专利名称：基于果胶甲基酯酶Pcpme6基因开发的检测辣椒疫霉菌的引物及方法
技术领域：
本发明涉及一种基于果胶甲基酯酶Pcpme6基因开发的检测辣椒疫霉菌的引物及方法。
背景技术：
植物病原卵菌是ー类重要的植物病原菌，可侵染危害多种植物，导致多种植物毁灭性的病害，如致病疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(P. capsici)、大豆疫霉(P. sojae)、寄生疫霉(P. parasitic)、樟疫霉(P. cinnamomi)及冬生疫霉(P. hibemalis)分别引起马铃薯、辣椒、大豆、烟草、樟树及柑橘重要疫病，严重年份乃至绝产。卵菌主要以菌丝体或卵孢子在病残体或土壤中度过不良环境并作为初侵染源，在适宜条件下，菌丝体或卵孢子均可萌发产生孢子囊-释放游动孢子，借助雨水或气流传播、侵染而引起植物病害。因此，对该类病菌引起的病害早期进行适时检控，利于控制病害的发生。传统的病害防控策略主要依靠品种、栽培、化防和生态调控等防治措施，这些防控措施主要在病害爆发乃至产生明显危害时实施，忽视了对初侵染源或侵染寄主早期适时采取综合防控和高效治理措施，近而事半功倍，防效甚微，最終很难控制病害的发生与流行。近年来，PCR技术及其相关分子检测技术已广泛用于植物病原菌消长动态的分子检测与预警，其中利用核糖体rDNA/ITS序列设计特异引物，已针对性的开展了大豆疫霉、致病疫霉、冬生疫霉、寄生疫霉、辣椒疫霉分子检测技术研究，但这些技术性研发成果仅能对病菌活动动态进行检测与预警，但不能对病菌致病特性与发生趋势进行检测与预警。研究表明疫霉菌-寄主互作过程中常分泌多种重要的细胞壁降解酶，主要包括多聚半乳糖醛酸酶(Pg)、果胶甲基酯酶(Pme)、果胶裂解酶(Pel)，这些重要致病因子主要通过降解或软化植物细胞壁的主要成分果胶、中胶层及果胶聚合体，而促使病菌的侵入与定植，对寄主产生寄生与致病性。该类致病酶均由多基因编码，如辣椒疫霉果胶甲基酯酶由9个基因编码，名称为 Pcpme 1-9 (GenBank 号分别为EF596784、FJ213426、FJ213427、FJ213428、FJ213429、FJ213430、FJ213431、FJ213432及FJ213433)。其中少数关键基因是重要的致病靶基因，因此分离鉴定这些重要致病酶的靶标基因，利用基因信息学设计并合成靶标基因的特异引物，针对病菌不同时期致病特性进行分子检测与预警，以便在病菌初侵染期适时采取综合防控措施，減少药剂使用次数及使用量，阻断病菌的扩展与蔓延，控制病害的发生与蔓延。因此，开展重要疫霉菌致病酶类靶标基因克隆及其特异引物设计与合成，研制病菌分子检测、预警技术及其试剂盒，对疫霉病的综合防控具有重要的理论与实践意义。
发明内容
本发明所要解决的ー个技术问题是提供ー种可特异检测辣椒疫霉的PCR引物对(试剂)。本发明所提供的特异检测辣椒疫霉的PCR引物对，是果胶甲基酯酶基因Pcpme 6的特异引物对，其名称为Pme6F-R，由序列表中序列I所示的单链DNA(Pme6F)和序列表中序列2所示的单链DNA(Pme6R)组成。其中，序列表中的序列I由20个核苷酸组成，序列2由21个核苷酸组成。含有Pme6F-R的检测或辅助检测辣椒疫霉的PCR试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒还可含有DNA聚合酶、dATP、dTTP、dCTP和dGTP等其它PCR试剂。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种检测或辅助检测辣椒疫霉的方法。本发明所提供的检测或辅助检测辣椒疫霉的方法，包括如下步骤用Pme6F-R对待测样品进行PCR，确定待测样品中是否含有辣椒疫霉或确定待测样品中辣椒疫霉菌的含量。所述待测样品可为土壤或为所述辣椒疫霉的宿主植物组织和/或器官，如辣椒叶片、莖、果实等。上述方法中，可按照如下方法确定待测样品中是否含有辣椒疫霉以待测样品的基因组DNA或总RNA反转录得到的CDNA为模板，用Pme6F-R进行PCR扩增，检测得到的PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物满足下述I)或2)的条件，则所述待测样品含有辣椒疫霉或候选含有辣椒疫霉；若所述PCR扩增产物不满足所述I)或2)的条件，则所述待测样品不含有辣椒疫霉或候选不含有辣椒疫霉；I)所述PCR扩增产物为173bp的片段；2)所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示为100bp_200bp的条带。其中，确定待测样品中是否含有辣椒疫霉的PCR扩增的条件可为95°C预变性4min ;94°C变性 lmin，50°C 30s, 72°C lmin，35 个循环。上述方法中，可采用实时荧光定量PCR确定待测样品中辣椒疫霉菌的含量。所述实时荧光定量PCR的条件可为95°C预变性2min ;94°C变性15s，55°C退火15s，68°C延伸30s, 45个循环。实验结果显示，本发明的果胶甲基酯酶基因Pcpme 6的特异引物对Pme6F_R,可对不同时期的辣椒疫霉及不同辣椒疫病材料(病田土壌、病茎、病果、病叶)进行定性、定量分子检测，可对辣椒疫霉初侵染源及其侵染过程各个时期病菌消长动态进行检测与预警，便于及时确定病害最佳防控时期，特别是在病菌早期活动时期适时进行综合防控与治理，如根据对土壌中卵孢子检测的有无及多少，适时处理土壌，阻断源头病菌的繁殖与蔓延，降低了病害防控成本。
图I为9个Pcpme基因于接种辣椒果实中RNA转录表达水平qRT-PCR检测结果示意图。图中横坐标1、2、3、4分别代表辣椒疫霉菌接种辣椒果实天数ld、3d、5d、7d，A_I分别代表 9 个基因 Pcpmel-9 ;A :Pcpme I, B Pcpme 2, C Pcpme 3, D Pcpme 4, E Pcpme 5, F Pcpme 6, G Pcpme 7, H Pcpme 8, I Pcpme 9。标准误差来自三次重复实验。图2为Pcpme 6基因特异引物对不同參试种菌DNA的PCR检测结果示意图。
图中，A为Pcpme 6基因一对特异引物对Pme6F_R对不同种菌DNA的PCR检测结果；B为Pcpme I基因一对特异引物对PmelF-R对不同种菌DNA的PCR检测结果；1 :标准DNA ；2 :阴性对照水；3-7 :辣椒疫霉 SD33, Jul02101, Jul02104, ATCC7858, ATCC7859 ；8 大ii疫霉；9 :寄生疫霉；10 :致病疫霉；11 :棒疫霉；12 :掘氏疫霉；13 :掠桐疫霉；14 :热带疫霉；15 :苎麻疫霉；16 :恶疫霉；17 :苜蓿疫霉；18 :芋疫霉；19 :标准DNA;20 :隐地疫霉；21 跳J2 疫霉；22 :早眷疫霉；23 :大雄疫霉；24 :采ii疫霉；25 :葱疫霉；26 :冬生疫霉；27 :瓜果腐霉；28 :水霉；29 :甘薯根霉；30 :立枯丝核；31 :串珠铼刀菌；32 :腐皮铼孢菌；33 :茄链格孢；34 :青霉菌；35 :淡黄曲霉。图3为Pcpme 6基因特异引物PCR检测辣椒疫霉菌游动孢子DNA结果示意图。图中，A为Pcpme 6 一对 特异引物对Pme6F_R对不同浓度辣椒疫霉菌SD33游动孢子DNA的PCR检测结果；图B为參比基因Pcpme I 一对特异引物对PmelF-R对不同浓度游动孢子DNA的PCR检测结果；1 :标准DNA ；2 :阴性对照水；3 :阳性对照辣椒疫霉菌SD33DNA ；4-18 :对不同体积的游动孢子 DNA (6. 0,5. 5,5. 0,4. 5,4. 0,3. 5,3. 0,2. 5,2. 0,1. 5，1.0,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2uL)DNA 检测效果(7 个游动孢子 / y L)。图4为Pcpme 6基因特异引物PCR检测辣椒疫霉菌SD33卵孢子DNA示意中，A为Pcpme 6 —对特异引物Pme6F_R对卵孢子DNA PCR检测結果；B为Pcpme
I一对特异引物PmelF-R对卵孢子DNA PCR检测结果；1 :标准DNA ；2 :阴性对照水；3 :阳性对照辣椒疫霉菌SD33 DNA ；4-14 :对不同体积的卵孢子DNA(4. 0,3. 5,3. 0,2. 5,2. 0，I. 5，
I.0,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2u L)DNA 检测效果(7 个卵孢子 / y L)。图5为Pcpme 6基因特异引物对Pme6F-R不同辣椒疫霉菌材料PCR扩增结果示意中，I :标准DNA ；2-3 :无菌水和健康辣椒组织DNA ；4 :辣椒疫霉菌SD33菌丝体DNA ；5 :病茎组织DNA ；6 :病果组织DNA ；7 :病叶组织DNA ；8 :人工接种卵孢子的土壤菌体DNA ；9 :含有卵孢子的病田土壤菌体DNA。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，如Sambrook等分子克隆实验手册 (New York GoldSpring Harbor Laboratory Press, 1989),或 Draper, J 等(1988)操作技术规程或按照制造厂商所建议的实验条件。下述实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例I、特异检测辣椒疫霉的引物对Pme6F-R的获得及其特异性和灵敏度本实施例以辣椒疫霉为參试材料，依据qRT-PCR技术检测辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因Pcpme 1-9这9个基因成员在辣椒病果实中RNA转录表达水平的差异，比较相关数据信息，Pcpme 6被界定为祀标致病基因，设计并合成Pcpme 6基因(序列3)的多对特异引物，测试了这些引物对对所有參试菌种的特异性及对辣椒疫霉菌检测的灵敏性。从中选择出了一对特异性和灵敏度均较高的引物对Pme6F-R作为特异检测辣椒疫霉的引物对，上游引物为 Pme6F(20bp)，序列为 5'-CCGAAGTTAGCTGGACCGIT-3' ;下游引物为 Pme6R(21bp)，序列为5'-ACTCCAITGCGAGACTTGAGA-3'，扩增目的基因长度为173bp。具体步骤如下1、9个Pcpme基因在接种辣椒果实中RNA转录表达水平qRT-PCR检测步骤I. I、辣椒疫霉菌 SD33(山东农业大学)(Yong Jian Jia,Bao Zhen Feng,Wen XiuSun and Xiu Guo Zhang, J. Phytopathol 157 :585-591, 2009)游动抱子接种辣椒果实，具体方法如下I. I. I、将辣椒疫霉菌株SD33移置于10% V8固体培养基培养4天后，挑取菌落边缘菌丝块至10% V8液体培养基上培养4天，25°C黑暗培养5-6天。I. I. 2、加入灭菌水，刚好浸没菌丝为宜，每隔I天换水至产生游动孢子，收集游动孢子调节浓度至I X IO5个/ml，配置游动孢子悬浮液用于辣椒果实接种。I. I. 3、辣椒疫霉菌游动孢子悬浮液接种辣椒果实I)取新鮮幼嫩辣椒果实，经75%无水こ醇消毒处理，置无菌操作台晾干。2)手木刀将果实表皮组织轻轻划破，造成深度约1cm，面积约0. 25cm2微创伤。3)将于适宜浓度的游动孢子悬浮液中浸泡30min的无菌脱脂棉球覆盖于伤ロ处，然后用保鲜膜包扎密封。4)接种果实置于28 °C恒温培养箱内培养7d，按照I、3、5、7d间隔取样，切取病健交界处保存置_80°C下备用提取RNA。I. 2、提取接种辣椒果实RNA，用微量蛋白核酸测定仪(IMPLEN)測定RNA浓度，反转录合成cDNA第一链，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测9个基因于接种辣椒病果中RNA转录表达水平。具体方法如下I. 2. I、接种辣椒疫霉菌辣椒病果RNA提取I)取辣椒病果0. Ig于液氮中充分研磨，移入Iml Trizol中，混匀后室温下静置5min,使核蛋白复合物完全解离(样品体积不超过所用Trizol体积的10% )。2)加入0. 2mL氯仿，剧烈摇动或用旋润震荡器混勻，4°C下12000rpm/min离心15min,吸取上清夜,重复一次或多次该步骤。3)吸取上清夜，每Iml Trizol加入0. 25倍体积异丙醇和0. 25倍RNA沉淀剂，充分混匀，室温放置lOmin，于4°C下12000rpm/min离心lOmin。4)收集RNA沉淀，用75%こ醇洗涤2次，重复上述离心。5) 一次性吸头吸尽残存こ醇，打开管盖的离心管放置实验台几分钟，使残余こ醇挥发棹。6)加50-100 U I DEPC处理的水，将RNA溶液贮存于_70°C。I. 2. 2、RNA 检测通过RNA甲醛变性电泳鉴定RNA完整性，rRNA占总RNA80-85%，琼脂糖凝胶可清晰看到28S和18SrRNA。28SrRNA量约是18SrRNA的两倍，说明RNA完整性较好。取2. 5 ylRNA样品，用微量蛋白核酸测定仪(MPLEN)测定RNA，结果表明A260/A280比值为I. 9-2. 1，得到纯度较高的RNA。I. 2. 3、反转录cDNA第一链合成I)反应体系为最终为 20 iiL，10 X RT mix 2 y L，2. 5mmol/LdNTP 混合液 2 y L，引物01igo_dT 2 u L, Quant Reverse Transcriptase I U L, RNase Free ddH20 13_xyL,丰莫板RNA第四步加入X iiし
2)将模板RNA在冰上解冻，引物、10 X RT mix、dNTP混合液、RNase Free ddH20在室温解冻，然后迅速置于冰上。使用前将各种溶液涡旋振荡混匀，简短离心收集残留于管壁上的液体。
3)按照I)反转录体系配制混合液，彻底混匀，涡旋振荡不超过5秒钟，简短离心，置于冰上。4)如需多个反转录反应，可将配制好的混合液分装在单反应管中，置于冰上。5)将模板RNA加入混合液中，彻底混匀，简短离心收集管壁上残留液体。6) 37°C孵育60分钟，后反转录产物进行后续PCR反应。
I. 2. 4、实时荧光定量 PCR (qRT-PCR)所采用的qRT-PCR引物序列如下Pcpme I 的上游引物5'-CAGGTGCTCAITTCCAAGITGAA-3'，Pcpme I 的下游引物5'-TGTTGGCGATGTTGAGGTTGTA-3' ；Pcpme 2 的上游引物5'-ITTACAACGAGCAGGnTTCGIT-3'，Pcpme 2 的下游引物5'-GTACACCTTGACGTTGTCCGA-3' ；Pcpme 3 的上游引物5' -AACGTACCAAGAGCAAGTCACA-3'，Pcpme 3 的下游引物5'-CAGAGTGGTGGTGTAGTCGTT-3' ；Pcpme 4 的上游引物5'-ITTCCAGGGTTGTATCAAGAGCA-3'，Pcpme 4 的下游引物5'-CAAGTCGTTGCGGTTGTTCTT-3' ；Pcpme 5 的上游引物5'-CAGGTGCTCAITTCCAAGITGAA-3'，Pcpme 5 的下游引物5'-TGTGTTGGCGATGTTGAGGTT-3' ；Pcpme 6 的上游引物5'-CCGAAGTTAGCTGGACCGIT-3' (序列 I)，Pcpme 6 的下游引物5'-ACTCCAITGCGAGACTTGAGA-3' (序列 2)；Pcpme 7 的上游引物:5'-ACGACATCGTACGCTTCCAA-3'，Pcpme 7 的下游引物:5'-TGTTGGCGATGTTGAGGTTGTA-3' ；Pcpme 8 的上游引物5'-CGTACGCTGCCAACCAAGT-3'，Pcpme 8 的下游引物5'-CGGTAGGATTGGCGACGTTA-3' ；Pcpme 9 的上游引物5'-CGAGCACACGCTCTTCATGT-3'，Pcpme 9 的下游引物:5'-AAATCCCTTTGAGCCATTGTGT-3' ；以辣椒寄主18S rRNA为内參基因，其上游引物5'-ITTCGGTCCTATTACGITGG-3' ；下游引物5'-ITCGCAGTTGITCGTCTTTC-3'。以不同接种时间辣椒果实总RNA反转录合成的cDNA为模板，利用上述引物进行qRT-PCR, PCR 扩增体系为 20 y L，2. 5 X realMasterMix :8 u L,20X SYBR solution I ii L，正向引物0. 5 ii L，反向引物0. 5 ii L，cDNA模板2 y L，加dd H2O至20 yしPCR參数95°C预变性2min ;94°C变性15s，55°C退火15s，68°C延伸30s，45个循环，65_95°C制备溶解曲线。选择辣椒寄主18S rRNA为内參基因，每个样品做三个重复，用2_AAGt法对样本基
因进行表达差异相对定量分析。A A Ct = (CT target_CT 18S rENA)待_本 ~~ (Ct target_CT 18s ノ 校准样
ホ，选择每个基因在接种第一天的表达为校准样本，第3、5、7天为待测样本，例如
权利要求
1.果胶甲基酯酶基因Pcpme6的特异引物对，其特征在于所述引物对由序列表中序列I所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成。
2.检测或辅助检测辣椒疫霉的PCR试剂，其特征在于所述试剂含有权利要求I所述的特异引物对。
3.检测或辅助检测辣椒疫霉的PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有为权利要求I所述的特异引物对。
4.权利要求I所述的特异引物对在制备检测或辅助检测辣椒疫霉的试剂或试剂盒中的应用。
5.权利要求I所述特异性引物对在检测或辅助检测辣椒疫霉中的应用。
6.检测或辅助检测辣椒疫霉的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤用权利要求I所述特异性引物对对待测样品进行PCR，确定待测样品中是否含有辣椒疫霉或确定待测样品中辣椒疫霉的含量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于按照如下方法确定待测样品中是否含有辣椒疫霉以所述待测样品的基因组DNA或总RNA反转录得到的cDNA为模板，用权利要求I所述特异性引物对进行PCR扩增，检测得到的PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物满足下述I)或2)的条件，则所述待测样品含有辣椒疫霉或候选含有辣椒疫霉；若所述PCR扩增产物不满足所述I)或2)的条件，则所述待测样品不含有辣椒疫霉或候选不含有辣椒疫霉； 1)所述PCR扩增产物为173bp的片段； 2)所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示为100bp-200bp的条带。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中采用如下条件的PCR扩增确定待测样品中是否含有辣椒疫霉95°C预变性4min ;94°C变性lmin，50°C 30s, 72°C lmin，35个循环。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中采用实时荧光定量PCR确定待测样品中辣椒疫霉的含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述实时荧光定量PCR的条件为95°C预变性2min ;94°C变性15s，55。。退火15s，68。。延伸30s，45个循环。
全文摘要
本发明公开了基于果胶甲基酯酶Pcpme6基因开发的检测辣椒疫霉菌的引物及方法。本发明基于果胶甲基酯酶Pcpme6基因开发的检测辣椒疫霉菌的引物，由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成。该引物可对不同时期的辣椒疫霉以及不同辣椒疫病材料进行定性、定量分子检测，可对辣椒疫霉初侵染源及其侵染过程各个时期病菌消长动态进行检测与预警，便于及时确定病害最佳防控时期，特别是在病菌早期活动时期适时进行综合防控与治理，如根据对土壤中卵孢子检测的有无及多少，适时处理土壤，阻断源头病菌的繁殖与蔓延，降低了病害防控成本。
文档编号C12N15/11GK102628084SQ201210106669
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者张修国 申请人:山东农业大学