一种抗肿瘤血管生成的适体分子及制备方法

专利名称：一种抗肿瘤血管生成的适体分子及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤血管生成的适体分子及制备方法。
背景技术：
适体是功能相当于抗体的DNA或RNA片段，能够对靶分子进行特异性识别和结合， 并有效抑制靶分子的生物学活性。适体的核酸序列信息可通过配体指数级富集系统进化技术(SELEX)筛选得到，适体分子能够采用化学方法大批量低成本合成。DNA适体分子在体外非常稳定，冻干粉状态常温可保存一年以上，因此有很好的药物开发前景。目前适体被认为是最有开发前景的核酸药物之一，其它三种是RNAi、核酶和microRNA。适体分子与细胞外靶分子作用即有效，因此相对必须在细胞内发挥作用的其它三种核酸药物，适体的应用前景更为广泛。目前针对血液疾病、心血管疾病、神经系统疾病、血液系统疾病、肿瘤等疾病的诊断与治疗方面的适体研究已经在进行中，一些适体制剂已经进入临床试验，专门用于治疗黄斑变性的抗血管内皮生成因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)适体药物(Macugen)已经上市。适体药物体内血清稳定性差的特点严重阻碍了其临床应用。由于血液中存在核酸酶，特别是核酸外切酶，使得未加任何修饰的线性DNA或RNA分子的半衰期不到10分钟，适体还未发挥理想的药效作用即被降解。因此要开发适体药物，首先需要考虑的就是如何延长其血液半衰期。当前广泛使用的方式一般有两种一是对组成核酸适体分子的核苷酸进行分子骨架修饰，比如保护性2-位核苷酸修饰(2-F，2-0CH3，LNA，磷酸基团)等。尽管经化学基团修饰的适体分子显示了良好的抗核酸外切酶特性，但是核苷酸骨架的化学修饰有时候影响适体对配体分子的亲合力以及识别的特异性，适体分子代谢后产生的化学修饰核苷酸也可能参与人体核酸的合成，存在潜在的危害。第二种就是对适体分子进行环化修饰。 由于血清中主要核酸酶为核酸外切酶,环化适体分子没有暴露的5'端和3'端，核酸外切酶降解的直接源头被消除，因此适体分子环化修饰可有效延长其血清稳定性。环化适体由于全部采用天然的常用核苷酸，避免了适体代谢后产生有潜在危害产物的风险。目前环化适体的产生，主要是通过体外酶连的方法，以及利用质粒体内产生环化适体，存在效率低，操作复杂的问题。如何既保持经SELEX筛选出的核酸适体分子对配体特异性识别并与之结合的特性，又提高其体内稳定性，还没有系统和成熟的方法。因此，发展一种快速高效和低成本的环状适体制备的方法，对于拓宽核酸适体的应用有着及其重要的意义。本发明针对当前适体药物存在的问题，开发了一种能够高效率和低成本的适体环化修饰和制备的方法。

发明内容
针对当前适体药物存在的问题，本发明建立了针对线性DNA适体分子进行环化修饰设计和制备的方法流程，通过改进的滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)反应产生环状DNA适体分子，建立了一种可高效快速和低成本的抗肿瘤血管生成的适体分子环化修饰设计及制备方法流程。DNA适体分子的核酸序列是适体研究中最为重要的部分，核酸序列决定着适体的
二级结构以及与配体分子识别的特异性和结合能力，大多数适体如果直接对线性分子进行环化则不能保持其原有构象，从而失去或大大减弱其识别与结合配体分子的能力。本发明依据经SELEX筛选出的线性DNA适体序列，经过构象分析和核心序列确定，设计了本发明的环状DNA适体序列。DNA适体分子环化技术目前存在着成本高和效率低的问题，本发明借鉴RCA方法， 在辅助序列设计、试剂的选择、扩增条件等方面进行改进，建立了一种可快速高效、低成本地产生包含丰富茎环结构的环状适体的技术流程。经过两次RCA反应可使初始环状模板分子增加约10万倍。本发明简写说明如下VE5a :经SELEX技术筛选出的可作用于VEGF165的线性适体序列；cVE5a VE5a适体分子序列不加任何改动直接环化后的序列；V5aE+ :加入AT接头序列及酶切位点序列的VE5a线性适体分子；p-V5aE+ V5aE+5/端磷酸化后的序列；V5aE- V5aE+的反向互补序列；cV5aE+ V5aE+的环化适体分子；cV5aE- :V5aE_的环化适体分子，cV5aE+的反向互补序列；LV5aE+ V5aE+的酶连辅助序列；LV5aE- :V5aE_的酶连辅助序列；DV5aE+ cV5aE+的酶切辅助序列；DV5aE- :cV5aE_的酶切辅助序列；exol :核酸外切酶I ;exoIII :核酸外切酶 III ；RV5aE+Pf :双引物RCA反应中正向引物；RV5aE-Pr :双引物RCA反应中反向引物；TFpF :人组织因子(Tissuefactor, TF)特异性扩增正向引物；TFpR :人组织因子(Tissuefactor, TF)特异性扩增反向引物。以上引物和寡核苷酸序列均由生工生物工程(上海)有限公司合成与纯化，无菌去离子水稀释，-20°C保存。为了达到上述目的，本发明的技术方案是一种抗肿瘤血管生成的适体分子，其序列为5 ' -ACTTCCAGTCTATTCAATTGGGCCCGTCCGTATGGTGGGTGTGCGTGGCCACGAGTTTTAAAA AAAAAAACCAAGCTTTTTTTTGATCATGT-3 ';该适体分子(V5aE+)在离适体分子与靶分子抗 VEGF165特异结合的核心茎环区域较远的位置插入一个AT接头和一个核酸酶作用位点，其中AT接头中A和T碱基的数目分别是8个；酶作用位点包含DNA连接酶酶连位点以及DNA 内切酶(RsaI)酶切位点，位置在核心茎环区域与AT接头之间，环化修饰的分子可通过环到环循环反应大量制备，环化效率通过实时突光定量RCA检测。一种抗肿瘤血管生成的适体分子的制备方法，包括如下步骤首先对线性适体分子V5aE+进行磷酸化和环化反应，然后进入环到环循环反应；每次环到环循环反应经历两轮反应，每轮反应依次为滚环扩增反应、酶切反应和环化反应。 所述的环化反应使用的酶连辅助序列LV5aE+为51 -CCCAATTGAATAGACTGGAAGTA CATGATCAAAAAAAAGCT-3'；或酶连辅助序列 LV5aE_ 为5' -AGCTTTTTTTTGATCATGTACTTCCA GTCTATTCAATTGGG-3'。所述的滚环扩增反应使用的引物序列即酶连辅助序列LV5aE+为5' -CCCAATTGA ATAGACTGGAAGTACATGATCAAAAAAAAGCT-3'；或酶连辅助序列 LV5aE_ 为5' -AGCTTTTTTTTG ATCATGTACTTCCAGTCTATTCAATTGGG-3'。所述的酶切反应使用的酶切辅助序列DV5aE+为 5 ' -GAATAGACTGGAAGTACATGATC-3或酶切辅助序列 DV5aE_5' -GATCATGTACTTCCAGTCTATTC-3'。所述的环化反应条件为将I份已环化的磷酸化线性适体与1-5份酶连辅助序列混合，在Taq DNA连接酶缓冲液(购自New EnglandBiolabs公司，美国)中，95°C孵育5分钟，然后缓慢冷却到室温；加入Taq DNA连接酶(购自New England Biolabs公司，美国), 94°C孵育4分钟；然后按照以下程序完成15个循环94°C 30秒，45°C 5分钟；最后95°C 15 分钟灭活Taq DNA连接酶；未环化的DNA产物用exol+exolll (购自New England Biolabs 公司，美国)降解上述环化反应产物混合物，加入Exo I和Exo III，37°C孵育2小时30分钟，80°C孵育5分钟灭活外切酶，得到环化DNA适体分子。所述的滚环扩增反应的反应条件为将I份环化DNA分子与10-1000份的酶连辅助序列混合，加入到Bst DNA聚合酶缓冲液(购自New England Biolabs,美国)中，再加入2 百万份dNTPs (购自宝生物工程有限公司，大连)，再加入Bst DNA聚合酶(购自NewEngland Biolabs，美国)，65°C 120分钟；80°C孵育20分钟灭活Bst DNA聚合酶。所述的酶切反应的反应条件为将I份RCA产物与10万份酶切辅助序列加入到 RsaI内切酶缓冲液(购自New England Biolabs,美国)中，再加入RsaI限制性内切酶(购自New England Biolabs，美国)，37°C孵育3. 0小时；65°C 20分钟灭活RsaI内切酶。本发明的有益效果是效果检测是表征本发明成败的关键，主要包括扩增效率检测、环化DNA适体稳定性检测和生物活性检测。本发明采用实时荧光定量PCR法检测环化扩增效率和环化适体分子的血清稳定性；采用人脐静脉上皮细胞(HUVEC)组织因子(TF)mRNA 表达变化实验，来检测具有抗肿瘤新生血管活性的环化适体分子的细胞内生物学活性。VEGF是血小板源生长因子超家族中的一员，目前主要包括VEGF-A、胎盘生长因子、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E，VEGF-A是其中最重要的成员。VEGF通过其受体 VEGFR介导下游信号的传导，促进血管内皮细胞增殖、分化与成熟，抑制血管内皮细胞凋亡， 诱导血管平滑肌细胞迁移，并促进血管平滑肌细胞合成和分泌基质金属蛋白酶，加速基质降解以及趋化炎症细胞等，最终促使新毛细血管生成和功能成熟。癌的生长需要大量的氧气和营养物质，在直径约1-2_之前，癌组织通过弥散作用即可获取氧气和营养物质。当癌直径超过2_后，需要新生血管来提供更多的氧气和营养物质来维持生长。在组织缺氧的情况下，HIF_la(缺氧诱导因子-I a)和MMP(基质金属蛋白酶)等细胞因子会促进VEGF的表达和分泌。VEGF不仅能诱导癌血管生成，促进癌生长，还可能参与癌细胞耐药性的形成。 因此VEGF是抗癌药物最重要的靶点。本发明所研究的适体序列的靶点，即VEGF家族中重要的成员VEGF165。终上所述本发明建立了针对线性DNA适体分子进行环化修饰设计和制备的方法流程，通过改进的RCA反应产生环状DNA适体分子，建立了可高效快速和低成本地制备环状 DNA适体的方法。


图I为抗VEGF165蛋白线性适体和环化适体二级结构的预测分析；A为对VE5a进行二级结构预测分析的结果，包含特异性识别靶分子VEGF165的三个特征茎环结构；B表示对cVE5a序列进行二级结构预测分析的结果；C表示对V5aE+进行二级结构预测分析的结果；D表示对cV5aE+进行二级结构预测分析结果。图2环状DNA适体分子制备流程图；循环开始前包括线性分子磷酸化和环化两个准备步骤，此后经历两次RCA反应、酶切反应、环化反应，反应流程简单高效，操作易于自动化。图3为本发明实施例中线性适体分子环化效果电泳检测结果。图4为本发明实施例中环化适体核酸外切酶稳定性检测的电泳结果；其中图4A为线性DNA适体VE5aE+经过exol+exolll以及DNAseI处理前后的结果；图48为环化后的 DNA适体cVE5aE+经过exol+exolll以及DNAse I处理前后的结果。图5为本发明实施例中环化适体分子与靶分子VEGF165蛋白结合效果检测的电泳结果；其中图5A为VE5a(59nt)与VEGF121和VEGF165蛋白结合前后的电泳结果；5B为 V5aE+(92nt)与 VEGF121 和 VEGF165 结合前后的电泳结果；5C 为 cV5aE+(92nt)与 VEGF165 和VEGF121结合前后的电泳结果。图6为本发明实施例利用RCA反应结合实时荧光定量PCR平台检测适体环化效率的结果；其中图6A为不同浓度的cV5aE+作为模板时定量PCR检测结果；6B为根据图6A结果做出的荧光最大吸收值与cV5aE+浓度之间的线性标准曲线。图7为本发明实施例VEGF165与抗VEGF165适体对人组织因子(TF)表达量作用的实时荧光定量PCR分析结果；其中图7A为不同浓度VEGF165对TF因子mRNA表达量促进作用的定量PCR检测结果；7B为在628pm的VEGF165作用下，不同浓度cV5aE+和V5aE+通过与VEGF165结合对TF因子mRNA表达量抑制作用的实时荧光定量PCR检测结果。
具体实施例方式实施例II、环化适体分子设计根据经SELEX 技术筛选出的 VEGF165 的适体序列 VE5a (HijiriHasegawa, Oxford University Press (2007), Nucleic AcidsSymposium Series No. 51 :399-400 ；Biotechnol Lett (2008) 30 :829-834)，重新设计可环化核酸适体序列(V5aE+):其序列为Y -ACTTCCAG TCTATTCAATTGGGCCCGTCCGTATGGTGGGTGTGCGTGGCCACGAGTTTTAAAAAAMAAACCMGCTTTTTTTTGA TCATGT-3!。如图I中的IA和IB所示，经SELEX技术筛选出的线性适体V5aE依靠三个特征茎环结构对靶分子蛋白VEGF165特异性的识别和结合(如图IA中实线圆圈所标识)，如果不对V5aE序列进行修改而直接环化，则识别靶分子序列的特征茎环结构消失(图1B)，因
6此对适体非核心序列做部分碱基修改是必要的。在设计环化DNA适体分子序列时，本发明在线性适体序列的基础上增添了 AT接头序列(图IC和ID中，虚线圆圈标识)和酶切位点和酶连位点(酶切位点和酶连位点在同一位置，如图ID所指出，其位置远离三个特征茎环结构区)；从图IC和ID可以看出VE5a经修改后的序列V5aE+和环化后的分子cV5aE+均保留了其用于识别靶分子VEGF165的特征茎环结构(实心圆圈所标识)。 为了提高采用RCA技术制备环状DNA适体分子的效率，本发明设计了酶连(LV5aE+ 或LV5aE+)辅助序列；并依据在适体序列上添加了 RsaI限制性内切酶酶切位点(如图ID 所指出)，设计了相应的酶切(DV5aE+或DV5aE_)辅助序列。2、环化适体分子的制备本实施例所有流程如图2，本流程首先对V5aE+进行磷酸化和环化反应，然后进入环到环RCA循环阶段，每轮循环经历两次RCA反应、两次酶切、酶连反应和两次环化反应，从环状的cV5aE+适体分子RCA开始，到制备出新的cV5aE+分子结束，每轮循环可使初始环状分子扩增10万倍，操作程流程简单并且易于自动化。2. I线性适体分子磷酸化线性DNA适体分子的5'端须磷酸化才可以进行环化反应。取300nmol适体分子 (V5aE+)加入到5mL 10XT4DNA Ligase缓冲液(购于宝生物工程有限公司，大连；配方 660mM的Tris-盐酸(pH7. 6)，66mM的氯化镁，IOOmM的二硫苏糖醇，ImM的ATP)中，再加 A IO4单位(U)的T4多聚核苷酸激酶(购于宝生物工程有限公司，大连)，终浓度为1.5mM dATP (IOOmM,购于宝生物工程有限公司，大连)，双蒸水补足至50mL。37°C孵育30分钟，65°C 孵育20分钟灭活T4多聚核苷酸激酶，得到5'端磷酸化后适体序列(p_V5aE+)。2. 2线性适体的环化反应取上述5'端磷酸化后的适体序列(p_V5aE+) 18nmol,与40nmol酶连辅助序列 (LV5aE+)混合，加双蒸水至10mL。先加热到95°C 5分钟，然后缓慢冷却到室温。再加入3mL IOXTaq DNA连接酶缓冲液(购自New England Biolabs公司，美国)，8000U的Taq DNA连接酶(购自New England Biolabs公司，美国)，双蒸水补足30mL，94°C孵育4分钟，然后按照以下程序完成15个循环94°C 30秒，45°C退火5分钟；最后95°C 15分钟灭活TaqDNA连接酶。未环化的产物用exol+exolll降解。取30mL上述环化反应产物混合物,加入3. OmL IOXExo III 缓冲液(购自 New England Biolabs 公司，美国；配方IOmM 的 Bis-Tris-丙烷-盐酸，IOmM的氯化镁，ImM的二硫苏糖醇，PH 7. 0)，然后再加入4500U的Exo I和 1.5X105U 的 Exo III (Exo I 和 Exo III 均购自 New England Biolabs 公司，美国)；双蒸水补足至30mL，37°C孵育2. 5h，80°C孵育15分钟灭活外切酶，得到环化DNA适体分子 (cV5aE+)。2. 3滚环扩增反应I将30pmol环状DNA分子(cV5aE+)加入到6mL IOXBst DNA聚合酶缓冲液(购自 New England Biolabs公司，美国；配方20mM的Tris-盐酸，IOmM的硫酸铵，IOmM的氯化钾，2mM 的硫酸镁，0. I % 的 Triton X-100, PH 8. 8)中，再加入 60 y mol 的 dNTPs (10mM，购于宝生物工程有限公司，大连)，15nmol的RCA引物LV5aE+，4UBst DNA聚合酶(购自NewEngland Biolabs公司，美国)，8%甘油(体积百分比)，双蒸水补足至60mL。65°C 120分钟，80°C孵育20分钟灭活Bst DNA聚合酶，获得包含多个V5aE_分子重复的长链DNA序列。 在本步骤的RCA反应中，扩增引物采用酶连辅助序列LV5aE+。
2. 4内切酶酶切反应I
将lpmol RCA产物与IOOnmol的酶切辅助序列(DV5aE_)加入到3. OmLlOXRsaI限制内切酶缓冲液(购自New England Biolabs公司，美国；配方20mM的Tris-醋酸,50mM 的醋酸钾，IOmM的醋酸镁，ImM的二硫苏糖醇，PH 7. 9)，然后加入104U的RsaI限制性内切酶(购自New England Biolabs公司，美国)，双蒸水补足至30mL。37°C孵育3.0小时。 65°C 20分钟灭活RsaI内切酶。因RCA产物与DV5aE_形成局部双链DNA，可以被RsaI酶内切形成与线性适体分子V5aE+反向互补的线性DNA片段(V5aE_)。
2. 5V5aE-的环化反应I
将18nmol的V5aE_样品与40nmol的LV5aE_混合,加双蒸水至IOmL,加热到95°C, 然后缓慢冷却到室温。加入3. OmLlOXTaq DNA连接酶缓冲液(购自New England Biolabs 公司，美国；配方20mM的Tris-盐酸，25mM的醋酸钾，IOmM的醋酸镁，ImM的NAD，IOmM的二硫酸糖醇，0. 1% 的 Triton X_100，pH 7. 6)，8000U 的 TaqDNA 连接酶(购自 New England Biolabs公司，美国)到反应体系中，加双蒸水补足30mL，94°C孵育4分钟，然后按照以下程序完成15个循环94°C 30秒，45°C退火5分钟；最后95°C 15分钟灭活TaqDNA连接酶。得到环化DNA片段cV5aE-。
未环化的DNA产物用exol+exolll降解,体系同2. 2步骤。
2. 6滚环扩增反应2
将600pmol 的 cV5aE_ 加入到 6mL IOXBst DNA(NEB)聚合酶缓冲液(购自 New England Biolabs公司，美国)中，再加入60 ii mol的dNTPs (IOmM,购自宝生物生物工程有限公司，大连)，15nmol的RCA扩增引物LV5aE_，4000U Bst DNA聚合酶(购自New EnglandBiolabs公司，美国)，8%甘油(体积百分比),双蒸水补足至6OmL0 65°C 120分钟， 80°C孵育20分钟灭活Bst DNA聚合酶，反应完毕获得包含多个V5aE+分子重复的长链DNA 序列。
2. 7内切酶酶切反应2
取IpmolRCA反应2的产物，与IOOnmol的酶切辅助序列(DV5aE+)混合，加入到3.OmL IOXRsaI限制性内切酶缓冲液中，然后加入IO4单位的RsaI限制性内切酶(购自 New England Biolabs公司，美国)(购买厂商)，双蒸水补足至30mL。37°C孵育3. 0小时。 即可将长链RCA产物酶切成单个线性适体分子(V5aE+)片段。
650C 20分钟失活RsaI内切酶。
2. 8V5aE+适体分子环化反应2
取2. 7步骤中的V5aE+产物18nmol，与40nmol酶连辅助序列(LV5aE+)混合， 加双蒸水至10mL。先加热到95°C，然后缓慢冷却到室温。加入3mL IOXTaq DNA连接酶缓冲液(购自New EnglandBiolabs公司，美国)，8OOOU的Taq DNA连接酶(购自New EnglandBiolabs公司，美国)，双蒸水补足30mL,95°C孵育4分钟,然后按照以下程序完成 15个循环94°C 30秒，45 °C退火5分钟；最后95 °C 15分钟灭活TaqDNA连接酶。
未环化的产物用exol+exolll降解，操作同2. 2步骤，可获得扩增约10万倍的环化适体分子(cV5aE+)。
3、效果检测
3. I环化滚环扩增产物检测
本发明设计了双引物RCA反应进行环化适体的RCA产物检测将环化产物经过 exol+exolll消化后，线性DNA片段被消化，仅剩环状产物。
取50fmol环状DNA分子加入到2 U L BstDNA聚合酶缓冲液(购自New England Biolabs 公司，美国)中，再加入 15fmol RV5aE+pF, 15fmol RV5aE-pR,0. 3nmol dNTPs (IOmM, 购自宝生物生物工程公司，大连)，I. 6U Bst DNA聚合酶(购自New England Biolabs公司， 美国)，加双蒸水至20ii L。65°C 120分钟。3%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3，图3为本发明实施例中线性适体分子环化效果电泳检测结果。图3中泳道I为V5aE+(5'端未磷酸化)经过Taq DNA连接酶连接反应后再进行RCA反应结果，由于5'端未进行磷酸化，因此不能被环化，RCA也就无梯状条带出现。泳道2为p-V5aE+成功环化后的环状适体分子经过RCA反应后的结果，有双引物RCA产物所特有的梯状条带出现。
3. 2环化效率检测
为了检测线性适体的环化效果和环化效率，设计一系列双引物扩增RCA反应。取不同量的cV5aE+分子(0, 25, 50,100,150, 200, 250, 300fmol)做RCA标准曲线，同时做环状适体样品(实施例2步骤2. 2纯化好的样品(样品I)和2. 8纯化好的样品进行浓度稀释IO4倍(样品2))的荧光实时定量RCA反应，反应在实时定量荧光PCR仪(StepOnePlus, Applied Biosystems,美国)中进行，反应体系20 ii L :2. OXBstDNA聚合酶缓冲液，0.5uL 20 X SYBR Green I染料液(购自上海闪晶分子生物科技有限公司，上海)，0. 3pmol 的RV5aE+pF(合成自生工生物工程(上海)有限公司，上海)，0. 3pmol的RV5aE_pR(合成自生工生物工程(上海)有限公司，上海)，30nmol dNTPs (购自宝生物生物工程有限公司，大连)，1.6U Bst DNA聚合酶(购自New England Biolabs公司，美国)，双蒸水补足 20 u L0 65°C扩增90分钟。结果数据采用StepOne Software v2. I软件分析。结果如图6， 图6为本发明实施例利用RCA反应结合实时荧光定量PCR平台检测适体环化效率的结果； 图6A为在O-IOnmol的范围内，不同浓度的RCA模板实时定量PCR反应的扩增曲线。从图上可见，浓度低的cV5aE+样品最大吸收值比较低，吸收值达到快速上升阶段的所需循环数较多，证明cV5aE+与RCA扩增后荧光吸收值参数之间有较好的线性关系。图6B为RCA反应的cV5aE+模板浓度与荧光最大吸收值经过统计分析软件包(统计产品与服务解决方案软件包，Statistical Product and Service Solutions, SPSS)拟合，有良好的线性关系 y = 0. 708x+2. 708 (y为最大吸收值对数，x为环化适体浓度(nM)值的对数，R2 = 0. 966)。 根据线性方程式计算出扩增后环状分子比扩增前增加了约0. 75X IO5倍。
3. 3环化适体分子外切酶稳定性
取20 ii L环化反应后适体和线性适体样品分别加入2. 5 ii LlOXExo III缓冲液 (购自New England Biolabs公司，美国)，然后加入3U的Exo I和100U的Exo III ;双蒸水补足至25ii L，37°C孵育2. 5h，80°C孵育15分钟灭活外切酶。
环化适体和线性适体样品还分别加入到2. 0的IOXDNase I的缓冲液中(购自 New England Biolabs 公司，美国)，再加入 22. 5U 的 DNase I (购自 New England Biolabs 公司，美国)，双蒸水补足20 u L，25°C孵育2. Oh。
反应产物用8%的变性PAGE凝胶(0. 5mg/L GoldView, 0. 5 X TBE缓冲液)电泳检测，电泳条件150V，30分钟。结果如图4，图4为本发明实施例中环化适体核酸外切酶稳定性检测的电泳结果；图4A :泳道I线性V5aE+(92nt)样品，泳道2和3为经过exol+exolll 处理的V5aE+样品，4为DNase I处理V5aE+样品。根据图4A结果可知，线性的V5aE+适体样品都被exol+exolll完全降解；图4B :泳道I为cV5aE+适体样品，泳道2和3为经过 exol+exolll处理的cV5aE+样品，泳道4为DNase I处理的cV5aE+样品。M为20_500bp 分子量标准，第三个条带为100bp。从图4B看,cV5aE+适体样品电泳仍能有条带出现,证明适体经过环化后可有效抗exol+exolll的降解。从图4结果看，而无论线性还是环状适体， 都还不能有效抵抗非特异性DNA内切酶降解。
3. 4与配体分子VEGF165结合力检测
米用凝胶阻滞实验(EMSA)进行。分别将纯化好的cV5aE+(4pmol)、VE5a(4pmpl)、 V5aE+(4pmol)加入到 L I X TBSE 结合缓冲液(IOmM Tris/HCl, pH 7. 0, IOOmM NaCl,0.05mM EDTA)中，95°C加热5分钟，然后以2°C/min的速度逐步冷却到25°C。接着加入 IOOng VEGF165 或 VEGF121 在 25°C孵育 I. 0h，加入 L 6 X loadingbuffer，加入到 15% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶(购自sigma公司，美国)中，然后在200V电压下跑40分钟。电泳完毕，GoldView染料(购自北京赛百盛基因技术有限公司，北京)染色30min，用紫外投射仪器(上海路阳仪器有限公司，上海)查看，并拍照分析。结果见图5，图中5A为经SELEX筛选的适体(VE5a，59nt)与靶分子蛋白VEGF165和非靶分子VEGF121混合电泳图，M为20_500bp 分子量标准，泳道I为单纯VE5a分子的电泳结果，泳道2为VE5a与非靶分子VEGF121蛋白混合的结果，泳道3为VE5a与VEGF165混合孵育后电泳结果；从图5A可以看出，VE5a靶分子VEGF165后，电泳条带有些滞后，而与非靶分子VEGF121未结合，电泳条带位置不变；图 5B为V5aE+ (92nt)与靶分子VEGF165以及非靶分子VEGF121混合后电泳图，泳道I为V5aE+ 分子样品，泳道2为V5aE+与非靶分子VEGF121蛋白共同孵育的结果，泳道3为V5aE+与靶分子蛋白VEGF165共同孵育后结果；图5(为环化适体分子cV5aE+(92nt)与靶分子VEGF165 以及非靶分子VEGF121混合后电泳图，泳道I为cV5aE+与靶分子蛋白VEGF165共同孵育后结果，泳道2为cV5aE+分子样品，泳道3为cV5aE+与非靶分子VEGF 121蛋白共同孵育的结果。从结果看，无论线性适体和环状适体在结合缓冲液中，与VEGF165共同孵育之后，电泳条带有些滞后(泳道A3，B3，C1)，而与非靶分子蛋白VEGF121共同孵育之后，电泳条带位置与单纯适体分子相比没有发生变化(泳道A2，B2，C3)。经分析适体分子与VEGF165结合后，电泳条带位置并不与其分子量相符合，主要原因是本实验采用非变性PAGE电泳，样品分子量、蛋白结构，所带电荷等因素共同决定可了条带位置，DNA适体分子与之结合后，构象也将发生变化，所以虽然滞后，但与其分子量关系并不一致。
由图可知经过VE5a、V5aE+、cV5aE+与VEGF165结合后，电泳条带与单纯DNA样品相比均有所滞后，而与VEGF121结合后电泳条带位置不变，证明这些适体分子均能够特异性识别和结合配体蛋白VEGF165，而不识别与结合非靶蛋白VEGF121。
3. 5细胞内生物功能检测
采用人脐静脉上皮细胞(HUVEC)组织因子(TF)表达量阻抑实验进行验证 VEGF165可促进人组织因子(TF)因子的表达，抗VEGF165适体在体内与之结合后，则阻抑了 TF因子表达量的升高。
HUVEC用含I %血清的1640培养基培养4h，然后分别加入不同浓度的VEGF165(购自北京义翘神州生物技术有限公司，北京)处理I. Oh (0. 172nM，0. 328nM，0. 626nM，I. 25nM，2.39nM)，用未做任何处理的HUVEC作为阴性对照。总RNA的提取采用Trizo法进行。人组织因子(TF)因子的mRNA表达水平用实时定量突光PCR(StepOne Plus,Applied Biosystems, 美国)法检测和分析。反应体系20 ii L :1. OXPCR反应混合液(北京庄盟生物，北京；包含DNA聚合酶，SYBRGreen I染料，dNTPs,反应缓冲液等),0. 2pmol的TFpF, 0. 2pmol的 TFpF(由生工生物工程(上海)有限公司合成，上海)，双蒸水补足20 yL。内参为GAPDH基因，数据采用StepOne Software v2. I软件分析，TF的mNRA表达水平相对未处理样品做了标准化。结果如图7A，图7为本发明实施例VEGF165与抗VEGF165适体对TF mRNA表达量作用的实时荧光定量PCR分析结果。图7采用的是相对表达量分析模型。其中图7A为不同浓度VEGF165对人组织因子(TF)表达量作用结果，其中VEGF165浓度为626pM时对TF 表达量的促进作用最大(图7A中圆圈标识)。
VEGF165在626pM时对TF因子mRNA的表达具有最大促进效果，本发明即在此浓度下验证环状适体在细胞内生物活性。
HUVEC细胞用含1%血清的1640培养基培养4h，然后加入626pMVEGF165，接着加入不同浓度的线性适体(V5aE+，3. 0nm-48nM)和环状适体(cV5aE+，3. 0nM_48nM)，作用lh， 采用未做任何处理的HUVEC作为阴性对照。总RNA的提取采用Trizol法进行。TF mRNA表达水平用实时定量荧光PCR(St印One )检测和分析，反应体系20 y L :1. OXPCR反应混合液 (购于北京庄盟生物，北京)，0.2pmol的TFpF，0.2pmol的TFpF，双蒸水补足20 y L。内参为GAPDH基因，数据采用St印One Software v2. I软件分析，TF mNRA表达水平相对未处理样品做了标准化。结果如图7B，图7B为线性和环状DNA适体通过与VEGF165结合抑制了其对TF因子mRNA表达量的作用。椭圆标识的是cV5aE+适体分子对TF因子mRNA表达具有最大抑制效果的浓度，为6nM ;正圆标识的是线性适体V5aE+对TF因子mRNA表达具有最大抑制效果的浓度，为12nM。虚线椭圆标识的是未加适体分子，仅加626pM VEGF165时TF因子mRNA的表达量。结果表明环化修饰后的适体仍然保留了生物学活性，且较未环化线性适体生物学活性有所提高(提高约I倍)。
权利要求
1.一种抗肿瘤血管生成的适体分子，其特征在于，其序列为5' -ACTTCCAGTCTATTC AATTGGGCCCGTCCGTATGGTGGGTGTGCGTGGCCACGAGTTTTAAAAAAAAAAACCAAGCTTTTTTTTGATCATG T-3/ ;该适体分子(V5aE+)在离适体分子与靶分子抗VEGF165特异结合的核心茎环区域较远的位置插入一个AT接头和一个核酸酶作用位点，其中AT接头中A和T碱基的数目分别是8个；酶作用位点包含DNA连接酶酶连位点以及DNA内切酶(RsaI)酶切位点，位置在核心茎环区域与AT接头之间，环化修饰的分子可通过环到环循环反应大量制备，环化效率通过实时荧光定量RCA检测。
2.一种如权利要求I所述的抗肿瘤血管生成的适体分子的制备方法，其特征在于包括如下步骤首先对环化适体分子V5aE+进行磷酸化和环化反应，然后进入环到环循环反应； 每次环到环循环反应经历两轮反应，每轮反应依次为滚环扩增反应、酶切反应和环化反应。
3.如权利要求2所述的一种抗肿瘤血管生成的适体分子的制备方法，特征在于所述的环化反应使用的酶连辅助序列 LV5aE+5' -CCCAATTGAATAGACTGGAAGTACATGATCAAAAAAAA GCT-3 ';或酶连辅助序列 LV5aE-为 5 ' -AGCTTTTTTTTGATCATGTACTTCCAGTCTATTCAATTGG G-3'。
4.如权利要求2所述的一种抗肿瘤血管生成的适体分子的制备方法，其特征在于所述的滚环扩增反应使用的引物序列即酶连辅助序列LV5aE+为5' -CCCAATTGAATAGACTGGA AGTACATGATCAAAAAAAAGCT-3';或酶连辅助序列 LV5aE_ 为5' -AGCTTTTTTTTGATCATGTACT TCCAGTCTATTCAATTGGG-3'。
5.如权利要求2所述的一种抗肿瘤血管生成的适体分子的制备方法，其特征在于所述的酶切反应使用的酶切辅助序列DV5aE+为5' -GAATAGACTGGAAGTACATGATC-3';或酶切辅助序列 DV5aE-:5' -GATCATGTACTTCCAGTCTATTC-3'。
6.如权利要求2或3所述的一种抗肿瘤血管生成的适体分子的制备方法，其特征在于所述的环化反应条件为将I份待环化的磷酸化线性适体与1-5份酶连辅助序列混合，在 Taq DNA连接酶缓冲液中，95°C孵育5分钟，然后缓慢冷却到室温；加入Taq DNA连接酶， 94°C孵育4分钟；然后按照以下程序完成15个循环94°C 30秒，45°C 5分钟；最后95°C 15 分钟灭活Taq DNA连接酶；未环化的DNA产物用exol+exolll降解上述环化反应产物混合物，加入Exo I和Exo III，37°C孵育30分钟，80°C孵育5分钟灭活外切酶，得到环化DNA 适体分子。
7.如权利要求2或4所述的一种抗肿瘤血管生成的适体分子的制备方法，其特征在于所述的滚环扩增的反应条件为将I份环化DNA分子与10-1000份的酶连辅助序列混合，加入到Bst DNA聚合酶缓冲液中，再加入2百万份dNTPs，再加入Bst DNA聚合酶，65°C 120分钟；80°C孵育20分钟灭活Bst DNA聚合酶。
8.如权利要求2或5所述的一种抗肿瘤血管生成的适体分子的制备方法，其特征在于所述的酶切反应的反应条件为将I份RCA产物与10万份酶切辅助序列加入到RsaI内切酶缓冲液中，再加入RsaI限制性内切酶，37°C孵育3. 0小时；65°C 20分钟灭活RsaI内切酶。
全文摘要
本发明公开了一种抗肿瘤血管生成的适体分子，其特征在于其序列为5′-ACTTCCAGTCTATTCAATTGGGCCCGTCCGTATGGTGGGTGTGCGTGGCCACGAGTTTTAAAAAAAAAAACCAAGCTTTTTTTTGATCATGT-3′及其制备方法。本发明建立了针对线性DNA适体分子进行环化修饰设计和制备的方法流程，通过改进的RCA反应产生环状DNA适体分子，建立了可高效快速和低成本地制备环状DNA适体的方法。
文档编号C12N15/115GK102533771SQ201110375859
公开日2012年7月4日 申请日期2011年11月22日 优先权日2011年11月22日
发明者刁勇, 杨丽, 杨会勇, 林俊生 申请人:华侨大学