专利名称：Jak2 v617f突变的检测应用的制作方法
技术领域：
本发明属于核酸检测领域，具体而言，本发明涉及JAK2基因V617F位点脱氧核糖核酸突变(G1849T)的检测以及所用的检测试剂盒和引物对等。
背景技术：
Janus kinase 2(本文简称JAK2)属于Janus激酶家族,为胞内酪氨酸蛋白激酶。JAK2自N-端至C-端共由JH7-JH1共7个高度保守的同源结构域(JHl JH7)组成，通过作用于EPO、TPO、IL-3、G-CSG, GM-CSF受体，起着调控细胞内信号传导、产生细胞增殖效应的作用。然而，JAK2基因14外显子第1849位鸟嘌呤替换为胸腺嘧啶，使位于JAK2蛋白伪激酶区域的第617位苯丙氨酸变异为缬氨酸(JAK2 V617F突变)，将致使伪激酶区域失活，最终导致JAK-STAT、PI3K、AKT等通路出现非细胞因子依赖性激活，从而可能导致骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms, MPN),包括慢性粒细胞白血病(chronicmyeloid leukemia, CML)、真性红细胞增多症(polycythemia vera, PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia,ET)与原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis,PMF)等。自2008年起，世界卫生组织已在其官方分类诊断标准中将JAK2 V617F突变定义为MPN的分子诊断金标准。(可参见:James C, Ugo V, Le Couedic JP, Staerk J, Delhommeau F,et al.(2005)A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signallingcauses polycythaemia vera.Nature 434:1144 ；Swerdlow S, Campo E, Harris NL, JaffeES, Pileri SA, et al.(2008)WHO Classifcation of Tumours of Haematopoietic andLymphoid Tissues.WHO Classification of Tumours.4th ed.Lyon, France:IARC)目前检测该点突变的方法主要是聚合酶链式反应(PCR)后进行测序，但是这一方法中的测序耗时且需要的仪器和试剂成本较高，不适合大规模推广使用。本发明经过长期艰苦的研究，并结合一些筛选的运气，研究出了一对引物并且研究出了配套的方法，可以通过PCR扩增产物的熔解分析而快速获得结果，其中无需耗时的步骤，而且熔解分析仪的维护成本比测序仪要低。由于人群的突变基因的比率很低，实践中一一检测的效率很低，因此往往用多人的混合样品进行检测，更加令人意想不到的是，本发明人研究出来的检测方法能够分辨只含1% (甚至更低)的突变型的样品，而这是测序所无法完成的，因此提高了检测效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的JAK2 V617F突变的检测应用，该应用比现有技术更深时、成本更低、和/或更高效。另外，本发明还提供了用于这些应用的试剂盒以及引物对等。具体而言，在第一方面，本发明提供了检测JAK2基因的V617F突变的方法，其包括:(I)对待检测样品进行PCR扩增，其中使用的引物对序列为:
5 ’ -TGAAGCAGCAAGTATGATGAG-3’，5’ -GGGAGTATGTGTCTGTGGAGACTGACACCTAGCTGTGATCCTG-3’ ；和(2)用熔解分析仪进行熔解分析。在本文中，待检测样品是潜在含有人JAK2基因DNA的离体样品，包括血液、体液或其提纯物。由于人群的突变基因的比率很低，实践中一一检测的效率很低，而本发明人发现，本发明第一方面的方法也能适合混合样品。因此优选在本发明第一方面的方法中，待检测样品是来自不同个体的混合样品。由于是混合样品，结果只能显示混合样品中是否含有突变型基因，但是无法准确判断其中任何一个个体的样品是否含有突变型基因，因此不可能针对个体得出诊断结果，而只能针对混合样品得出检测结果。优选本发明第一方面的方法由上述(I)和(2)组成，即封闭式的方法。这样，更加无法得出针对个体得出诊断结果，而只能得出混合样品中是否含有突变型基因这一非诊断结果。由于本发明的方法灵敏度高，能够检测出混合样品中的基因只含1% (甚至更低)的突变型基因(其余为野生型基因)。在本发明中，含量在指基因(包括野生型基因和突变型基因)的含量时，根据上下文，指的是突变型基因在野生型基因和突变型基因总量中的含量，或者指的是野生型基因在野生型基因和突变型基因总量中的含量。因此更优选在本发明第一方面的方法中，混合样品中V617F突变型的JAK2基因含量不超过20 %，优选不超过15 %，更优选不超过10%，更优选不超 过5 %，更加优选不超过2 %，如1.5或I %等。在本发明第一方面的方法中，PCR扩增的体系还可以包含Taq酶、缓冲液、和dNTP等。优选在本发明第一方面的方法中，PCR扩增的体系还包括SYT0-9荧光染料。SYT0-9荧光染料可以掺入双链DNA中而发出荧光，因而可以指示熔解的程度。这些成分可以自行配制，也可以通过商业途径购买，优选通过商业途径购买。在本发明第一方面的方法中，PCR扩增是不完全的PCR扩增，这样便于用熔解分析仪进行熔解分析。不完全的PCR扩增指的是PCR扩增中的每个循环中的变性(如以95°C变性)、退火(如以55°C退火)和延伸(如以72°C延伸)的时间分别不超过8秒，优选不超过5秒，更优选不超过3秒，更加优选不超过2秒，如1.5秒或I秒。根据扩增的产物性质，本发明人优化了 PCR扩增的步骤。优选在本发明第一方面的方法中，PCR扩增的步骤为:预变性95°C 2min,70次热循环，其中每次循环为95°C I秒，55°C I秒，72°C I秒。在本发明第一方面的方法中，熔解分析是生成荧光-熔解温度导数曲线。这可以通过自行读数并作图完成，也可以通过市售的熔解分析仪自动生成，例如在本发明的具体实施方式
中，就是通过Qiagen Rotor-Gene Q高分辨率熔解分析仪自动生成的。在第二方面，本发明提供了引物对，其核苷酸序列为:5， -TGAAGCAGCAAGTATGATGAG-3，，5， -GGGAGTATGTGTCTGTGGAGACTGACACCTAGCTGTGATCCTG-3，。引物对一般通过人工合成。该引物对可以用于本发明第一方面的方法中。在第三方面，本发明提供了用于检测JAK2基因的V617F突变的试剂盒，其包括本发明第二方面的引物对。试剂盒中各成分都是分离放置的。本发明第三方面的试剂盒还可以包含Taq酶、缓冲液、和dNTP等成分。优选本发明第三方面的试剂盒还包括SYT0-9荧光染料。在又一个方面，本发明提供了本发明第二方面的引物对和/或本发明第三方面的试剂盒在制备用于本发明第一方面的方法的试剂中的应用。例如，本发明提供了本发明第二方面的弓I物对在制备用于本发明第一方面的方法的测试制品中的应用，优选其中测试制品包括本发明第三方面的试剂盒，也可以是本发明第三方面的试剂盒。又如，本发明提供了本发明第三方面的试剂盒在制备用于本发明第一方面的方法的试剂中的应用，优选其中测试制品包括本发明第三方面的试剂盒和记载了本发明第一方面的方法的说明书。本发明取得的有益效果在于，检测省时、成本低、和/或可对混合样品进行检测，灵敏度高、效率高。为了便于理解，以下将通过具体的附图和具体实施方式
对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。另外本发明引用的公开 文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
:图1:不同待测样品的荧光-熔解温度导数曲线，其中图例(说明)中的曲线从上至下依次的样品为野生型、野生型和突变型的混合物(突变型占0.1% )、野生型和突变型的混合物(突变型占1% )、野生型和突变型的混合物(突变型占10% )和突变型。
具体实施例方式本发明将通过具体的实施例来进行示例性的说明，其中，如有未尽之处，可参见《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社，北京)等实验手册以及市售的试剂和仪器的使用说明。本发明人委托上海生工生物工程技术服务有限公司根据Genbank登录号NM_004972.3所示的序列合成了野生型的JAK2基因(简称为野生型)以及带有G 1849T突变的JAK2 V617F突变基因(简称为突变型)，并将突变型基因按一定比例(0.10% )混合入野生型基因，构成不同待检测样品。同时本发明人委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成如下引物:引物1:5，-TGAAGCAGCAAGTATGATGAG-3，；引物2:5，-GGGAGTATGTGTCTGTGGAGACTGACACCTAGCTGTGATCCTG-3，。使用TaKaRa PCR试剂盒(购自TaKaRa公司)在Qiagen Rotor-Gene Q高分辨率熔解分析仪(购自Qiagen公司)中进行PCR扩增，其中PCR扩增体系为:待检测样品溶液Iyl;rTaq 酶(5U/ μ 1)0.1 μ I ；10 X PCR 缓冲液(Mg2+free) 2 μ I ;Mg2+ 缓冲液(2.5mM) 2.5 μ I ；dNTP 混合液(2.5mM) 1.6 μ I ;引物1(0.5μΜ)1μ I ;引物2(10μΜ)1μ I ;SYT0-9 荧光染料(购自 Invitrogen 公司)(50 μ M) 0.8 μ I ;和
去离子水10 μ I。PCR扩增步骤为:预变性95 °C 2min，70次热循环(95 °C I秒，55 °C I秒，72 °C I秒)；用熔解分析仪进行熔解分析(55°C-90°C，0.2°C/Step)，生成荧光-熔解温度导数曲线(-dF/dT)。结果如图1所示，待检测样品是野生型序列，具有较低的Tm(63°C );待检测样品是突变型序列，则在熔解分析过程中将产生较高的Tm(70°C );而待检测样品是含有少量突变型的混合样品，则在野生型与突变型的熔解区域之间分别产生相应的熔解峰，而且熔解曲线的形态将随突变型的含量而变化，因而可进行半定量分析，可以区分混合样品中是否含有突变型序列以及 初步估算其中突变型序列所占的含量。
权利要求
1.检测JAK2基因的V617F突变的方法，其包括: (1)对待检测样品进行PCR扩增，其中使用的引物对序列为:5’ -TGAAGCAGCAAGTATGATGAG-3’，5’ -GGGAGTATGTGTCTGTGGAGACTGACACCTAGCTGTGATCCTG-3’ ；和 (2)用熔解分析仪进行熔解分析。
2.权利要求1所述的方法,其中待检测样品是来自不同个体的混合样品。
3.权利要求2所述的方法，其中混合样品中V617F突变型的JAK2基因含量不超过20%。
4.权利要求1所述的方法，其中PCR扩增的体系还包括SYTO-9荧光染料。
5.权利要求1所述的方法，其中熔解分析是生成荧光-熔解温度导数曲线。
6.权利要求1所述的方法，其中PCR扩增的步骤为:预变性95°C2min，70次热循环，其中每次循环为95°C I秒，55°C I秒，72°C I秒。
7.引物对，其序列为:5’ -TGAAGCAGCAAGTATGATGAG-3’，5’ -GGGAGTATGTGTCTGTGGAGACTGACACCTAGCTGTGATCCTG-3’。
8.用于检测JAK2基因的V617F突变的试剂盒，其包括权利要求7所述的引物对。`
9.权利要求8所述的试剂盒，其还包括SYTO-9荧光染料。
10.权利要求7所述的引物对和/或权利要求8或9所述的试剂盒在制备用于权利要求I 6之任一所述的方法的测试制品中的应用。
全文摘要
本发明属于核酸检测领域，具体涉及JAK2基因V617F位点脱氧核糖核酸突变(G1849T)的检测以及所用的检测试剂盒和引物对等。本发明公开了检测JAK2基因的V617F突变的方法，其包括(1)对待检测样品进行PCR扩增；和(2)用熔解分析仪进行熔解分析。另外，本发明还公开了用于该方法检测的试剂盒和引物对等。
文档编号C12Q1/68GK103243153SQ20121003047
公开日2013年8月14日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者关明, 吴之源, 张心菊, 刘维薇, 陈宇明, 张伟, 万峻, 于波 申请人:复旦大学附属华山医院