一种抗肿瘤血管生成的中药复方及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗肿瘤血管生成的中药复方，由下列重量配比的原料药制成：党参18-22份、黄芪28-32份、茯苓18-22份、炒白术13-17份、肉豆蔻13-17份、八月札13-17份、沙棘13-17份、苦豆子8-12份、红豆杉4-8份。本发明提供的中药复方采用科学配比，各组分之间能相互协调、相互促进，协同增效，固扶正气、补血益阴，明显起到抗肿瘤血管生成的作用。
【专利说明】一种抗肿瘤血管生成的中药复方及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及中医药领域，尤其涉及一种抗肿瘤血管生成的中药复方及其应用。
【背景技术】
[0002]在正常生理情况下，新生血管的生成仅见于妊娠、女性月经期、创伤修复等生理过程中，但在肿瘤的发展、转移和恶化的进程中，血管新生也成为一个重要的环节。肿瘤血管生成(Angiogenesis)指肿瘤细胞诱导的微血管持续、失控性生长和肿瘤血液循环建立的过程，包括毛细血管基底膜降解，血管内皮细胞迁移、增殖，形成管状结构，基底膜形成以及血液贯通诸多环节。目前研究表明，在新生肿瘤形成期间，当肿瘤直径大于I~2 mm3时，必须有新生血管为其提供氧气和营养并带走代谢产物，否则肿瘤的生长将处于休眠状态。肿瘤的侵袭和转移都必须有肿瘤血管形成。大量研究证实，肿瘤新生血管的形成是血管生成调节因子相互作用的结果。目前已经分离和纯化了多种血管生长因子和相关因子，近年研究较多的有血管内皮生长因子VEGF、转化生长因子TGF、成纤维细胞生长因子FGF等。
[0003]VEGF是肿瘤血管生成最关键的刺激因子。VEGF的表达与新生血管发生的时间、空间均密切相关。VEGF在肿瘤血管新生中的决定性作用也已通过动物试验得以证实，中和VEGF抗体和VEGF受体的动物体上，血管新生以及肿瘤的生长均受到明显抑制。另外，在内皮细胞培养试验中，VEGF对内皮细胞的作用包括:增殖、迁移、生存率的影响和基质分解酶的分泌。在肿瘤形成的过程中必然有新生血管的形成，而新生血管的形成必然存在VEGF的过表达。临床研究已证实，在转移率、死亡率上，VEGF高表达的肿瘤患者明显高于VEGF低表达的肿瘤患者。
[0004]近年来，寻找抗肿瘤血管生成的药物，特别是从天然植物中寻找，已经成为了近年来世界上许多科学家研究的热点。现代中医肿瘤转移学说“痰毒流注”认为:肿瘤转移是因为痰毒流注，络损血瘀而造成，`流注于肝为肝积，流注于肺成肺积，流注于骨为骨岩，流注于经络而成瘰疠。肿瘤患者本身由于正气亏损，痰湿内生，善于流窜的痰湿与肿瘤邪毒互结，痰毒流注脏腑脉络(肺络、肝络、脾络、肾络、心包络、少阳络等)。络脉损伤，气血离经，易而为瘀，致使转移。肿瘤的转移主要是以脏腑虚损为本，痰毒损络成瘀为标，其有似于淋巴转移。近年来，中医针对肿瘤侵袭转移越来越受到重视，提高机体的正气或抗癌力，对防止肿瘤转移及长期存活至关重要，癌毒易耗正气，常造成病人气血阴阳耗损，或五脏功能衰竭，如果再用单纯攻伐的中西药物治疗，则易使已虚的正气更虚，抗癌力进一步下降，更易导致残存的癌毒复发和转移。完好的人的机体免疫力可以清除绝大部分恶性肿瘤，并且能有效抑制肿瘤的远处转移，从而相对的提高患者的生存率。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的问题是，提供一种抗肿瘤血管生成的中药复方。
[0006]本发明所要解决的第二个问题是，提供上述中药复方的制备方法。
[0007]本发明所要解决的第三个问题是，提供上述中药复方在制备抗肿瘤血管生成药物中的应用。
[0008]为了解决上述第一个问题，本发明提供了一种抗肿瘤血管生成的中药复方，所述中药复方由下列重量配比的原料药制成:
党参18-22份、黄芪28-32份、茯苓18-22份、炒白术13-17份、肉豆蘧13-17份、八月札13-17份、沙棘13-17份、苦豆子8-12份、红豆杉4_8份。
[0009]作为一个优选方案，所述原料药重量配比为:
党参20份、黄芪30份、茯苓20份、炒白术15份、肉豆蘧15份、八月札15份、沙棘15份、苦豆子10份、红豆杉6份。
[0010]为了解决上述第二个问题，本发明提供了上述抗肿瘤血管生成的中药复方的制备方法，按配比(党参18-22份、黄芪28-32份、茯苓18-22份、炒白术13-17份、肉豆蘧13-17份、八月札13-17份、沙棘13-17份、苦豆子8-12份、红豆杉4_8份，优选党参20份、黄芪30份、茯苓20份、炒白术15份、肉豆蘧15份、八月札15份、沙棘15份、苦豆子10份、红豆杉6份)称取饮片,加8倍体积的75%乙醇，回流提取煎煮2次，每次I h，将煎液合并后离心、浓缩、干燥至干品即得中药复方醇提物。
[0011]为了解决上述第三个问题，本发明提供了上述中药复方在制备抗肿瘤血管生成药物中的应用。
[0012]作为一个优选方案，所述药物包括将所述中药复方与药学上可接受的载体结合制成的各种剂型的药物，所述剂型为片剂、胶囊剂或颗粒剂。 [0013]作为一个优选方案，所述肿瘤是结肠癌。
[0014]本发明的优点在于，本发明提供的中药复方采用科学配比，各组分之间能相互协调、相互促进，协同增效，固扶正气、补血益阴，明显起到抗肿瘤血管生成的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为细胞划痕实验结果，其中Control组为HCTl 16细胞；L_YQFS (8mg/mL)为低剂量的益气复生方；M-YQFS(16mg/mL)为中剂量的益气复生方；H_YQFS (32mg/mL)为高剂量的益气复生方。
[0016]图2为ELISA实验结果，其中Control组为HCTl 16细胞；L_YQFS (8mg/mL)为低剂量的益气复生方；M-YQFS(16mg/mL)为中剂量的益气复生方；H_YQFS(32mg/mL)为高剂量的
益气复生方。
[0017]图3为体内实验结果，其中Control组为模型组；L_YQFS(200 mg/kg*d)为低剂量的益气复生方；M-YQFS(400 mg/kg*d)为中剂量的益气复生方；H_YQFS(800 mg/kg*d)为高剂量的益气复生方；阳性对照组(control)是5-FU组。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0019]实施例:复方醇提物的制备及抗肿瘤血管生成验证
1.中药复生方醇提物的制备中药复方(益气复生方)的制备按比例(党参18-22份、黄芪28-32份、茯苓18-22份、炒白术13-17份、肉豆蘧13-17份、八月札13-17份、沙棘13-17份、苦豆子8-12份、红豆杉
4-8份)称取一定量的饮片，加8倍体积的75%乙醇，回流提取煎煮2次，每次I h，将煎液合并后离心、浓缩、干燥至干品即得中药复生方醇提物。所述中药复生方醇提物得率为Ig生药/0.214g醇提物。实验前称取适量醇提物干粉，经涡旋、超声、水浴等方法使其充分溶解于RPMI 1640培养基后，0.22 μ m滤器过滤并配制成所需浓度的溶液，4°C保存备用。
[0020]原料药优选以下配比:党参20份、黄芪30份、茯苓20份、炒白术15份、肉豆蘧15份、八月札15份、沙棘15份、苦豆子10份、红豆杉6份。
[0021]2.细胞培养
人结肠癌HCT-116于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液(含青霉素、链霉素各100 (U /mL)中，37°C、5% CO2、饱和湿度培养箱中常规培养。
[0022]3.细胞划痕实验
I)首先将所需器械灭菌，而直尺及marker笔需要在操作前在超净台中紫外照射30min,实验前用marker笔在6孔板后方以直尺均匀划横线,横线间距约0.5~lcm,每孔间划5条横线。
[0023]2)细胞培养:取对数生长期的HCT-116细胞，分别加入高(32mg/mL)、中(16mg/mL)、低(8mg/mL)三种剂量的益气复生方，同时设阳性对照组(HCT-116组)，按照实验分组铺6孔板,37 °C孵育。
[0024]3) 24h后以10微升的枪头比着直尺在培养板空能划痕，保持垂直。然后用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞。放入37°C 5% CO2培养箱，培养。
[0025]4)按照0h、24h取样拍照。
[0026]图1为益气复生方对人结肠癌HCT-116细胞细胞迁移的影响。经过划痕处理，随时间延长，HCT-116肠癌细胞逐渐向痕迹内部生长、迁移，益气复生方低剂量作用24 h后，横线间距变为230 μ m,中剂量横线间距变为280 μ m,高剂量横线间距变为420 μ m，均比O h检测到的迁移细胞数多。但是与对照组(control)相比，差异明显。结果提示:益气复生方可以抑制人结肠癌HCT-116细胞的迁移。
[0027]4.ELISA 实验 (I)试剂:
1)PBS:1% BSA ；
2)PBS:2% BSA ；
3)碳酸盐缓冲液:
4)1.59g Na2CO3 ；
5)2.93g NaHCO3 ；
6)溶解于900ml双蒸水中，检测并调整pH至9.6，定容至IL ;
7)IOX 底物液，pH6.0 ;
8)36.6g 一水合柠檬酸；
9)113.5g磷酸氢二钾；
10)溶解于900mL双蒸水中，调pH至6.0，定容至IL ；
11)0.3% H202:用双蒸水按1:100稀释30%的双氧水；12)OPD贮存液，4.0%:4g OPD溶解于100ml双蒸水，分装后保存到_20 C，注意避光；
13)4.5N H2S04 ；
14)12.0mL 浓硫酸;
15)88.0ml双蒸水混合。
[0028](2)福尔马林固定细胞:
1)用胰蛋白酶消化细胞培养瓶中的细胞；
2)收集细胞并计数；
3)离心，1500rpm,IOmin ；
4)用完全培养基重悬细胞于适当的浓度；
5)上皮细胞4X 105个细胞/ml ；
6)纤维细胞2X 105个细胞/ml ;
7)滴加到96孔培养板中，1OOul/孔；
8)6、37C环境孵育过夜；
9)用PBS洗板两次；
10)每孔加125ul10%福尔马林缓冲液；
11)于室温环境下固定15min；
12)用双蒸水洗涤三次；
13)晾干；
14)贮存于2-8°C。
[0029](3)实验步骤:
1、用双蒸水洗涤ELISA板两次；
2、每孔加250ul ^ 2% BSA 的 PBS ；
3,37° C 孵育 Ih;
4、双蒸水洗板三次；
5、每孔加50ul腹水，上清，或用含1%BSA的PBS稀释后稀释品；
6,37° C 孵育 2h;
7、双蒸水洗板五次；
8、每孔加50ul用含1%BSA的PBS稀释的HRP酶标抗鼠IgG ；
9,37° C 孵育 Ih;
10、用双蒸水洗板5次。用碳酸盐缓冲液洗两次；
11、加工作浓度底物液50ul/孔，配方如下:
0.5ml 4.0% OPD
5ul 30% H2O2
1.0 ml IOX底物缓冲液
8.5ml双蒸水；
12、在室温下孵育20min；
13、加4.5 ul硫酸溶液25ul/孔；
14、在酶标仪上测0D490波长的值。
[0030]图2为益气复生方对人结肠癌HCT-116细胞分泌VEGF的影响。ELISA检测结果显示，与空白对照组的1927.10pg/mL相比，不同剂量的益气复生方组对HCT-116细胞的VEGF蛋白分泌水平均有不同程度的降低，高剂量的益气复生方将VEGF蛋白分泌水平降至851.25pg/mL，差异有统计意义0°〈0.05)。结果提示:益气复生方可以抑制人结肠癌HCT-116细胞内VEGF的分泌。
[0031]5.动物实验
取对数生长的人肠癌HCT-116细胞，以5X IO6/只数量接种于小鼠腋下。7-10d后形成肿瘤，生长旺盛期的瘤组织剪切成I _3左右，在无菌条件下，接种于小鼠右侧腋窝皮下，如此传3代后，大批接种裸鼠腋下，待瘤体生长约IOOmm3随机分为5组，每组8只，分别为模型组，阳性对照(5-FU)组，益气复生方低、中、高剂量组。益气复生方低、中、高剂量组分别灌胃给予200、400、800 mg/(kg*d) ;5_FU组尾静脉注射0.5 mg/(kg*d)的
5-FU，每只0.2mL,隔天注射；模型组每天注射等量的生理盐水，每隔三天测量肿瘤的长和宽。连续给药12 d后，以颈椎脱白法处死，剥离肿瘤组织，称重，测量肿瘤长、宽及质量后，计算瘤体体积。肿瘤瘤体体积换算公式:V= /6X [(A+B)/2]3，其中A为肿瘤的长，B为肿瘤的宽。
[0032]图3为体内实验结果，肠癌皮下移植瘤小鼠造模7 d后，游标卡尺测量给药前各组小鼠肿瘤体积大小，各组之间无明显差异经灌胃给予不同浓度的益气复生方后，各组均有不同程度的抑制作用。用药第19天时，模型组(control)瘤体大小为997.89±85.36 mm3，益气复生方低、中、高剂量的瘤体大小分别为821.61±20.87 mm3、780.74±94.98 mm3及490.24±60.35 mm3，化疗阳性对照组(5-FU)瘤体大小为450.01 ±49.35 mm3。与模型组相t匕，各给药组瘤体大小均不同程度的减小，差异具有统计学意义0°〈0.05)。结果提示:益气复生方可有效抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，随着益气复生方剂量的增加，对皮下移植瘤的抑制作用呈剂量依赖性。
[0033]临床用药结果显示，肿瘤患者服用益气复生方后，肿瘤病灶、临床证侯、生存质量、癌胚抗原、自然杀伤细胞活性等指标均有所改善，综合体现为患者康复较快，住院时间缩短。
[0034]主要表现为，益气复生方应用于气虚患者后，患者面色无华，少气懒言，语声低微，疲倦乏力，自汗，食欲减退症状得以改善；益气复生方应用于血虚患者后，患者面色苍白、萎黄无华，唇色淡白，头晕眼花，心悸失眠，手足麻木症状得到改善；益气复生方应用于阴虚患者后，患者午后潮热，盗汗，咽干口燥，手足心热，小便黄赤等症状得以改善；益气复生方应用于阳虚患者后，患者形寒肢冷，面色淡白，神疲乏力，自汗，口淡不渴，小便清长，大便稀溏症状得以改善；益气复生方应用于气滞血瘀患者后，患者面色黧黑，唇甲青紫，肌肤甲错，舌质紫暗症状得以改善等症状得以改善；益气复生方应用于痰饮内停患者后，患者咳嗽，咯痰，胸闷腹胀，恶心欲吐，四肢困乏或肿胀，肿块或淋巴结肿大等症状得以改善；益气复生方应用于热毒炽盛患者后，患者口渴尿赤，便秘等症状得以改善。
[0035]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种抗肿瘤血管生成的中药复方，其特征在于，所述中药复方由下列重量配比的原料药制成: 党参18-22份、黄芪28-32份、茯苓18-22份、炒白术13-17份、肉豆蘧13-17份、八月札13-17份、沙棘13-17份、苦豆子8-12份、红豆杉4_8份。
2.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤血管生成的中药复方，其特征在于，所述原料药重量配比为: 党参20份、黄芪30份、茯苓20份、炒白术15份、肉豆蘧15份、八月札15份、沙棘15份、苦豆子10份、红豆杉6份。
3.权利要求1所述抗肿瘤血管生成的中药复方的制备方法，其特征在于，按权利要求1的配比称取饮片,加8倍体积的75%乙醇，回流提取煎煮2次，每次I h，将煎液合并后离心、浓缩、干燥至干品即得中药复方醇提物。
4.权利要求1所述中药复方在制备抗肿瘤血管生成药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物包括将所述中药复方与药学上可接受的载体结合制成的各种剂型的药物，所述剂型为片剂、胶囊剂或颗粒剂。
6.根据权利要求·4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是结肠癌。
【文档编号】A61P35/00GK103845393SQ201210508101
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月3日 优先权日:2012年12月3日
【发明者】邓皖利, 陆明, 吕书勤, 段春燕, 王巧琳, 何娜娜, 任小娟, 林燕, 马金丽, 吴涛, 李晶洁, 朱蕾, 梁泰 申请人:新疆维吾尔自治区中医医院