专利名称：一株对草甘膦具有高抗活性的固氮克雷伯氏菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一株具有固氮作用及高抗草甘膦能力的克雷伯氏细菌及其应用。
背景技术：
充分发挥农业微生物资源宝库的作用，积极发掘新的生防微生物资源是农业微生物资源开发研究的重要内容。近年来，大量施用化肥、农药造成的资源浪费及土壤、地下水体污染已引起了世界各国的广泛重视。利用生物固氮是减少氮肥施用量最为有效的途径， 生物固氮资源的研究、开发和利用在我国农业可持续发展中占有重要地位。联合固氮效率虽不及共生固氮高，但其分布广，受益作物多，因而是一类不可忽视的固氮体系。目前已发现大多数具有重要价值的作物如甘蔗、水稻、小麦、玉米、牧草等禾本科植物均可与固氮菌进行联合固氮作用。联合固氮菌除了能为宿主提供氮素以外，还同时具有分泌生长素、溶磷、增强植株抗病性、抗逆境等多方面的促进植物生长的作用。针对长期单一施用化学肥料带来的土壤肥力下降，农产品品质下降和农业环境污染加剧等一系列对农业可持续发展的负面影响，积极发掘和利用联合固氮作用的潜力对农业可持续发展更具特殊的意义。草甘膦是一种内吸传导型，广谱灭生性除草剂，对40多种一年生，多年生，单子叶和双子叶木本，草本植物有杀伤作用，对多年生草的地下组织破坏力尤强，广泛用于橡胶园，果树，茶园，桑园，甘蔗田和林业除草。草甘膦理化性质稳定，具有高效、广谱、低毒、低残留、不破坏土壤环境、对大多数植物具有灭生性等其它除草剂所不可比拟的优点，是全世界除草剂使用量最大的品种之一。但是草甘膦在杀灭杂草的同时对农作物同样有着杀死作用，从而限制了其使用范围和使用时间。草甘膦进入植物体内，抑制5—烯醇丙酮基莽草酸一 3 一磷酸合酶(EPSP合酶)，使植物不能合成它生存所必需的某些芳香氨基酸，导致植物死亡。而人及动物与植物的代谢不同不需要合成那些芳香氨基酸，因此草甘膦对人及动物安全。生物降解是草甘膦降解的最主要途径。许多微生物对草甘膦具有降解作用，草甘膦微生物降解的主要中间产物是毒性极低的氨甲基磷酸(AMPA)，最终产生为水、二氧化碳与磷酸。在自然环境中特别是在长期使用草甘膦等除草剂地区的土壤中，存在种类繁多的能耐受或降解草甘膦的细菌。单株细菌降解草甘膦的研究从八十年代初开始，在根瘤菌科、节杆菌、肺炎克氏杆菌等均分离到草甘膦降解菌。在土壤、垃圾和水体样品中也能分离到高抗或降解草甘膦的细菌菌株。若将来源于微生物的草甘膦抗性基因克隆后转入农作物，可加强植物对草甘膦的抗性，或增加植物降解甘膦的能力，从而可解除草甘膦对农作物的危害。如果能有高抗或降解草甘膦的农作物出现，则既能大大地节省农业生产费用，又能极大地促进草甘膦工业的发展。
发明内容
本发明目的针对农业生产实践的实际问题和需要，筛选出对甘蔗生长具有显著促进作用，同时对草甘膦具有高抗活性的联合固氮菌，为研制促甘蔗生长微生物菌剂及抗草甘膦转基因作物的研究、应用提供新的微生物资源。本发明采取的技术方案
本发明所述的甘鹿内生固氮菌属于克雷伯氏菌(Klebsiella sp.),该菌株已于2011年11月3日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 5439。该菌株由甘蔗根际分离获得，通过无氮培养基筛选、固氮酶活性测定、固氮酶基因nifH扩增及序列分析，确定其为联合固氮菌；经菌株形态、16S rDNA序列分析，把该菌株鉴定为克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)细菌。菌株命名为GG08160，其最适生长温度为30°C，最适生长pH为7. O 7. 2。本发明菌株GG08160具有联合固氮能力及降解无机磷的功能，对甘蔗幼苗生长具 有显著促进作用，在草甘膦含量达250mM的培养基质中仍能正常生长，具有高抗草甘膦的活性，具有良好的应用前景，可作为植物生长的促生菌，同时可为草甘膦的生物降解研究提供新的微生物资源或基因资源，为促进农业可持续发展提供资源和保障。
图I菌株GG08160在不同浓度草甘膦液体培养基中的生长情况；
图2菌株GG08160在Pikovaskaia’ s培养基平板上的生长情况；
图3菌株GG08160对甘蔗组培苗生长的促进作用(增加植株的干重);
图4菌株GG08160对甘蔗组培苗生长的促进作用(增加植株含氮量)；
图5菌株GG08160对甘蔗组培苗生长的促进作用(植株长势及联合固氮效率)。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明。实施例I本发明菌株的分离
称取附着在甘鹿根表土 5g放入45mL灭菌水中，摇床上180r/min, 28°C恒温振荡30min分散微生物细胞，静置lOmin，即得KT1稀释液，用灭菌水10倍系列稀释，各取100 μ L涂在Ashby 培养基(成分为蔗糖 10g, NaCl O. 2g，KH2PO4 O. 2g，MgSO4 · 7H20 O. 2g，CaSO4 · 2H20O.lg，CaCO3 5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0)平板上，在28°C培养2_3d至长出单菌落。用接种针挑取不同单菌落，在Ashby平板上划线纯化3次得到单一菌落。将纯化后的单菌落接种于LB培养基(成分为胰蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH 7.0)平板上，4°C存放，供近期使用；纯化的单菌落接种于LB液体培养至对数生长期，将菌液与终浓度为15%甘油混合，_80°C冰箱长期保存。实施例2本发明菌株的固氮酶活性
采用乙炔还原乙烯法(acetylene reduction assay,ARA)测定固氮酶活性。将GG08160活化后在Ashby液体培养基中生长48h，取ImL菌液接种于灭菌的含IOmL Ashby液体培养基的60mL磨口小口瓶中，培养24h后从瓶内抽出5mL气体，然后再注入5mL乙炔气体，继续培养24h，用气相色谱仪检测乙烯生成量，以nmolC2H4/h. mL表示固氮酶活性。以巴西甘蔗内生固氮菌G. diazotrophicus PAL5为阳性对照，以接种ImL灭活菌液的处理作为空白对照。实验结果表明，本发明菌株的固氮酶的乙炔还原乙烯活性为1632nmol C2H4/h，与阳性对照巴西甘鹿内生固氮菌模式菌株G. diazotrophicus PAL5的固氮酶活性1675nmol
C2H4/h 相当 ο实施例3本发明菌株的nifH基因及16S rDNA的克隆分析
PCR扩增模板的制备将菌株GG08160活化后接种到LB液体培养基(成分为胰蛋白胨IOg,酵母浸出物5g,氯化钠IOg,蒸懼水IOOOmL, pH 7. O),培养20h后离心收集菌体备用。用细菌基因组DNA提取试剂盒，按产品说明书从新鲜的细菌LB培养物中提取本发明菌株的基因组DNA，保存于-20°C，DNA含量约为50_100ng/ μ L。nifH 基因分析扩增引物为 PolyF (TGCGAYCCSAARGCBGACTC)和 PolyR (ATSGCCATCATYTCRCCGGA)，PCR 反应程序为94°C 3min 预变性，然后进行 94°C Imin，55 °Clmin，72°C lmin，30个循环，最后72°C IOmin0 PCR扩增产物进行I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。以固氮葡糖醋酸杆菌G. diazotrophicus PAL5菌株(Gillis et al. , 1989)为阳性对照，以大肠杆菌E. coli DH5a菌株为阴性对照。将nifH扩增产物回收以后克隆到T载体上，按宝生物工程(大连)有限公司(简称TaKaRa)的pMDTM18_T Vector克隆试剂盒说明来操作。经PCR验证的阳性克隆送上海生工生物工程公司测序，测序结果在GenBank登录和比对分析。菌株的16S rDNA序列分析利用细菌16S通用引物27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和 1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)扩增细菌的 16S rRNA 基因。PCR 反应程序为94°C 3min预变性，然后进行94°C 55s, 50°C 50s, 72°C lmin，35个循环，最后72°C IOmin0 PCR扩增产物进行I. 2%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物回收以后克隆到T载体上，选择阳性克隆送上海生工生物工程公司测序，测序结果在GenBank登录和比对分析。nifH PCR扩增得到的片段测序分析结果表明GG08160菌株含有钥铁固氮酶铁蛋白基因nifH序列(登录号FJ823000) ；16S rDNA序列分析结果(登录号FJ823051)表明本发明菌株与克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)细菌的同源性达98%。综合菌株的菌落形态、nifH基因及16S rDNA的序列分析结果，将本发明菌株鉴定为克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)细菌。实施例4本发明菌株对草甘膦的耐受能力测定
以LB为基础培养基，向LB液体培养基中加入草甘膦铵盐(购自广西自主化工有限公司)，配制含草甘膦终浓度分别为0，50，100，150，200，250，300mM的系列培养基。菌株GG08160接种到LB液体培养基于30°C，180rpm培养24h作为母液，取20 μ L母液加入50mL上述含不同浓度草甘膦的培养基中，30°C, 180rpm条件下培养48h后,测定培养液的OD600。测定结果见图1，GG08160对草甘膦具有较强的耐受能力，在草甘膦浓度达250mM的培养基上能保持良好的生长，在300mM草甘膦培养上仍有少量生长。实施例5本发明菌株对无机磷的降解特性
待测菌株活化培养后取Iml菌液，IOOOOrpm离心5min，除去上清，然后用灭菌水IOOOOrpm离心5min洗菌2次，用灭菌水稀释10倍得到菌悬液。取供试菌株菌悬液10 μ I点接种于盛有 Pikovaskaia’s 培养基(成分葡萄糖 10g, (NH4)2SO4 0. 5g，NaCl 0. 3g，KClO. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 3g, MnSO4 · 4H20 0. 03g, FeSO4 · 7H20 0. 03g, Ca3(PO4)2 5g,琼脂粉 15g,蒸馏水1000mL，pH 7.0)的培养皿中，重复4次，置于28°C下培养3d。观察接种菌株周围有无透明圈形成，测量透明圈直径(D)与菌落直径(d)的大小，根据溶磷圈的透明度D/d的比值大小判断细菌解磷能力强弱。实验结果见图2,GG08160菌株可在Pikovaskaia’ s平板培养基上形成透明圈,表明该菌株可分泌一些酸性物质，并向周围的培养基扩散，使菌落周围的磷酸盐[Ca3 (PO4) 2]溶解，即该菌株具有降解无机磷特性，菌株的溶磷圈直径D (菌落+透明圈)与菌落直径(d)的比值(D/d)为I. 32。实施例6本发明菌株对甘蔗组培苗生长的促进作用
供试菌株分别为GG08160以及巴西甘鹿内生固氮菌G. diazotrophicus PAL5菌株。以蛭石甘蔗组培苗移栽后的栽培基质，按比例每kg基质加入IOmg (15NH4) 2S04 (15N原子百分超
10.11)，分装到塑料盆中。将供试菌株分别活化后在LB液体培养基上培养过夜，离心收集菌体，用灭菌水悬浮离心清洗2次后稀释到每毫升1-2X IO8个细胞。将炼苗后生长一致的甘蔗组培苗移栽到装有栽培基质的塑料盆中，每盆浇入上述供试菌株GG08160的菌悬液IOOmL,置于28V、光周期14h光-IOh暗光照培养箱培养。IOd后再以IOOmL同样浓度的菌悬液灌根接种，继续在限菌条件下培养。以接种等量同样浓度的PAL5菌株的菌悬液为阳性对照，空白对照接种等量灭菌水。50d后对甘蔗组培苗的生长情况进行记录，收获植株并洗净栽培基质，冷冻干燥后测定植株干重、含氮量及15N含量，计算固氮效率。固氮效率根据公式Ndfa =100X [l-(atom% 15N接种植株/atom% 15N对照植株)]计算。试验测定结果表明接种GG08160能显著促进甘蔗组培苗的生长(图3_图5)，甘蔗组培苗的干重和总氮含量分别比空白对照增加了 42. 56%和38. 64% (图3、图4);植株从空气中获得氮的百分率(固氮效率)平均为9. 75% (图5);而接种PAL5菌株的甘蔗组培苗的干重及总氮含量增长率分别为29. 35%和35. 25%，固氮效率为10. 09%。
权利要求
1.一株对草甘膦具有高抗活性的固氮克雷伯氏菌，其特征在于菌株命名为GG08160，具有高抗草甘膦的活性，能与甘蔗联合固氮并显著促进甘 蔗幼苗的生长。
全文摘要
本发明涉及一株具有固氮作用及高抗草甘膦能力的克雷伯氏细菌及其应用。该菌株由甘蔗根际分离获得，通过无氮培养基筛选、固氮酶活性测定、固氮酶基因nif H扩增及序列分析，确定其为联合固氮菌；经菌株形态、16S rDNA序列分析，把该菌株鉴定为克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)细菌。菌株命名为GG08160。本发明菌株具有联合固氮能力及降解无机磷的功能，对甘蔗幼苗生长具有显著促进作用，在草甘膦含量达250mM的培养基质中仍能正常生长，具有高抗草甘膦的活性，具有良好的应用前景，可作为植物生长的促生菌，同时为草甘膦的生物降解研究提供新的微生物资源或基因资源，为促进农业可持续发展提供资源和保障。
文档编号C12R1/22GK102965296SQ20121002982
公开日2013年3月13日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者胡春锦, 李杨瑞, 史国英, 林丽, 魏源文, 邓智年, 李楠 申请人:广西壮族自治区农业科学院微生物研究所