专利名称：亚洲型舞毒蛾的实时荧光pcr检测方法及检测用引物和探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及林业和植物检疫技术领域，具体涉及一种亚洲型舞毒蛾的检测方法； 尤其涉及一种亚洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法；此外，本发明还涉及检测亚洲型舞毒蛾的引物和探针。
背景技术：
舞毒蛾Lymantria dispar (Linnaeus)属鱗翅目(Lepidoptera)、毒蛾科 (Lymantriidae)、毒蛾属(Lymantria),是世界公认的全北温带地区森林和观赏性林木害虫。舞毒蛾幼虫寄主范围广，主要有杨、柳、榆、栎、落叶松、椴、云杉等树木。主要分布在欧洲、北美、中国、日本、朝鲜，根据其形态特征、生物学习性和地理分布，舞毒蛾被分为亚洲亚种(L. disparasiatica Vnukovsk ii)、欧洲亚种(L. dispardispar(Linnaeus))和日本亚种 (L. dispar japonica (Motschulsky))。亚洲亚种和日本亚种被统称为亚洲型舞毒蛾,其中亚洲亚种在我国有分布，欧洲亚种则被称为欧洲型舞毒蛾。亚洲型舞毒蛾主要分布在亚洲和部分欧洲地区，雌成虫飞行能力强，可为害约500种寄主植物。欧洲型舞毒蛾原产欧洲，于 1869年由欧洲传入美国，雌成虫不能飞行，为害约250种寄主植物。
由于亚洲型舞毒蛾成虫飞行能力强且寄主范围广等原因，美国官方认为亚洲型舞毒蛾比欧洲型舞毒蛾对其威胁更大。为了防止亚洲型舞毒蛾传入美国，从1991年开始，美国在其港口及附近地区对该虫开展监测，并先后对来自俄罗斯远东、日本高风险港口的船舶实施特别检疫措施，也多次在船舶上发现舞毒蛾的卵块。2007年以来，北美植物保护组织及其成员国先后致函中国政府，并多次交涉，准备对来自中国相关港口的船舶也实施特别检疫措施。该组织最近已经出台区域标准征求意见稿《Guidelines for Regulating the Movement of Ships and Cargoes aboard those Ships from Areas Infested with the Asian GypsyMoth)) 由于舞毒蛾的检疫重要性，因此，寻求快速、准确的亚洲型舞毒蛾的检测鉴定方法是现阶段检疫技术亟待解决的问题和发展的方向。发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种亚洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法；为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物和探针。利用亚洲型舞毒蛾检测引物及探针可以快速、准确地对亚洲型舞毒蛾进行检测鉴定。
本发明根据亚洲型舞毒蛾、欧洲型舞毒蛾、北美型舞毒蛾这几个地理种群的mtDNA 中部分基因的序列设计特异性引物和探针，建立了亚洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定亚洲型舞毒蛾的目的。
在本发明的一方面，提供一种亚洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤
(I)设计引物和探针；
该引物的序列为
上游引物AS-F :5’ -AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID NO. I)；
下游引物AS-R :5，-ACAGCTTTCCTTCTACITTTATCTTTACCT-3，(SEQ ID NO. 2)；
该探针的序列为
亚洲型舞毒蛾探针AS-TaqMan :FITGGTAAAGGAITGGATCCCCTCCTCCP (SEQ ID NO. 3) 或其互补链；
(2)提取亚洲型舞毒蛾DNA ；
(3)采用步骤⑴设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。
步骤⑵具体为取亚洲型舞毒蛾单头虫样放入研钵，加液氮磨成粉末状，用试剂盒提取样品DNA。
步骤⑶中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为25 iiL，包括2XPremixEx Taq12.5 u L, 50 X ROX Reference DyeO. 5 y L，步骤(I)设计的上下游引物 AS-F/R 各 I. 0 y L， AS-TaqMan 探针 I. 0 ii L，DNA 模板 2. 0 ii L，超纯水补至 25 U L。
步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为预变性95°C 30seC ;然后 95°C 5sec，60°C 34sec 循环 40 次。
在本发明的另一方面，提供一种用于检测亚洲型舞毒蛾的引物，其序列为
上游引物AS-F :5’ -AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID NO. I)；
下游引物AS-R :5，-ACAGCTTTCCTTCTACITTTATCTTTACCT-3，(SEQ ID NO. 2)。
在本发明的另一方面，提供一种用于检测亚洲型舞毒蛾的探针，其序列为 AS-TaqMan FTTGGTAAAGGATTGGATCCCCTCCTCCP (SEQ ID NO. 3)或其互补链。
上述实时荧光PCR检测方法采用TaqMan探针。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5' -3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC， HEX。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于
I、检测时间大大缩短，可以在六个小时内完成检测，传统的常规方法需10-20天；
2、对亚洲型舞毒蛾的鉴定准确率增大，传统的常规方法还需要其他详细产地等信息支持才能鉴定。
图I是本发明的引物AS-F/AS-R和探针AS-TaqMan在亚洲型舞毒蛾上的位置示意图2是亚洲型、欧洲型、北美型舞毒蛾序列在探针位置的比对示意图3是不同来源的16个舞毒蛾样品实时荧光PCR扩增的结果示意图4是不同来源的9个舞毒蛾样品实时荧光PCR扩增的结果示意图5是不同稀释浓度的亚洲型舞毒蛾样品实时荧光PCR扩增的结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆实验室手册(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述条件,或按制造厂商所建议的条件。
实施例I
I.设计引物和探针
根据舞毒蛾这几个地理种群的mtDNA (线粒体DNA)中部分基因的序列设计如下特异性引物AS-F/R和探针AS-TaqMan (引物和探针由上海基康公司合成)
亚洲型舞毒蛾引物
上游引物AS-F :5’ -AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID NO. I)；
下游引物AS-R :5，-ACAGCTTTCCTTCTACITTTATCTTTACCT-3，(SEQ ID NO. 2)；
亚洲型舞毒蛾探针AS-TaqMan :FITGGTAAAGGAITGGATCCCCTCCTCCP (SEQ ID NO. 3) 或其互补链。
上述引物及探针的检测原理如图I所示，3种不同类型舞毒蛾序列在探针位置的比对见图2。
2、提取舞毒蛾DNA
取舞毒蛾单头虫样(样品来源见表I)放入研钵，加液氮磨成粉末状，用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen 公司)提取样品 DNA。
表I舞毒蛾样品信息
权利要求
1.一种亚洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤(1)设计引物和探针；该引物的序列为上游引物 AS-F :5’ -AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID NO. I)；下游引物 AS-R :5，-ACAGCTTTCCTTCTACITTTATCTTTACCT-3，(SEQ ID NO. 2)；该探针的序列为亚洲型舞毒蛾探针 AS-TaqMan :FITGGTAAAGGAITGGATCCCCTCCTCCP (SEQ ID NO. 3)或其互补链；(2)提取亚洲型舞毒蛾DNA；(3)采用步骤(I)设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。
2.如权利要求I所述的亚洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤⑵ 具体为取亚洲型舞毒蛾单头虫样放入研钵，加液氮磨成粉末状，用试剂盒提取样品DNA。
3.如权利要求I所述的亚洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤⑶ 中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为25 iiL，包括2 X PremixEx Taq 12. 5 U L, 50 X ROX Reference Dye0.5iiL，步骤(I)设计的上下游引物 AS-F/R 各 l.OuL, AS-TaqMan 探针 l.OuL, DNA模板2. Ou L,超纯水补至25 u L。
4.如权利要求I或3所述的亚洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法，其特征在于， 步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为预变性95°C 30seC;然后95°C 5sec, 60 °C 34sec 循环 40 次。
5.一种用于检测亚洲型舞毒蛾的引物，其特征在于，其序列为上游引物 AS-F :5’ -AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID NO. I)；下游引物 AS-R :5，-ACAGCTTTCCTTCTACITTTATCTTTACCT-3，(SEQ ID NO.2)。
6.一种用于检测亚洲型舞毒蛾的探针，其特征在于，其序列为AS-TaqMan FTTGGTAAAGGATTGGATCCCCTCCTCCP (SEQ ID NO. 3)或其互补链。
全文摘要
本发明公开了一种亚洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针，根据亚洲型舞毒蛾、欧洲型舞毒蛾、北美型舞毒蛾这几个舞毒蛾地理种群的mtDNA中部分基因的序列设计特异性引物AS-F/R和探针AS-TaqMan，建立了亚洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定亚洲型舞毒蛾的目的。
文档编号C12Q1/68GK102534025SQ201210030320
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者叶军, 周国梁, 易建平, 朱雅君, 林瑶 申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局