专利名称：一种高效制备天然脱落酸的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种发酵生产制备天然脱落酸(Abscisic Acid, ABA)的新方法。
背景技术：
脱落酸(ABA)是目前世界上已发现的五大植物激素之一。天然型的脱落酸由于对农作物的生长发育具有很强的调节活性，能促进果实类、谷类、豆类的成熟发育，能大幅度提高其产量和质量，又能大大增强其耐寒、抗旱和抗盐碱能力，因而具有广阔的应用前景。 目前，脱落酸在基础领域的研究已深入到植物细胞与基因工程水平。然而，由于存在于植物体内的天然脱落酸的光学构型仅为(s)-(+)-脱落酸，单纯的(s)-(+)-脱落酸的生产成本极高，售价昂贵，而人工合成的脱落酸是外消旋体，活性远小于天然型的脱落酸。因此，脱落酸应用于农业生产几乎是空谈。为了解决和满足脱落酸应用于农业生产的需要，近二十年来，国内外(中国、日本等)一直在研究利用微生物发酵法来生产天然脱落酸。例如，已知可用真菌灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)来生产天然脱落酸，并公开了例如采用纤维素泡沫作载体的液体发酵，发酵产量有所提高，最高的产量达300毫克/升发酵量(参见，例如JP-A-6-247927、 JP-A-6-197775、 JP-A-6-133786、 JP-A-6-7180、 JP-A-2-10988、 JP-A-2-60590、 JP-A-63-296696, JP-A-58-51895)；另外，CN1182798A公开了一种通过真菌发酵生产天然脱落酸的方法，该方法采用三级发酵，在第三级发酵中采用连续流加补料出料以及菌种固定化，并添加关键底物，使产酸量稳定，脱落酸的最高产量达到1. 2克/升发酵液。专利 ZL00132024. 6公开了制备天然脱落酸的方法，该方法是通过采用真菌批次液体培养基流加补料工艺来制备天然脱落酸的方法。专利2007100(^609. 2公开了一种新的制备天然脱落酸方法，该方法通过在发酵过程中流加肌醇解除葡萄糖阻遏的工艺来提高脱落酸的产量。但现有技术菌种的底物转化率低，合成脱落酸的前体物质供应速率低，脱落酸产量受到局限；且发酵工艺(固体发酵、液体批次发酵和连续流加补料出料工艺、批次液体培养基流加补料工艺等)由于油脂类副产物较多，造成发酵液溶氧不均，导致溶氧利用率较低，能耗较大，成本居高不下。
发明内容
针对现有技术中已知的用微生物发酵生产天然脱落酸工艺中所存在的菌种发酵产量较低，能耗较大，生产成本高等的不足，本发明者进行了深入的研究，寻找更为有效的提高脱落酸产量的方法，以及生产成本更低的改进工艺。研究发现，葡萄糖等碳源氧化后会生成乙酰辅酶A (Acetyl Coenzyme Α)进入三羧酸循环，同时，乙酰辅酶A也是真菌生物合成脱落酸的甲羟戊酸(Mevalonic acid, MVA)途径的重要前体，因此，一定程度增加发酵体系中乙酰辅酶A的浓度，有利于脱落酸的合成。吐温-20(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯，Tween-20)，分子式与分子量
3C58H114(^6，1227. 5，非离子表面活性剂，对发酵液中某些成份尤其油脂成份，具有乳化、扩散、增溶、稳定等作用，能较好改善发酵液溶氧状况，提高菌体对溶氧的利用率，从而提高脱落酸产量，降低能耗和成本。本发明人还利用微生物分子遗传学技术，如基因组改组(重排)技术、基因定向诱变技术等，对天然脱落酸产生菌株灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea) TB_3_A3 (谭红等，利用原生质体诱变技术筛选脱落酸高产菌株，应用与环境生物学报1998,4(3) =281-285)进行遗传改良，经过大量的菌种选育工作，获得一株能较好利用乙酰辅酶A、天然脱落酸产量提高幅度较大的菌株TBC-20。本发明人利用葡萄孢霉属(Botrytis)菌株，(例如，灰葡萄孢霉Botrytis cinerea)，尤其是灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)遗传改良菌株TBC-20，发酵生产脱落酸，在发酵工艺中将乙酰辅酶A和吐温-20分别作为前体物质和表面活性剂加入发酵体系， 发现能有效提高脱落酸的产量，从而完成了本发明。本发明的目的是提供一种通过流加乙酰辅酶A(Acetyl Coenzyme A)作为菌株合成脱落酸的前体物质，同时，添加表面活性剂吐温-20改善发酵液溶氧状况，发酵生产脱落酸的方法。本发明的另一目的是提供一种用于产生天然脱落酸的新菌株。更具体地说，本发明提供一种发酵制备天然脱落酸的新方法，它包含如下步骤将能够产生天然脱落酸的真菌在一级液体培养基(例如，下文所述的培养基A) 中培养，制得第一级种子液，所述的真菌选自葡萄孢霉属(Botrytis)(例如，灰葡萄孢霉 Botrytis cinerea)及上述菌株的遗传改良菌等；将在上述第一级液体培养基中培养好的第一级种子液接种到第二级液体培养基 (例如，下文所述的培养基B)中培养，制得第二级种子液；将在上述第二级液体培养基中培养得到的第二级种子液接种到第三级液体培养基(例如，下文中所述的培养基C)中培养12-72小时后，加入表面活性剂吐温-20以改善发酵液溶氧状况，并开始进行第三级液体培养基流加补料发酵培养，同时流加乙酰辅酶A作为菌株合成脱落酸的前体物质，提高脱落酸的产量。从上述发酵培养液中收集所得的脱落酸。本发明的具体实施方案是，采用产生天然脱落酸的葡萄孢霉属菌株或其遗传改良菌，在液体培养基中进行三级发酵培养，在每级发酵阶段选用不同的培养基。在第三级发酵中，以适合于第三级发酵的液体培养基，例如下文中描述的培养基C，作为发酵培养基， 230C 温度下培养12-72小时后，加入生物表面活性剂吐温_20，开始液体培养基流加补料，并同时流加乙酰辅酶A。第三级液体培养基(例如培养基C)流加补料方式可以采用连续(勻速或非勻速) 流加和/或间歇式流加方式，间歇流加方式是优选的。乙酰辅酶A流加方式可以采用连续(勻速或非勻速)流加和/或间歇式流加方式， 连续(勻速或非勻速)流加方式是优选的。所述的连续(勻速或非勻速)流加方式，是以(XOl-IOmgA^h(勻速或非勻速) 将浓度100U/mg-500U/mg的乙酰辅酶A，连续流加入第三级发酵罐，直至停止发酵(下罐) 前例如大约50小时。
所述的间歇式流加方式，是以间隔一段时间加一次料的方式，间歇式将100U/ mg-500U/mg浓度的乙酰辅酶A，流加入第三级发酵罐。间歇时间优选为每隔2_30小时补料 1-5次，更优选为大约间隔5小时补料1次。本领域技术人员也可根据需要，采用其它的适合时间间隔补料流加。发酵条件温度23°C -29°C，pH :4_7发酵时间8-11天。采用本发明工艺，通过流加一定浓度的乙酰辅酶A，作为菌株合成脱落酸的前体物质，同时，添加生物表面活性剂吐温-20改善发酵液溶氧状况，提高菌株对氧的利用效率和产酸率，降低能耗，从而降低生产成本。发酵培养液中的脱落酸用常规方式回收，例如采用有机溶剂萃取法、薄膜过滤法、离子交换树脂法、大孔吸附树脂法、硅胶柱层析法及活性碳吸附法等提取后，即得白色或淡黄色结晶脱落酸；按照下述文献中提供的脱落酸立体化学结构鉴定方法，确定为天然脱落酸谭红等，利用原生质体诱变技术筛选脱落酸高产菌株，应用与环境生物学报1998，4 (3) :281-285。在优选的具体实施方案中，本发明还采用例如新菌株等技术方案来进一步提高天然落脱酸的产量。本发明方法可以采用已知的产生天然脱落酸的菌株，例如，已知的、或由微生物遗传工程方法获得的产生天然脱落酸的葡萄孢霉属菌株(例如，灰葡萄孢霉Botrytis cinerea)或其遗传改良菌。在优选的本发明方法中，使用已知的产生脱落酸的高产菌种， 例如 Botrytiscinerea ΤΒ-3_Η8、ΤΒΙ_9 (CGMCC No. 0500,已在专利 ZL00132024. 6 中公开)、 TBC-10 (CGMCC No. 1889，已在专利 2007100(^609. 2 中公开)、Ferm Ρ-6156，B. C. FD338 等。 在最优选的本发明方法中使用新菌株脱落酸高产菌株灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea) TBC-20，其已在2011年3月9日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(邮编610041)中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为 CGMCC No. 4645，该菌株是将灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea) TB-3-A3采用微生物分子遗传学技术，如基因组改组(重排)技术、基因定向诱变技术等，获得的遗传改良菌株。本发明工艺过程采用三级发酵技术，采用三级发酵来制备脱落酸是已知的(参见，例如，CN1182798A, ZL00132024. 6)。根据三级发酵的不同要求，分别选择三种不同的培养基来进行发酵，这些培养基可以是本领域技术人员已知的适合于此目的的培养基或是发明专利ZL00132024. 6中公开的培养基。使用发明专利ZL00132024. 6中公开培养基是优选的。发明专利ZL001320M.6中公开了培养基A、B、C，其具体组成如下培养基A
权利要求
1.一种高效制备天然脱落酸的方法，其特征是采用灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea) TBC-20, CGMCC No. 4645 作为发酵菌种。
2.一种高效制备天然脱落酸的方法，其特征是发酵过程中添加乙酰辅酶A。
3.一种高效制备天然脱落酸的方法，其特征是发酵过程中添加吐温-20。
4.一种高效制备天然脱落酸的方法，其特征是采用灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea) TBC-20, CGMCC No. 4645，在第一级液体培养基中培养，将在第一级液体培养基中培养好的第一级种子液接种到第二级液体培养基上进行培养；将在上述第二级液体培养基中培养得到的第二级种子液接种到第三级液体培养基中，在发酵培养12-72小时后，加入吐温-20，开始进行第三级液体培养基流加补料，并同时流加乙酰辅酶A发酵培养；从上述发酵培养液中收集所得的脱落酸。
5.根据权利要求4所述的高效制备天然脱落酸的方法，其特征是所述的流加乙酰辅酶A流加补料为连续流加和/或间歇式流加方式；吐温-20为一次性加入。
6.根据权利要求5所述的高效制备天然脱落酸的方法，其特征是所述的连续流加为勻速或非勻速流加。
7.根据权利要求5所述的高效制备天然脱落酸的方法，其特征是所述的连续流加方式是以0. 01-10mg/L · h的流加速率将浓度为100U/mg-500U/mg的乙酰辅酶A连续流加入第三级发酵罐，直至停止发酵前50小时。
8.根据权利要求5所述的高效制备天然脱落酸的方法，其特征是所述的间歇式流加乙酰辅酶A方式，是每间歇2-30小时补料1-5次浓度为100U/mg-500U/mg的乙酰辅酶A。
9.根据权利要求8所述的高效制备天然脱落酸的方法，其特征是所述的间歇式流加乙酰辅酶A方式是每间隔5小时补料1次浓度为100U/mg-500U/mg的乙酰辅酶A，每次补加量为0.01-10. Omg/L发酵液。
10.根据权利要求5所述的高效制备天然脱落酸的方法，其特征是所述的吐温-20添加方式采用一次性加入，加入量为发酵液体积的0. 01% -5. 0%。
全文摘要
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种在发酵过程中流加乙酰辅酶A作为菌株合成脱落酸的前体物质，同时，添加生物表面活性剂吐温-20改善发酵液溶氧状况来制备天然脱落酸的方法。该方法包括下列步骤将能够产生天然脱落酸的真菌在第一级液体培养基中培养；将培养好的第一级种子液接种于第二级液体培养基上培养；在第三级液体培养基中流加补料，并同时加入吐温-20和流加乙酰辅酶A进行发酵培养；以及从发酵培养液中收集所得的脱落酸。本发明方法可提高菌株对氧的利用效率和产酸率，使菌株以较高的底物转化率和产物合成速率生产脱落酸，提高了产量和生产效率，降低能耗，从而降低生产成本。
文档编号C12P7/42GK102399827SQ20111036994
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月18日 优先权日2011年11月18日
发明者周金燕, 杨杰, 肖亮, 谭红, 钟娟 申请人:中国科学院成都生物研究所