤4中ρΗ6. 5的500毫升的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液含有Na2HP044. 8克， ^ KH2P042. 8 克。得葱酶冻干粉末5. 3g。上述实施例中聚乙二醇可优选采用聚乙二醇8000 (PEG8000)。上述工艺表明采用提取液由pH6 pH6. 8的磷酸盐缓冲液、磷酸缓冲液体积 9% 12%的甘油，1 4克/千毫升磷酸盐缓冲液的乙二胺四乙酸二钠和0. 002 0. 01 克/千毫升磷酸盐缓冲液的5’ -磷酸吡哆醛和/或磷酸吡哆醛进行均浆后，平均蛋白质量 7. 381 克，平均酶活(U) 93. 478。采用15% 30%聚乙二醇分离后的酶的活性相对稳定。透析Mi后，透析基本已经达到平衡。提取得到的葱酶经过SDS-PAGE分析得到的图谱显示，该葱酶为混合物，其中浓度较高的成分主要集中在相对分子量40 55kDa之间，如图1所示。
权利要求
1.从葱白中提取葱酶的方法，它是将葱白在-4°C至4°C冷却后，加入提取液在-4°C至 4°C均浆后，过滤，在0°C至5°C分离得第一固相和第一液相；在0°C至5°C下，向第一液相中加入第一液相质量的15% 30%聚乙二醇，静置，0°C至5°C离心，得到第二固相和第二液相；将第二固相用PH6 pH6. 8的磷酸盐缓冲液溶解，经透析后冷冻干燥便可得到葱酶；所述提取液由PH6 pH6. 8的磷酸盐缓冲液、磷酸缓冲液体积9% 12%的甘油，1 4克 /千毫升磷酸盐缓冲液的乙二胺四乙酸二钠和0. 002 0. 01克/千毫升磷酸盐缓冲液的 5’ -磷酸吡哆醛和/或磷酸吡哆醛组成。
2.如权利要求1所述的从葱白中提取葱酶的方法，其特征是所述加入提取液在_4°C 至4°C均浆是先将pH6 pH6. 8的磷酸盐缓冲液、甘油，乙二胺四乙酸二钠与葱白混合， 在-4°C至4°C冷却不少于5小时后，再加入5’ -磷酸吡哆醛和/或磷酸吡哆醛。
3.如权利要求1或2所述的从葱白中提取葱酶的方法，其特征是所述磷酸盐缓冲液是 Na2HPO4和KH2PO4的混合液。
4.如权利要求3所述的从葱白中提取葱酶的方法，其特征是所述Na2HPO4和KH2PO4的磷酸盐缓冲液中1000毫升磷酸盐缓冲液含7 12克Na2HPO4、含3 8克ΚΗ2Ρ04。
5.如权利要求1所述的从葱白中提取葱酶的方法，其特征是所述透析是在_4°C至4°C 利用透析袋截留分子量8000-14000的分子。
6.如权利要求1所述的从葱白中提取葱酶的方法，其特征是其步骤是(1)将新鲜小葱洗去杂质，除去葱皮，剪取葱白，葱白在温度为-4°C至4°C，时间为5小时至24小时；(2)在冷却的葱白加入pH6 pH6.8的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液，及磷酸缓冲液体积9% 12%的甘油，1 4克/千毫升磷酸盐缓冲液的乙二胺四乙酸二钠混合，-4°C至 4°C预冷5小时至M小时，再加入0. 002 0. 01克/千毫升磷酸盐缓冲液的5’-磷酸吡哆醛和/或磷酸吡哆醛；在_4°C至4°C勻浆后；0°C至5°C在离心，得到第一固相和第一液相；(3)在第一液相中加入第一液相质量的15% 30%聚乙二醇，搅拌后静置；0°C至5°C 在离心，得到第二固相和第二液相；(4)将第二固相用pH6 pH6.8的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液溶解后；使用的透析袋截留分子量8000-14000分子；透析操作的温度为_4°C至4°C ；(5)将步骤(4)透析后的溶液在是低于_45°C -30°C温度冷冻后，升华，升华最高温度 < 350C ；得到葱酶。
7.如权利要求6所述的从葱白中提取葱酶的方法，其特征是步骤(4)中透析过程中更换pH6 pH6. 8的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲。
8.如权利要求1或6所述的从葱白中提取葱酶的方法，其特征是所述聚乙二醇采用聚乙二醇8000。
全文摘要
本发明公开了一种从葱白中提取葱酶的方法，它是将葱白在-4℃至4℃冷却后，加入提取液在-4℃至4℃均浆后，过滤，在0℃至5℃分离得第一固相和第一液相；在0℃至5℃下，向第一液相中加入第一液相质量的15％～30％聚乙二醇，静置，0℃至5℃离心，得到第二固相和第二液相；将第二固相用pH6～pH6.8的磷酸盐缓冲液溶解，经透析后冷冻干燥便可得到葱酶。提取得到的葱酶经过SDS-PAGE分析得到的图谱显示，该葱酶为混合物，其中浓度较高的成分主要集中在相对分子量40～55kDa之间。本发明葱白中酶的方法操作简便易行工艺质量稳定。
文档编号C12N9/00GK102321592SQ20111030092
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者张耕, 程璐, 胡松 申请人:张介眉