专利名称：一种具有紫罗兰香气的发酵物及其生产方法与它的用途的制作方法
一种具有紫罗兰香气的发酵物及其生产方法与它的用途技术领域：
本发明涉及微生物发酵技术。更具体地，本发明涉及一种利用解淀粉类芽孢杆菌 (Paenibacillus amylolyticus)发酵生产含有7，8_ 二氢-β -紫罗兰醇发酵物的方法，还涉及根据所述方法制备得到的含有7，8-二氢-β -紫罗兰醇的发酵物及其作为烟用香料的用途。背景技术：
植物花朵、茶叶、葡萄、玫瑰及烟草物质中，普遍存在紫罗兰醇及紫罗兰酮(C13降戊二烯类)等香味衍生物。该类衍生物通常由类胡萝卜素如胡萝卜素、叶黄素、玉米黄素、虾青素等前体物质经过氧化裂变反应生成。在香料工业生产过程中，紫罗兰醇和紫罗兰酮是重要的人工合成香料之一，紫罗兰酮进一步还原可得到紫罗兰醇。根据紫罗兰酮双键位置的变化，主要分α和β两种异构体，两者均具有柏木香味，稀释后具有紫罗兰的香味。 紫罗兰酮的香气甚为优雅、柔和，在化妆品和食品香精中应用很广。此外，紫罗兰酮还广泛应用于烟草、食品及饲料添加剂，是很重要的工业原料。
紫罗兰醇及紫罗兰酮被广泛应用于卷烟行业中。据报道，紫罗兰醇酯类物质在烟燃吸状态下可发生裂解反应，因此在烟气中有一种致香物质——巨豆三烯酮。巨豆三烯酮对卷烟的香气起着重要的作用，已成为评判卷烟优劣的一项重要指标。由此可见，紫罗兰醇等物质的裂解是烟草香味物质形成的重要途径，将该类香气前体物质作为料液直接加到烟草中，可显著改善烟草香气品质。
目前，紫罗兰醇及紫罗兰酮制备方法主要是工业合成法，该方法工业合成收率仅为25 %，且合成原料价格昂贵不易采购。此外，植物提取法设备成本高昂，提取率极低，考虑到紫罗兰醇的工业生成条件、生产成本、原料采购价格等因素，本申请人首次尝试采用微生物发酵法制备一种具有紫罗兰香气的物质，为香精行业提供一种新型烟用香料。
发明内容
[发明要解决的问题]
本发明的目的是提供一种具有紫罗兰香气的发酵物的制备方法。
本发明的另一个目的是提供采用所述生产方法得到的具有紫罗兰香气的发酵物。
本发明的另一个目的是提供所述具有紫罗兰香气的发酵物作为烟用香料的用途
[技术方案]
本发明涉及一种具有紫罗兰香气的发酵物的生产方法。
所述生产方法包括以下步骤
Α、种子培养
使用酵母浸膏、NaCl、葡萄糖、蛋白胨、微量元素液与去离子水制备含有酵母浸膏 4-6g/L、NaCl 25_32g/L、葡萄糖 0. 1-0. 4g/L、蛋白胨 8_15g/L、微量元素液 1. OmL/L 的种子培养基；所述的微量元素液是含有H3BO3 3. Og/L, MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2Η200· 03g/L、ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L 的水溶液；
把所述种子培养基加到培养瓶中，用无机碱将该种子培养基的pH值调节至弱碱性，然后灭菌，再接入以所述种子培养基体积计0. 1-5%解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)BM-B-;MO，然后在室温下培养80-120小时，得到种子液；
B、摇瓶发酵
使用酵母浸膏、NaCl、蛋白胨、叶黄素、上述微量元素液与去离子水制备含有酵母浸膏 5. 0-5. 5g/L、NaCl 25_32g/L、蛋白胨 8. 5-12. Og/L、叶黄素 180_200mg/L、微量元素液 1. OmL/L的摇瓶发酵培养基；
把所述摇瓶发酵培养基加到培养瓶中，用无机碱将该摇瓶发酵培养基的pH值调节至弱碱性，然后灭菌，再在室温下接入在步骤A得到的种子培养基，接种量是以所述摇瓶发酵培养基体积计5-10%，在50-80rpm摇床中在温度下培养80_120h，得到发酵液；
C、分离
将步骤B得到的发酵液进行离心分离，往其上清液中加入以所述上清液体积计 1 1有机溶剂，在室温下进行振荡萃取，分离得到的有机相进行挥干，得到具有紫罗兰香气的发酵物。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的无机碱是NaOH、KOH或Ca (OH)20
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A与B中，所述弱碱性pH值是 7. 2-7. 4。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，所述有机溶剂选自正己烷、氯仿、丙酮、乙醚、四氯化碳和/或石油醚。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，有机相挥干是吹氮法、真空减压法或蒸馏法。
本发明还涉及采用所述方法得到的具有紫罗兰香气的发酵物，其特征在于它含有 60. 0-70. Omg/L 7，8-二氢-β -紫罗兰醇。
根据本发明的一种优选实施方式，具有紫罗兰香气的发酵物中的7，8_ 二氢- β -紫罗兰醇是采用下述分析方法测定的
准确吸取0. 1 μ L含有7，8_ 二氢- β -紫罗兰醇的二氯甲烷溶液进行气-质联用分析；
HP 5890ΙΙ型气相色谱分析条件为石英毛细管柱20-Μ、柱长30m、膜厚1 μ m ；升温程序50°C保持5min，以升温速度4°C /min升温至200°C，在这个温度下保持25min ；进样口温度 200°C ；
HP 5945A型质谱分析条件为EI源、电离电压70eV、离子源温度200°C、接口温度 200°C，检测器电压1KV，全范围扫描；
然后，准确称取所述发酵物l.Omg，用二氯甲烷定容至100 μ L，得到待分析样品； 准确吸取0. 1 μ L样品按照与上述相同条件进行气-质联用分析；
这些测定结果通过下式计算得到步骤Α)中样品溶液中7，8_ 二氢-β-紫罗兰醇的含量
7，8_二氢-β-紫罗兰醇含量(mg/L) = 7，8_ 二氢-β -紫罗兰醇质量 (mg) /0. 1 μ L
本发明还涉及所述具有紫罗兰香气的发酵物作为烟用香料的用途。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种具有紫罗兰香气的发酵物的生产方法。
所述生产方法包括以下步骤
Α、种子培养
使用酵母浸膏、NaCl、葡萄糖、蛋白胨、微量元素液与去离子水制备含有酵母浸膏 4-6g/L、NaCl 25_32g/L、葡萄糖 0. 1-0. 4g/L、蛋白胨 8_15g/L、微量元素液 1. OmL/L 的种子培养基。
把所述种子培养基加到培养瓶中，用无机碱将该种子培养基的pH值调节至弱碱性，然后灭菌，再接入以所述种子培养基体积计0. 1-5%解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)BM-B-340，然后在室温下培养80-120小时，得到种子液。
本发明使用的解淀粉类芽孢杆菌(PaenikiciIlus amylolyticus)BM-B-340是从市场上购买得到的，是墨西哥hvestigaciones Biomedicas研究所菌物工业保藏中心 (IIBM-UNAM)保藏的。
解淀粉类芽孢杆菌BM-B-340的形态学特征是
该菌株属于芽孢杆菌，从土壤中分离得到，细胞呈直杆状，0. 5 2. 5 μ mX 1. 2 10 μ m，以成对或链状排列，具圆端或方端。细胞染色呈现革兰氏阳性。好氧或兼性厌氧，具有对热、PH和盐各种多样性的生理特性，具发酵或呼吸代谢类型。
所述的微量元素液是含有H3BO3 3. Og/L、MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、 C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2H20 0. 03g/L、ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L 的水溶液。
在本发明中，C4H4KNaO6 · 4H20都应该理解是四水合酒石酸钾钠。
需要指出的是，当微量元素液中的某一种成分的含量超过或低于上述含量时并不会导致培养失败，只是有可能影响培养效果或效率。微量元素液的配制对本领域的技术人员而言是不存在的任何困难的，在此不作赘述。
B、摇瓶发酵
使用酵母浸膏、NaCl、蛋白胨、叶黄素、上述微量元素液与去离子水制备含有酵母浸膏 5. 0-5. 5g/L、NaCl 25_32g/L、蛋白胨 8. 5-12. Og/L、叶黄素 180_200mg/L、微量元素液 1. 0mL/L的摇瓶发酵培养基；
把所述摇瓶发酵培养基加到培养瓶中，用无机碱将该摇瓶发酵培养基的pH值调节至弱碱性，然后灭菌，再在室温下接入在步骤A)得到的种子培养基，接种量是以所述摇瓶发酵培养基体积计5-10%，在50-80rpm摇床中在温度下培养80_120h，得到发酵液。
步骤A)与B)中，所述的灭菌是将自然环境中各种细菌(包括芽孢杆菌)及真菌灭活。
该步骤使用的摇床是在本技术领域里通常使用的摇床，例如上海欣蕊自动化设备有限公司销售的以商品名HYG-II恒温调速摇床。
由于发酵培养物中含有光敏性物质，因此为避免这些物质见光分解，使用的培养瓶应用铝箔进行避光。
C、分离
将步骤B)得到的发酵液进行离心分离，往其上清液中加入以所述上清液体积计 1 1有机溶剂，在室温下进行振荡萃取，分离得到的有机相进行挥干，得到具有紫罗兰香气的发酵物。
在上述生产方法中，用于调节pH值的无机碱是NaOH、KOH或Ca (OH)20
优选地，在步骤A)与B)中所述弱碱性pH值是7. 2-7. 4。
根据本发明的优选技术方案，步骤(3)中的有机溶剂选自正己烷、氯仿、丙酮、乙醚、四氯化碳和/或石油醚。
更优选地，有机溶剂选自正己烷、丙酮、四氯化碳和/或石油醚。
优选地，在步骤(3)中有机溶剂的挥干是选自吹氮法、真空减压法或蒸馏法。
所述的吹氮法是本技术领域的技术人员熟知的方法，即采用诸如Turbo Vap自动浓缩仪方法。
所述的真空减压法是本技术领域的技术人员熟知的方法，即在真空度 0. 06-0. OSMPa下进行减压蒸去有机溶剂。
所述的蒸馏法也是本技术领域的技术人员熟知的方法，即水浴加热蒸馏方法。
经过多种分析技术确认，采用本发明生产方法得到的具有紫罗兰香气的发酵物含有7，8- 二氢-β -紫罗兰醇，其含量是60. 0-70. Omg/L。
在本发明中，具有紫罗兰香气的发酵物都应该理解是一种含有60. 0-70. Omg/L 7， 8- 二氢-β -紫罗兰醇的发酵物。当然，7，8- 二氢-β -紫罗兰醇含量或高些或低些也都应该认为是本发明的具有紫罗兰香气的发酵物。
所述的具有紫罗兰香气的发酵物还含有少量的其它紫罗兰衍生物，例如 2. 5-2. 7mg/L 7，8- 二氢-β -紫罗兰酮，0. 7-0. 8mg/L β -紫罗兰酮。
具有紫罗兰香气的发酵物中的7，8- 二氢-β -紫罗兰醇是采用下述分析方法测定的。所述分析方法包括以下步骤
准确吸取0. 1 μ L含有7，8_ 二氢- β -紫罗兰醇的二氯甲烷溶液进行气-质联用分析；
HP 5890ΙΙ型气相色谱分析条件为石英毛细管柱20-Μ、柱长30m、膜厚1 μ m ；升温程序50°C保持5min，以升温速度4°C /min升温至200°C，在这个温度下保持25min ；进样口温度 200°C ；
HP 5945A型质谱分析条件为EI源、电离电压70eV、离子源温度200°C、接口温度 200°C，检测器电压1KV，全范围扫描；
然后，准确称取所述发酵物l.Omg，用二氯甲烷定容至100 μ L，得到待分析样品； 准确吸取0. 1 μ L样品按照与上述相同条件进行气-质联用分析；
这些测定结果通过下式计算得到步骤Α)中样品溶液中7，8_ 二氢-β-紫罗兰醇的含量
7，8_ 二氢-β -紫罗兰醇含量(mg/L) = 7，8_ 二氢-β -紫罗兰醇质量 (mg) /0. 1 μ L
本发明还提供根据上述生产方法制备得到具有紫罗兰香气的发酵物作为烟用香料的用途。
具有紫罗兰香气的发酵物作为烟用香料的用途应该理解是，在烟草制品可以含有以该烟草制品总重量计0. 01-0. 10%本发明的具有紫罗兰香气的发酵物。
在本发明中，所述的烟草制品是卷烟、雪茄烟、烟丝或复烤烟叶。
可以依照常规加香工艺程序将本发明的具有紫罗兰香气的发酵物喷洒在烟丝或涂布在烟草薄片上，然后在恒温恒湿箱中平衡45-50小时，再打烟或切丝打烟制成烟支，最后进行感官评吸鉴定。
所述的感官评吸鉴定方法是由本公司即华宝香精香料公司的五位烟用调香师组成评定小组，采用暗评方法，按照本公司建立的香气质、量、谐调、杂气、刺激、劲头和余味六项指标等级标准进行质量评定，以便比较现有香精与本发明的具有紫罗兰香气的发酵物对烟草制品品质的影响。
本发明的具有紫罗兰香气的发酵物能够非常显著地提升烟草制品的品质。
[有益效果]
本发明方法采用微生物生物转化叶黄素生产新型烟用香料，含有7，8_ 二氢-β-紫罗兰醇的具有紫罗兰香气的发酵物，该发酵物产品具有天然烟草植物的香气。与目前烟用香料紫罗兰酮相比，该产品香气更清雅、独特、柔和。本发明方法将改变紫罗兰醇酮系列产品依靠低效的化学合成局面，填补生物转化高效生产的空白，市场前景和应用价值良好。
具体实施方式
下面将通过实施例更详细地说明本发明。
实施例1 制备具有紫罗兰香气的发酵物
制备步骤如下
Α、种子培养
种子培养基组成是酵母浸膏5. Og/L、NaCl 30. Og/L、葡萄糖0. 2g/L、蛋白胨 10. Og/L、微量元素液1. OmL/L ；其中微量元素液组成是H3BO3 3. Og/L、MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2H20 0. 03g/L、ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L、其余为去离子水。
把80mL所述种子培养基加到培养瓶中，搅拌成均一的培养基溶液。用NaOH水溶液将该种子培养基的PH值调节至pH = 7. 2，用去离子水补加至IOOmL,棉花塞口，在15psig 与温度121°C的条件下进行灭菌15min，再接入以所述种子培养基体积计解淀粉类芽孢杆菌I^aenibacillus amylolyticus ΒΜ-Β- ΜΟ，然后在室温下培养90小时，得到种子液；
B、摇瓶发酵
以叶黄素取代葡萄糖作为碳源，其发酵培养基组成是酵母浸膏5. 5g/L、NaCl 30. 0g/L、蛋白胨10. 0g/L、叶黄素190. 0mg/L、微量元素液1. 0mL/L ；微量元素液组成是H3BO3 3. 0g/L、MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2H20 0. 03g/L、 ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H200. 04g/L ；
把所述摇瓶发酵培养基300mL加到培养瓶中，用NaOH水溶液将该发酵培养基的pH值调节至PH = 7. 2，然后在15psig与温度121°C的条件下进行灭菌15min，再在室温下接入在步骤A得到的种子培养基，接种量是以所述摇瓶发酵培养基体积计10%，在60rpm摇床中在温度^TC下培养96h，得到发酵液；
为了避免叶黄素(类胡萝卜素)见光分解，培养瓶应用铝箔遮光。
C、分离
将步骤B)得到的发酵液进行离心(离心力MOOg)分离20min，再往其上清液中加入以所述上清液体积计1 1有机溶剂(有机溶剂是丙酮、乙醚与石油醚混合物，其比例是以体积计1 1 1)，在温度20°c下萃取lOmin，然后分离含有7，8_ 二氢-β-紫罗兰醇的有机相，它再进行挥干，得到具有紫罗兰香气的发酵物，其发酵物进行下述分析。
D、产物分析
准确吸取0. 1 μ L含有7，8_ 二氢- β -紫罗兰醇的二氯甲烷溶液进行气-质联用分析；
HP 5890ΙΙ型气相色谱分析条件为石英毛细管柱20-Μ、柱长30m、膜厚1 μ m ；升温程序50°C保持5min，以升温速度4°C /min升温至200°C，在这个温度下保持25min ；进样口温度 200°C ；
HP 5945A型质谱分析条件为EI源、电离电压70eV、离子源温度200°C、接口温度 200°C，检测器电压1KV，全范围扫描；
然后，准确称取该实施例制备的发酵物1. Omg，用二氯甲烷定容至ΙΟΟμ L，得到待分析样品；再准确吸取0. 1 μ L其样品按照与上述相同条件进行气-质联用分析；
这些测定结果通过下式计算得到步骤Α)中样品溶液中7，8_ 二氢-β-紫罗兰醇的含量
7，8_二氢-β-紫罗兰醇含量(mg/L) = 7，8_ 二氢-β -紫罗兰醇质量 (mg) /0. 1 μ L
检测得出该实施例发酵物含有65. 2mg/L7,8- 二氢- β -紫罗兰醇。
采用常规加香工艺程序将本实施例制备的发酵物喷洒在烟丝上，然后在恒温恒湿箱中平衡48小时，再制成烟支，进行感官评吸鉴定。
所述的感官评吸鉴定方法是由本公司即华宝香精香料公司的五位烟用调香师组成评定小组，采用暗评方法，按照本公司建立的香气质、量、谐调、杂气、刺激、劲头和余味六项指标等级标准进行质量评定。
确定7，8_ 二氢-β-紫罗兰醇具有增加烟草独特的本草香作用，显著增强卷烟的香气质，同时降低杂气，余味舒适干净。
实施例2 制备具有紫罗兰香气的发酵物
制备步骤如下
Α、种子培养
种子培养基组成是酵母浸膏5. Og/L, NaCl 30. 0g/L,葡萄糖0. 2g/L，蛋白胨 10. 0g/L,微量元素液 1. 0mL/L ；微量元素液配制=H3BO3 3. 0g/L、MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2H20 0. 03g/L、ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L、其余为去离子水，
把IOOmL所述种子培养基置于培养瓶中，搅拌成均一的培养基液。用NaOH水溶液将该种子培养基的PH值调节至7. 3，用去离子水补加至150mL，棉花塞口，在15psig与温度121°C的条件下灭菌15min，再接入以所述种子培养基体积计2%解淀粉类芽孢杆菌 (Paenibacillus amylolyticus)ΒΜ-Β- ΜΟ，然后在室温下培养110小时，得到种子液；
B、摇瓶发酵
以叶黄素取代葡萄糖作为碳源，其培养基组成酵母浸膏5. 2g/L，NaC130. Og/L, 蛋白胨8. 5g/L，叶黄素195. Omg/L，微量元素液1. OmL/L ；微量元素液配制=H3BO3 3. 0g/L、 MgSO4 1. 8g/L,FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 ·4Η201· 77g/L、CuCl2 ·2Η20 0· 03g/L、ZnCl2 0. 02g/ L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L ；
把所述摇瓶发酵培养基400mL加到培养瓶中，用NaOH水溶液将该发酵培养基的pH 值调节至7. 2，然后在15psig与温度121°C的条件下进行灭菌15min，再在室温下接入在步骤A)得到的种子培养基，接种量是以所述摇瓶发酵培养基体积计10%，在60rpm摇床中在温度^TC下培养105h，得到发酵液；
为了避免叶黄素(类胡萝卜素)见光分解，培养瓶应用铝箔遮光。
C、分离
将步骤B)得到的发酵液进行离心(离心力MOOg)分离20min，再往其上清液中加入以所述上清液体积计1 1有机溶剂(有机溶剂是丙酮、乙醚与石油醚混合物，其比例是以体积计1 1 1)，在温度20°c下进行液-液萃取20min，然后分离含有7，8_ 二氢-β-紫罗兰醇的有机相，它再进行挥干，得到具有紫罗兰香气的发酵物，其发酵物进行下述分析。
D、产物分析
准确吸取0. 1 μ L含有7，8_ 二氢- β -紫罗兰醇的二氯甲烷溶液进行气-质联用分析；
HP 5890ΙΙ型气相色谱分析条件为石英毛细管柱20-Μ、柱长30m、膜厚Ιμπι;升温程序50°C保持5min，以升温速度4°C /min升温至200°C，在这个温度下保持25min ；进样口温度 200°C ；
HP 5945A型质谱分析条件为EI源、电离电压70eV、离子源温度200°C、接口温度 200°C，检测器电压1KV，全范围扫描；
然后，准确本实施例制备的发酵物l.Omg，用二氯甲烷定容至IOOyL,得到待分析样品；再准确吸取0. 1 μ L其样品按照与上述相同条件进行气-质联用分析；
检测得出该实施例发酵物含有66. 3mg/L7,8- 二氢- β -紫罗兰醇。
采用实施例1所述的质量评定方法，确定7，8_ 二氢- β -紫罗兰醇具有增加烟草独特的本草香作用，显著增强卷烟的香气质，同时降低杂气，余味舒适干净。
实施例3 制备具有紫罗兰香气的发酵物
制备步骤如下
Α、种子培养
种子培养基组成是酵母浸膏5. 0g/L, NaCl 30. 0g/L,葡萄糖0. 2g/L，蛋白胨 10. 0g/L,微量元素液 1. 0mL/L ；微量元素液配制=H3BO3 3. 0g/L、MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2H20 0. 03g/L、ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L、其余为去离子水，
把IOOmL所述种子培养基置于培养瓶中，搅拌成均一的培养基液。用NaOH水溶液将该种子培养基的PH值调节至7. 3，用去离子水补加至150mL，棉花塞口，在15psig与温度121°C的条件下灭菌15min，再接入以所述种子培养基体积计3%解淀粉类芽孢杆菌 (Paenibacillus amylolyticus)ΒΜ-Β- ΜΟ，然后在室温下培养85小时，得到种子液；
B、摇瓶发酵
以叶黄素取代葡萄糖作为碳源，其培养基组成酵母浸膏5. 2g/L，NaC130. Og/L, 蛋白胨8. 5g/L，叶黄素195. Omg/L，微量元素液1. OmL/L ；微量元素液配制=H3BO3 3. Og/L、 MgSO4 1. 8g/L,FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 ·4Η201· 77g/L、CuCl2 ·2Η20 0· 03g/L、ZnCl2 0. 02g/ L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L ；
把所述摇瓶发酵培养基500mL加到培养瓶中，用NaOH水溶液将该发酵培养基的pH 值调节至7. 2，然后在15psig与温度121°C的条件下进行灭菌15min，再在室温下接入在步骤A)得到的种子培养基，接种量是以所述摇瓶发酵培养基体积计10%，在50rpm摇床中在温度32°C下培养120h，得到发酵液；
为了避免叶黄素(类胡萝卜素)见光分解，培养瓶应用铝箔遮光。
C、分离
将步骤B)得到的发酵液进行离心(离心力MOOg)分离20min，再往其上清液中加入以所述上清液体积计1 1有机溶剂(有机溶剂是丙酮、乙醚与石油醚混合物，其比例是以体积计1 1 1)，在温度20°c下萃取8min，然后分离含有7，8_ 二氢-β-紫罗兰醇的有机相，它再进行挥干，得到具有紫罗兰香气的发酵物，其发酵物进行下述分析。
D、产物分析
准确吸取0. 1 μ L含有7，8_ 二氢- β -紫罗兰醇的二氯甲烷溶液进行气-质联用分析；
HP 5890ΙΙ型气相色谱分析条件为石英毛细管柱20-Μ、柱长30m、膜厚1 μ m ；升温程序50°C保持5min，以升温速度4°C /min升温至200°C，在这个温度下保持25min ；进样口温度 200°C ；
HP 5945A型质谱分析条件为EI源、电离电压70eV、离子源温度200°C、接口温度 200°C，检测器电压1KV，全范围扫描；
然后，准确称取该实施例制备的发酵物l.Omg，用二氯甲烷定容至IOOyL,得到待分析样品；再准确吸取0. 1 μ L其样品按照与上述相同条件进行气-质联用分析；
检测得出该实施例发酵物含有66. 3mg/L7,8- 二氢-β -紫罗兰醇。
采用实施例1所述的质量评定方法，确定7，8_ 二氢-β -紫罗兰醇具有增加烟草独特的本草香作用，显著增强卷烟的香气质，同时降低杂气，余味舒适干净。
实施例4 制备具有紫罗兰香气的发酵物
制备步骤如下
Α、种子培养
种子培养基组成是酵母浸膏5. 0g/L, NaCl 30. 0g/L,葡萄糖0. 2g/L，蛋白胨 10. 0g/L,微量元素液 1. 0mL/L ；微量元素液配制=H3BO3 3. 0g/L、MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2H20 0. 03g/L、ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L、其余为去离子水，
把80mL所述种子培养基置于培养瓶中，搅拌成均一的培养基液。用NaOH水溶液将该种子培养基的PH值调节至7. 3，用去离子水补加至IOOmL,棉花塞口，在15psig与温度121°C的条件下灭菌15min，再接入以所述种子培养基体积计5%解淀粉类芽孢杆菌 (Paenibacillus amylolyticus)ΒΜ-Β- ΜΟ，然后在室温下培养80小时，得到种子液；
B、摇瓶发酵
以叶黄素取代葡萄糖作为碳源，其发酵培养基组成是酵母浸膏5. 5g/L、NaCl 30. Og/L、蛋白胨10. 0g/L、叶黄素190. 0mg/L、微量元素液1. 0mL/L ；微量元素液组成是H3BO3 3. 0g/L、MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2H20 0. 03g/L、 ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H200. 04g/L ；
把所述摇瓶发酵培养基300mL加到培养瓶中，用NaOH水溶液将该发酵培养基的pH 值调节至7. 2，然后在15psig与温度121°C的条件下进行灭菌15min，再在室温下接入在步骤A)得到的种子培养基，接种量是以所述摇瓶发酵培养基体积计10%，在SOrpm摇床中在温度下培养85h，得到发酵液；
为了避免叶黄素(类胡萝卜素)见光分解，培养瓶应用铝箔遮光。
C、分离
步骤B)得到的发酵液进行离心(离心力MOOg)分离20min，再往其上清液中加入以所述上清液体积计1 1有机溶剂(有机溶剂是丙酮、乙醚与石油醚混合物，其比例是以体积计1 1 1)，在温度20°C下萃取20min，然后分离含有7，8_ 二氢-β-紫罗兰醇的有机相，它再进行挥干，得到具有紫罗兰香气的发酵物，其发酵物进行下述分析。
D、产物分析
准确吸取0. 1 μ L含有7，8_ 二氢- β -紫罗兰醇的二氯甲烷溶液进行气-质联用分析；
HP 5890ΙΙ型气相色谱分析条件为石英毛细管柱20-Μ、柱长30m、膜厚1 μ m ；升温程序50°C保持5min，以升温速度4°C /min升温至200°C，在这个温度下保持25min ；进样口温度 200°C ；
HP 5945A型质谱分析条件为EI源、电离电压70eV、离子源温度200°C、接口温度 200°C，检测器电压1KV，全范围扫描；
然后，准确称取该实施例制备的发酵物l.Omg，用二氯甲烷定容至IOOyL,得到待分析样品；再准确吸取0. 1 μ L其样品按照与上述相同条件进行气-质联用分析；
检测得出该实施例发酵物含有66. 2mg/L7,8- 二氢-β -紫罗兰醇。
采用实施例1所述的质量评定方法，确定7，8_ 二氢-β -紫罗兰醇具有增加烟草独特的本草香作用，显著增强卷烟的香气质，同时降低杂气，余味舒适干净。1权利要求
1.一种具有紫罗兰香气的发酵物的生产方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤A、种子培养使用酵母浸膏、NaCl、葡萄糖、蛋白胨、微量元素液与去离子水制备含有酵母浸膏4-6g/ L、NaCl 25-32g/L、葡萄糖0. 1-0. 4g/L、蛋白胨8_15g/L、微量元素液1. OmL/L的种子培养基；所述的微量元素液是含有 H3BO3 3. Og/L、MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2H200. 03g/L、ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L 的水溶液；把所述种子培养基加到培养瓶中，用无机碱将该种子培养基的PH值调节至弱碱性， 然后灭菌，再接入以所述种子培养基体积计0. 1-5%解淀粉类芽孢杆菌I^enibacillus amylolyticus BM-B-MO，然后在室温下培养80-120小时，得到种子液；B、摇瓶发酵使用酵母浸膏、NaCl、蛋白胨、叶黄素、上述微量元素液与去离子水制备含有酵母浸膏 5. 0-5. 5g/L、NaCl 25_32g/L、蛋白胨 8. 5-12. Og/L、叶黄素 180_200mg/L、微量元素液 1. OmL/L的摇瓶发酵培养基；把所述摇瓶发酵培养基加到培养瓶中，用无机碱将该摇瓶发酵培养基的PH值调节至弱碱性，然后灭菌，再在室温下接入在步骤A得到的种子培养基，接种量是以所述摇瓶发酵培养基体积计5-10%，在50-80rpm摇床中在温度下培养80_120h，得到发酵液；C、分离将步骤B得到的发酵液进行离心分离，往其上清液中加入以所述上清液体积计1 1 有机溶剂，在室温下进行振荡萃取，分离得到的有机相进行挥干，得到具有紫罗兰香气的发酵物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的无机碱是NaOH、KOH或Ca(0H)2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤A与B中，所述弱碱性pH值是 7. 2-7. 4。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤C中，所述有机溶剂选自正己烷、氯仿、 丙酮、乙醚、四氯化碳和/或石油醚。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤C中，有机相挥干是吹氮法、真空减压法或蒸馏法。
6.根据权利要求1-5中任一项权利要求所述方法得到的具有紫罗兰香气的发酵物，其特征在于它含有60. 0-70. 0mg/L 7，8_ 二氢- β -紫罗兰醇。
7.根据权利要求6所述的具有紫罗兰香气的发酵物，其特征在于7，8_二氢- β -紫罗兰醇是采用下述分析方法测定的准确吸取0. 1 μ L含有7，8- 二氢-β -紫罗兰醇的二氯甲烷溶液进行气-质联用分析；HP 5890ΙΙ型气相色谱分析条件为石英毛细管柱20-Μ、柱长30m、膜厚1 μ m ；升温程序50°C保持5min，以升温速度4°C /min升温至200°C，在这个温度下保持25min ；进样口温度 200°C ；HP 5945A型质谱分析条件为EI源、电离电压70eV、离子源温度200°C、接口温度 200°C，检测器电压1KV，全范围扫描；然后，准确称取权利要求6所述产品l.Omg，用二氯甲烷定容至IOOyL,得到待分析样品；准确吸取0. 1 μ L样品按照与上述相同条件进行气-质联用分析；这些测定结果通过下式计算得到步骤A中样品溶液中7，8_ 二氢-β-紫罗兰醇的含量·7，8_ 二氢-β-紫罗兰醇含量(mg/L) = 7，8_ 二氢-β-紫罗兰醇质量(mg)/0. lyL。
8.根据权利要求6所述的具有紫罗兰香气的发酵物作为烟用香料的用途。
全文摘要
本发明涉及一种具有紫罗兰香气的微生物发酵物及其制备方法，该方法包括解淀粉类芽孢杆菌Paenibacillus amylolyticus BM-B-340种子培养、摇瓶发酵培养与发酵物分离等步骤。本发明含7，8-二氢-β-紫罗兰醇的发酵物具有天然烟草植物的香气。与目前烟用香料β-紫罗兰酮相比，该产品香气更清雅、独特、柔和，因此，将具有非常好的市场前景和应用价值。
文档编号C12R1/01GK102492729SQ201110400140
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日 公开号201110400140.发明者袁毅, 谷向春 申请人:华宝食用香精香料(上海)有限公司