电激转化法选育高温型阿魏菇的方法
【专利摘要】本发明涉及食用菌品种培育【技术领域】，是一种电激转化法选育高温型阿魏菇的方法，其包括第一步阿魏菇原生质体制备及再生体系的建立、第二步外源基因的获得、第三步电激法将外源基因导入阿魏菇原生质体、第四步筛选优良再生菌株、第五步转化子的鉴定。与现有技术相比，本发明获得了生长速度快、不需低温刺激仍能正常出菇的高温型阿魏菇新种质，其出菇温度为温度白天25℃，夜间17℃，并且出菇时间提前了30天。在经济效益上，该发明有效地改良了阿魏菇的品质，不仅缩短了生长周期、节约了栽培成本，而且可以开展反季节生产，真正为种植农户增收添砖加瓦。
【专利说明】电激转化法选育高温型阿魏菇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及食用菌品种培育【技术领域】，是一种电激转化法选育高温型阿魏菇的方法。
【背景技术】
[0002]阿魏菇(Wmr0ferulae)中文学名为准噶尔阿魏侧耳，是一种低温型菇类，要求空气新鲜，适宜冬暖夏凉地域的潮湿环境栽培。菌丝生长的最适温度为25°C至28°C，在35°C至36°C时菌丝停止生长。阿魏菇子实体分化温度在0°C至15°C，子实体在5°C至18°C均可生长，以在13°C至15°C时生长较快且菇质好。阿魏菇必须经过低温刺激才能通过生理成熟，否则难以出菇。阿魏菇菌丝生3段养料含水量应在60%至70%。子实体生长发育时要求空气相对湿度保持在85%至95%。目前，除新疆、北京外，国内其它地方也有栽培。但由于阿魏菇是一种中低温型食用菌。胡清秀提出充分发菌后的菌袋于4°C低温处理数天再进行出菇管理，否则必须经过2个月以上的菌丝后熟才能出菇。菌丝满袋后仍需要30天至40天后熟培养才能进行催蕾出菇。由此可见，阿魏菇原基的形成需要低温刺激的作用，如果阿魏菇不通过低温(春化阶段)处理，会造成出菇率低，很少能同时出菇。乌鲁木齐周边阿魏菇种植户每年因要对阿魏菇进行低温刺激，把阿魏菇菌袋运至天山冰川生产。这都给人工栽培带来了更多的资金投入和生产难度。
【发明内容】
[0003]本发明提供了一种电激 转化法选育高温型阿魏菇的方法，克服了上述现有技术存在的问题，其不但可开展反季节生产，而且能够有效的缩短常规阿魏菇栽培的生成周期，降低生产成本。
[0004]本发明的技术方案是通过以下措施来实现的:一种电激转化法选育高温型阿魏菇的方法，其特征在于按下述步骤进行:
第一步，阿魏菇原生质体制备及再生体系的建立:对选取的阿魏菇进行接种，进一步扩大培养菇种；采用酶解法制备原生质体，获得较纯的原生质体后，镜检，用血球计数板计数；其最佳制备原生质体的条件为:在0.6 mol/L KCl稳渗剂条件下，菌龄为8天的阿魏菇菌丝体0.1 g在0.8 ml混合酶解液中制备原生质体,该混合酶解液为含1.5%离析酶、0.5%纤维素酶、2%溶菌酶的水溶液，35 °C酶解3 h获得原生质体达5X IO6个/ml，涂布于原生质体再生培养基上，其最佳条件为:在0.8 mol/L蔗糖稳渗剂下，原生质体再生时间为16天，其再生率可达0.6% ；
第二步，外源基因的获得，提取平菇总DNA:称取平菇子实体放入已冷冻的研钵中，加入2%的PVP，倒入适量液氮，研磨材料，然后加入ImlCTAB混合，该CTAB为含DTT50 μ L /ml的水溶液；倒入已加入100 μ L氯仿/辛醇的EP管中；晃动EP管，放入65°C水浴锅中30min，接着室温放置15min ；EP管中加氯仿/辛醇到1.5mL，轻轻混匀，13000rpm离心7min ;取上清液放入干净EP管中，加入冰的无水乙醇；样品放在冰上或-20°C，不要晃动，最后出现絮状沉淀；13000rpm离心7min ;弃去上清液，75%酒精/0.2M NaAc ImL洗涤沉淀2次，醇挥发后放入加无菌水和RNA酶，溶解，_20°C保存备用；用0.8%琼脂糖电泳检测DNA的纯度；用分光光度计对DNA进行紫外扫描，测260nm、280nm的吸收值，计算出DNA的浓度，最后用无菌水把DNA浓度稀释到I U g/ U L ;
第三歩，电激法将外源基因导入阿魏菇原生质体:用lmol/L的山梨醇将纯化的原生质体稀释至2X IO5个/ml置于42°C浮浴5min，再向低温处理过的2mL的电激杯加入300 u L的原生质体溶液和20 ii L平菇DNA，采用ECM630电激系统，在1600V条件下电激，取出电激杯冰浴静止10分钟至15分钟，涂布于原生质体再生培养基上，25°C黑暗培养，2周后，将出现的菌落进行筛选实验；
第四歩，筛选优良再生菌株:将第三步获得的菌落、未电激的阿魏菇菌丝和平菇菌丝进行生长临界温度筛选实验；未电激的阿魏菇菌丝在32°C时菌丝停止生长甚至死亡，平菇在32°C时菌丝能正常生长，并且第三中的菌落同样能够生长，筛选出能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株；将能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株继续培养，測定生长速度，将生长速度明显高于受体菌株的再进行复筛；培养6天至7天，分别对单菌落进行镜检，有锁状联合特征的菌株视为ー个转化子；
第五步，转化子的鉴定:1)酯酶同エ酶分析采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法；2)纤维素酶活力测定采用3，5- 二硝基水杨酸法；3) RAPD分析；最終，确定含有外源平菇DNA插入的转化子，得到高温型阿魏菇菌株。
[0005]对上述本发明的技术方案进ー步进行如下的选择或/和优化:
将上述高温型阿魏菇菌株在白天温度为25°C、夜间温度为17°C的现有公知的阿魏菇生长环境中进行出菇试验，90天能正常出菇。
[0006]本发明的积极效果 是:与现有技术相比，本发明首先建立了高效的阿魏菇原生质体制备与再生体系，为植物的分子修饰提供良好的受体；同时，建立了电激法遗传转化体系，其操作简单方便，没有化学物质对原生质体的伤害，确保了外源基因的整合，使得转基因株系具有优良的生物学特性；经过临界生长温度的筛选，并结合分子生物学检测手段，有效验证了外源基因的整合，获得了生长速度快，不需低温刺激仍能正常出菇的高温型阿魏菇新种质，其出菇温度为温度白天25°C，夜间17°C，并且出菇时间提前了 30天。在经济效益上，该发明有效地改良了阿魏菇的品质，不仅缩短了生长周期、节约了栽培成本，而且可以开展反季节生产，真正为种植农户增收添砖加瓦。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]附图1是本发明的工作原理图。
[0008]附图2是制备的阿魏菇原生质体。此图为阿魏菇菌丝酶解后获得原生质体形态图，图中阿魏菇原生质体体积较大，数目多，有利原生质体的收集，为电激转化奠定基础。
[0009]附图3是再生的阿魏菇菌丝。经过酶解的原生质体，其细胞壁都受到不同程度的破坏，将其涂布于含有稳定剂的再生培养基中，有效维持了原生质体内部滲透压的稳定性，使得原生质体得以较好的恢复，为后期转基因株系的筛选提供物质保障。
[0010]附图4是获得的优良转化菌株。转化菌株与野生型菌株生长速度的对比，转化菌株的生长速度是野生型菌株生长速度的3-4倍。[0011]附图5是优良菌株的出菇结果图。转化菌株与野生型菌株出菇实验对比，两者之间在形态上无差异。
【具体实施方式】
[0012]本发明不受下述实施例的限制，可依据本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。 [0013]下面结合实施例对本发明作进一步描述。
[0014]实施例1，如附图1至5所示，该电激转化法选育高温型阿魏菇的方法按下述步骤进行:
第一步，阿魏菇原生质体制备及再生体系的建立:对选取的阿魏菇进行接种，进一步扩大培养菇种；采用酶解法制备原生质体，获得较纯的原生质体后，镜检，用血球计数板计数；其最佳制备原生质体的条件为:在0.6 mol/L KCl稳渗剂条件下，菌龄为8天的阿魏菇菌丝体0.1 g在0.8 ml混合酶解液中制备原生质体,该混合酶解液为含1.5%离析酶、0.5%纤维素酶、2%溶菌酶的水溶液，35 °C酶解3 h获得原生质体达5X IO6个/ml，涂布于原生质体再生培养基上，其最佳条件为:在0.8 mol/L蔗糖稳渗剂下，原生质体再生时间为16天，其再生率可达0.6% ；以上阿魏菇原生质体制备与再生体系的建立，为后期电激转化提供了坚实基础；
第二步，外源基因的获得，提取平菇总DNA:称取平菇子实体放入已冷冻的研钵中，加入2%的PVP，倒入适量液氮，研磨材料，然后加入ImlCTAB (含DTT50 μ L /ml现用现配已配好DTT1M)混合，该CTAB为含DTT50 μ L /ml的水溶液；倒入已加入100 μ L氯仿/辛醇的EP管中；晃动EP管，放入65°C水浴锅中30min，接着室温放置15min ;EP管中加氯仿/辛醇到1.5mL,轻轻混匀，13000rpm离心7min ;取上清液放入干净EP管中，加入冰的无水乙醇；样品放在冰上或_20°C，不要晃动，最后出现絮状沉淀；13000rpm离心7min，弃去上清液，75%酒精/0.2M NaAc ImL洗涤沉淀2次，醇挥发后放入加无菌水和RNA酶，溶解，_20°C保存备用；用0.8%琼脂糖电泳检测DNA的纯度；用分光光度计对DNA进行紫外扫描，测260nm、280nm的吸收值，计算出DNA的浓度，最后用无菌水把DNA浓度稀释到I μ g/M I;
第三步，电激法将外源基因导入阿魏菇原生质体:用lmol/L的山梨醇将纯化的原生质体稀释至2X IO5个/ml置于42°C浮浴5min，再向低温处理过的2mL的电激杯加入300 μ L的原生质体溶液和20 μ L平菇DNA，采用ECM630电激系统，在1600V条件下电激，取出电激杯冰浴静止10分钟至15分钟，涂布于原生质体再生培养基上，25°C黑暗培养，2周后，将出现的菌落进行筛选实验；
第四步，筛选优良再生菌株:将第三步获得的菌落、未电激的阿魏菇菌丝和平菇菌丝进行生长临界温度筛选实验；未电激的阿魏菇菌丝在32°C时菌丝停止生长甚至死亡，平菇在32°C时菌丝能正常生长，并且第三中的菌落同样能够生长，筛选出能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株；将能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株继续培养，测定生长速度，将生长速度明显高于受体菌株的再进行复筛；培养6天至7天，分别对单菌落进行镜检，有锁状联合特征的菌株视为一个转化子；
第五步，转化子的鉴定:1)酯酶同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法；2)纤维素酶活力测定采用3，5- 二硝基水杨酸法；3) RAPD分析；最终，确定含有外源平菇DNA插入的转化子，得到高温型阿魏菇菌株。
[0015]实施例2，与实施例1的不同之处在于:将上述实施例1所得的高温型阿魏菇菌株在白天温度为25°C、夜间温度为17°C的现有公知的阿魏菇生长环境中进行出菇试验(与现有公知的阿魏菇生产方法相同)，使出菇时间提前30天，由120天提前到90天。其中进棚到原基出现15天左右,幼燕到成燕5-7天。
[0016]本 发明中:除另有规定外，百分比％的单位都为质量百分比。
【权利要求】
1.ー种电激转化法选育高温型阿魏菇的方法，其特征在于按下述步骤进行: 第一歩，阿魏菇原生质体制备及再生体系的建立:对选取的阿魏菇进行接种，进ー步扩大培养菇种；采用酶解法制备原生质体，获得较纯的原生质体后，镜检，用血球计数板计数；其最佳制备原生质体的条件为:在0.6 mol/L KCl稳渗剂条件下，菌龄为8天的阿魏菇菌丝体0.1 g在0.8 ml混合酶解液中制备原生质体,该混合酶解液为含1.5%离析酶、0.5%纤维素酶、2%溶菌酶的水溶液，35で酶解3 h获得原生质体达5X IO6个/ml，涂布于原生质体再生培养基上，其最佳条件为:在0.8 mol/L蔗糖稳渗剂下，原生质体再生时间为16天，其再生率可达0.6% ； 第二步，外源基因的获得，提取平菇总DNA:称取平菇子实体放入已冷冻的研钵中，カロ入2%的PVP，倒入适量液氮，研磨材料，然后加入ImlCTAB混合，该CTAB为含DTT50 u L /ml的水溶液；倒入已加入100 ii L氯仿/辛醇的EP管中；晃动EP管，放入65 °C水浴锅中30min，接着室温放置15min ；EP管中加氯仿/辛醇到1.5mL,轻轻混匀，13000rpm离心7min ;取上清液放入干净EP管中，加入冰的无水こ醇；样品放在冰上或-20°C，不要晃动，最后出现絮状沉淀；13000rpm离心7min ;弃去上清液，75%酒精/0.2M NaAc ImL洗涤沉淀2次，醇挥发后放入加无菌水和RNA酶，溶解，_20°C保存备用；用0.8%琼脂糖电泳检测DNA的纯度；用分光光度计对DNA进行紫外扫描，测260nm、280nm的吸收值，计算出DNA的浓度，最后用无菌水把DNA浓度稀释到I U g/ U L ; 第三歩，电激法将外源基因导入阿魏菇原生质体:用lmol/L的山梨醇将纯化的原生质体稀释至2X IO5个/ml置于42°C浮浴5min，再向低温处理过的2mL的电激杯加入300 u L的原生质体溶液和20 ii L 平菇DNA，采用ECM630电激系统，在1600V条件下电激，取出电激杯冰浴静止10分钟至15分钟，涂布于原生质体再生培养基上，25°C黑暗培养，2周后，将出现的菌落进行筛选实验； 第四歩，筛选优良再生菌株:将第三步获得的菌落、未电激的阿魏菇菌丝和平菇菌丝进行生长临界温度筛选实验；未电激的阿魏菇菌丝在32°C时菌丝停止生长甚至死亡，平菇在32°C时菌丝能正常生长，并且第三中的菌落同样能够生长，筛选出能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株；将能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株继续培养，測定生长速度，将生长速度明显高于受体菌株的再进行复筛；培养6天至7天，分别对单菌落进行镜检，有锁状联合特征的菌株视为ー个转化子； 第五步，转化子的鉴定:1)酯酶同エ酶分析采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法；2)纤维素酶活力测定采用3，5- 二硝基水杨酸法；3) RAPD分析；最終，确定含有外源平菇DNA插入的转化子，得到高温型阿魏菇菌株。
2.根据权利要求1所述的电激转化法选育高温型阿魏菇的方法，其特征在于将高温型阿魏菇菌株在白天温度为25°C、夜间温度为17°C的现有公知的阿魏菇生长环境中进行出菇试验，90天能正常出菇。
【文档编号】C12N1/15GK103602599SQ201110398232
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2011年12月5日 优先权日:2011年12月5日
【发明者】曾卫军, 孙艺铎, 祝长青, 曹兴芹, 李学斌, 王勇, 迟庆杰, 刘凤卫 申请人:新疆师范大学, 乌鲁木齐高鑫博渊生物科技有限公司