专利名称：血管瘤集落形成细胞的制作方法
技术领域：
本发明总的涉及产生和扩增人血管瘤集落形成细胞的方法。本发明更特别涉及利用两步处理法体外产生和扩增人血管瘤集落形成细胞的方法，第一步，在存在至少一种足够将人胚胎干细胞诱导分化成胚状体的量的生长因子的情况下，在无血清培养基中培养所述胚胎衍生干细胞；第二步，在存在至少一种足够使人血管瘤集落形成细胞在含胚状体的培养基中扩增的量的生长因子的情况下，在无血清培养基中培养所述胚状体。本发明还涉及人血管瘤集落形成细胞的制备。本发明还涉及使人血管瘤集落形成单位沿着造血细胞或内皮细胞谱系分化的方法，以及制备部分或完全分化自血管瘤集落形成细胞的细胞类型的 方法。血管瘤集落形成细胞及由其分化出的细胞具有各种体内外用途。能够在体外如此大批量地产生扩增的人血管瘤集落形成细胞，首次揭示了可大量衍化人血管瘤集落形成衍生细胞类型的潜力，所述人血管瘤集落形成衍生细胞类型例如人造血干细胞、或内皮细胞、分化的造血细胞(例如红细胞和血小板)，它们将具有多种治疗用途。此外，可将通过本发明衍生出的大量人血管瘤集落形成细胞以全新的治疗策略用于治疗造血细胞和内皮细胞紊乱或用于血液库存。
背景技术：
造血干细胞(HSC)能够自我更新，并能产生全部血细胞谱系。这些细胞位于骨髓，构成成人造血系统的基础。这些细胞的移植代表着现在临床上最常见的基于细胞的治疗。HSC移植被用于治疗患急性或慢性白血病，再生障碍性贫血和多种免疫缺陷综合症，以及多种非血液恶性肿瘤和自身免疫紊乱的患者。对于患血液恶性肿瘤的患者,HSC移植可以拯救患者免于治疗导致的发育不全(可以发生在高剂量化学疗法和/或放射疗法后)。尽管HSC移植被普遍应用于临床，但HSC的三种主要来源(人骨髓、外周血和脐带血)有限，因为需要成体HSC移植的患者中的三分之二缺乏良好匹配的供者。例如，对于任何一个特定的患者，其兄弟姐妹的人类白细胞抗原(HLA)与其相匹配的机会只有25%。HLAs是位于细胞表面的蛋白，它帮助免疫系统识别哪些细胞是自我的(属于自身)，哪些细胞是非我的(外源或来自于体外)。HLA蛋白由基因簇编码，所述基因簇形成位于人6号染色体的被称为主要组织相容性复合体(或MHC)的区域，由MHC基因座编码的这些蛋白在移植排斥中发挥重要作用。因此，也将HLA蛋白称为MHC蛋白。虽然使移植物的MHC分子与受者的MHC分子匹配能显著提高临床移植的成功率，但它不能杜绝排斥，即使移植发生在HLA相同的兄弟姐妹之间。这样的排斥可能由次要组织相容性抗原之间的差异触发。这些多态性抗原通常是与位于移植组织细胞上的MHC分子结合的"非我"的肽，而除非使用免疫抑制药物，即便MHC抗原匹配，次要组织相容性抗原的差异也常会导致移植受者的免疫系统最终排斥移植物。
各有三种类型的I型HLA和II型HLA。将I型和II型HLA匹配者(一般是兄弟姐妹)称为相关供者。存活率升高与受者和供者间I型HLA-A、HLA-B, HLA-C以及II型HLA-DRBl 和 HLA-DQBl 的匹配程度相关(Morishima 等，2002 Blood (99) :4200-6)。对于没有相匹配的相关供者的患者而言，可通过搜索供者库来提供具有HLA类型匹配的人。然而需要细胞或组织移植(例如HSC移植)的人数远远大于现存的适合于移植的细胞和组织供应。在这种情况下，常常不可能获得受者MHC蛋白和移植物的MHC蛋白之间的良好匹配便不奇怪了。所以，许多移植受者必需等待MHC匹配的移植物可获得，或者接受MHC不匹配的移植物，忍受更大剂量的免疫抑制药物，却仍然要冒排斥的风险。因此能够产生和操作HSC，和/或诱导受者对移植物的耐受，将会大大利于人类疾病的治疗和处理。根据在鸟胚胎，以及随后在蛙和哺乳动物中的研究工作，已证明血液和内皮的发育程序紧密相关。例如内皮细胞和造血细胞同时形成，在卵黄囊血岛中相距很近。所述卵黄囊血岛衍生自定居于卵黄囊的中胚层细胞的聚集物。这些聚集物的中心生成胚胎造血细胞，而外周群分化为内皮细胞，它形成围绕内部血细胞的血管系统。这些观察结果支持内皮细胞和造血细胞具有共同祖先的观点。另外，在斑马鱼和小鼠胚胎中，内皮谱系和造血谱系共享某些基因的表达，例如卩1让1、卩1七1、！161、1162、0)34、5。1和1 11狀1(卩1的等，1990 Blood(75) :2417-2426 ；Millauer等，1993 Cell (72) :835-846 ;Yamaguchi 等，I993Development (II8) :489-498 ；Anagnostou等，1994 PNAS USA(91) :3974-3978 ;Kallianpur 等，1994 Blood(83) :1200-12081 ;Young等，1995 Blood(85) :96-105, Asahara 等，1997 Science (275) :964-967 ；Kabrun 等，1997 Development (124) :2039-2048)。同样，某些基因突变影响内皮细胞和造血细胞的发育(Shalaby 等，1995 Nature (376) :62-66 ;Robb 等，1995 PNAS USA (92) :7075-7079 ；Shivdasani 等，1995 Nature (373) :432-434, Stainier 等，1995Development (121)3141-3150 ;Bollerot 等，2005 APMIS (113) :790-803)。而且，Flkl 或者 Fltl 的缺失(它们两个都是血管内皮生长因子(VEGF)的受体)导致破坏小鼠胚胎的造血和内皮发育。已有文献报导从小鼠胚胎干细胞体外生成小鼠成血管细胞(Choi等，1998Development 125:727-732)。而且已从人ES细胞衍生出能产生造血和内皮两种细胞的人前体细胞(Wang 等,2004 Immunity(21) :31-41 和 Wang 等,J Exp Med(201)1603-1614)，但是量少，最多数百个细胞。此外，尚无体外扩增成血管细胞前体细胞的方法或条件。因此需要一种方法产生和扩增大量人成血管细胞以及成血管细胞衍生细胞类型(即造血细胞和内皮细胞)，还需要所有含有所述量的成血管细胞或其衍生细胞类型的溶液/混合物。所述方法能增加细胞移植的有效性，也能用于各种其他治疗，例如诱导免疫耐受性。另一个急需用途是用于输血的血液。红十字会及其他血液供应单位报道几乎经常血液短缺。这种情况在血型独特的患者，Rh+患者，或者事故或灾难导致的大量伤亡中尤甚。另外，战时军队急需用于治疗战争相关的创伤的可用血液。本发明提供用于血液库存和输血的分化的造血细胞。本发明的细胞和方法将更安全可靠，优点在于无需传统的对献血者的依赖，并将有助于预防可用血液的严重短缺。发明概述
本发明通过提供体外产生和扩增人成血管细胞或血管瘤集落形成细胞的方法来克服了上述问题。根据本文公开的新方法扩增人成血管细胞或血管瘤集落形成细胞的能力允许产生可被用于各种治疗用途的细胞。另外，本发明提供产生可用于治疗用途的人成血管细胞或血管瘤集落形成谱系细胞(即，造血细胞和内皮细胞)的方法。本发明的方法还被用于产生大量可以商业规模应用的人成血管细胞或血管瘤集落形成细胞以及造血细胞和内皮细胞，及其分化细胞。
本发明提供体外产生和扩增人血管瘤集落形成细胞的方法，所述方法包括步骤(a)在存在至少一种足够将人胚胎衍生细胞诱导分化成胚状体的量的生长因子的情况下，在无血清培养基中培养包含所述胚胎衍生干细胞的细胞培养物；和(b)向所述含胚状体的培养物中加入至少一种生长因子，并继续在无血清培养基中培养所述培养物，其中所述生长因子的量足够使人血管瘤集落形成细胞在所述胚状体培养物中扩增，其中在所述方法步骤(a)和(b)的整个过程中使所述干细胞、胚状体和血管瘤集落形成细胞在无血清培养基中生长。本发明也提供体外产生和扩增人血管瘤集落形成细胞的方法，所述方法包括步骤(a)在存在至少一种足够将人胚胎衍生细胞诱导分化成胚状体的量的生长因子的情况下，在无血清培养基中培养包含所述胚胎衍生细胞的细胞培养物；(b)向所述含胚状体的培养物中加入至少一种生长因子，并继续在无血清培养基中培养所述培养物，其中所述生长因子的量足够使人血管瘤集落形成细胞在所述胚状体培养物中扩增，(C)将所述胚状体解聚为单细胞；(d)向所述含所述单细胞的培养物中加入至少一种生长因子，并继续在无血清培养基中培养所述培养物，其中所述生长因子的量足够使人血管瘤集落形成细胞在含所述单细胞的培养物中扩增，其中在所述方法步骤(a)-(d)的整个过程中使所述干细胞、胚状体和血管瘤集落形成细胞在无血清培养基中生长。在本发明的某些实施方案中，所述胚胎衍生细胞是胚胎干细胞。在本发明的产生和扩增人血管瘤集落形成细胞的方法的某些实施方案中，所述生长因子是包含同源异型盒蛋白，或功能变体，或其活性片段的蛋白。在某些实施方案中，所述同源异型盒蛋白是包括H0XB4，或其功能变体，或活性片段的蛋白。H0XB4可以是哺乳动物H0XB4，包括小鼠和人H0XB4。所述H0XB4蛋白可以是全长H0XB4蛋白。再一个实施方案中，所述H0XB4包括SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 4的氨基酸序列。在本发明的产生和扩增人血管瘤集落形成细胞的方法的某些实施方案中，所述包括H0XB4的生长因子是包括H0XB4和蛋白转导域(PTD)的融合蛋白。再一个实施方案中，通过接头连接所述PTD和H0XB4。再一个实施方案中，所述PTD是TAT蛋白，其功能变体或活性片段(包括TAT多肽)。在某些实施方案中，所述TAT蛋白包括SEQ ID NO 14的氨基酸序列。再一个实施方案中，所述PTD包括如SEQ ID NO : 14所示的TAT多肽的一个或多个拷贝。在某些实施方案中，所述PTD是SEQ ID NO: 15。
在本发明的产生和扩增人血管瘤集落形成细胞的方法的某些实施方案中，所述生长因子选自血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态生成蛋白(BMP)、干细胞因子(SCF)、Flt-3L(FL)促血小板生成素(TPO)和促红细胞生成素(EPO)。再一个实施方案中，在培养含有hES细胞的细胞培养物的0-48小时内将血管内皮生长因子(VEGF)或骨形态生成蛋白(BMP)，或两者加入到培养步骤(a)。又一个实施方案中，从开始步骤(a)的48_72小时内将所述干细胞因子(SCF)、Flt-3L (FL)或促血小板生成素(TPO)，或它们的任何组合加入到含有hES细胞的细胞培养物中。在本发明的产生和扩增人血管瘤集落形成细胞的方法的某些实施方案中，将包含H0XB4蛋白或其功能变体或活性片段(或结构域)的生长因子加入到步骤(S)，其中加入所述蛋白数次，例如每日一次或隔日一次。在本发明的产生和扩增人血管瘤集落形成细胞的方法的某些实施方案中，从开始步骤(a)的48-72小时内将所述包含同源异型盒蛋白的生长因子加入到步骤(b)。在本发 明的方法的某些实施方案中，从开始步骤(a)的48-72小时内将所述H0XB4蛋白或其功能变体或活性片段加入到步骤(b)。在某些实施方案中，本发明的产生和扩增人血管瘤集落形成细胞的方法还包括向步骤(b)中加入促红细胞生成素(EPO)的步骤。在某些实施方案中，在0016段描述的本发明的方法还包括向步骤(b)和(d)中加入促红细胞生成素(EPO)的步骤。在某些实施方案中，本发明的产生和扩增人血管瘤集落形成细胞的方法还包括纯化和/或分离人血管瘤集落形成细胞的步骤(s)。可用带抗CD71抗体的免疫亲和柱层析纯化所述血管瘤集落形成细胞。可按大小和/或形态分离所述血管瘤集落形成细胞。在本发明的产生和扩增人血管瘤集落形成细胞的方法的某些实施方案中，所述包含人胚胎衍生细胞的细胞培养物来源于人胚胎干细胞文库，其中所述人胚胎干细胞库包括干细胞，每个都是人群中至少一种MHC等位基因的半合子或纯合子，其中所述干细胞文库的每个成员都是相对于所述库中其他成员有不同的一套MHC等位基因的半合子或纯合子。再一个实施方案中，所述人胚胎干细胞文库包括干细胞，所述干细胞是人群中所有MHC等位基因的半合子或纯合子。这些方法产生人血管瘤集落形成细胞文库，每个都是人群中至少一种MHC等位基因的半合子或纯合子，其中所述干细胞文库的每个成员豆是相对于所述库中其他成员不同的一套MHC等位基因的半合子或纯合子。再一个实施方案中，这些方法产生人血管瘤集落形成细胞文库,所述人血管瘤集落形成细胞是人群中所有MHC等位基因的半合子或纯合子。因此，本发明也提供通过这些方法产生的人血管瘤集落形成细胞文库。可如下使用所述文库。本发明提供方法处理需要治疗的患者，涉及将人造血干细胞或人内皮细胞施用给所述患者，包括步骤(a)选择所述患者；(b)鉴定在所述患者细胞表面表达的MHC蛋白；(c)提供之前的0024段描述的人血管瘤集落形成细胞文库；
(d)从所述文库中筛选与所述患者细胞上的所述患者MHC蛋白匹配的人血管瘤集落形成细胞；(e)将步骤(d)中鉴定的所述人血管瘤集落形成细胞根据需求分化成人造血干细胞、内皮细胞或两者；(f)将从步骤(e)中得到的所述人造血干细胞、内皮细胞或两者施用给所述患者。可以在区域中心实施此方法，所述区域中心例如医院或医疗中心，或任何其他适当机构。在某些实施方案中，本发明的产生和扩增人血管瘤集落形成细胞的方法还包括使所述人血管瘤集落形成细胞在适于将所述人血管瘤集落形成细胞诱导分化成人造血干细胞的条件下生长的步骤。在某些实施方案中，本发明的产生和扩增人血管瘤集落形成细胞的方法还包括使所述人血管瘤集落形成细胞在适于将所述人血管瘤集落形成细胞诱导分化成人内皮细胞 的条件下生长的步骤。再一个实施方案中，所述适于将所述人血管瘤集落形成细胞诱导分化成人内皮细胞的条件包括让所述人血管瘤集落形成细胞在平板接种纤维连接蛋白的培养平板上生长。本发明的某些实施方案中，所述产生和扩增人血管瘤集落形成细胞的方法产生至少10，000个人血管瘤集落形成细胞，至少50，000个人血管瘤集落形成细胞，至少100，000个人血管瘤集落形成细胞,至少500，000个人血管瘤集落形成细胞，至少I X IO6个人血管瘤集落形成细胞，至少2 X IO6个人血管瘤集落形成细胞，至少3 X IO6个人血管瘤集落形成细胞，或至少4X IO6个人血管瘤集落形成细胞。这些方法产生可以包含10，000到4百万个人血管瘤集落形成细胞的细胞溶液。因此，本发明也提供包含至少10，000个人血管瘤集落形成细胞，至少50，000个人血管瘤集落形成细胞，至少100，000个人血管瘤集落形成细胞，至少500，000个人血管瘤集落形成细胞，至少I X IO6个人血管瘤集落形成细胞，至少2 X IO6个人血管瘤集落形成细胞，至少3 X IO6个人血管瘤集落形成细胞，或至少4 X IO6个人血管瘤集落形成细胞的人血管瘤集落形成细胞(可在无血清培养基中生长)的溶液。可将这些溶液注射给受试者。这些溶液可适用于冷冻。这些溶液可以不含血清。这些溶液中的人血管瘤集落形成细胞至少能够分化成造血细胞和内皮细胞，但也具有分化成其他细胞类型的更大的发育潜力。本发明也提供这些溶液在制备用于治疗可通过施用血管瘤集落形成细胞、造血细胞或内皮细胞来治疗的疾病的药物中的用途。本发明也提供产生适于注射给患者的人血管瘤集落形成细胞溶液的方法，包括分离如前所述的细胞溶液的步骤，和将所述细胞置于适合注射给患者的溶液的步骤。本发明也提供产生适于冷冻的人血管瘤集落形成细胞溶液的方法，包括分离如前所述的细胞溶液的步骤，和将所述细胞置于适合冷冻的溶液的步骤。本发明也提供将人造血干细胞施用给有此需要的患者的方法，包括步骤(a)选择有此需要的患者；(b)提供由本发明方法产生和扩增的人血管瘤集落形成细胞；(C)将所述人血管瘤集落形成细胞分化成人造血干细胞；和(d)将所有所述人造血干细胞中的一些施用给患者。本发明也提供将人造血干细胞施用给有此需要的患者的方法，包括步骤(a)选择有此需要的患者；(b)以至少10，000个细胞的数量提供人血管瘤集落形成细胞；(C)将所述人血管瘤集落形成细胞分化成人造血干细胞；和
(d)将一些或所有所述人造血干细胞施用给所述患者。本发明也提供将人内皮细胞施用给有此需要的患者的方法，包括步骤(a)选择有此需要的患者；(b)提供由本发明方法产生和扩增的人血管瘤集落形成细胞；(C)将所述人血管瘤集落形成细胞分化成人内皮细胞；和(d)将一些或所有所述人内皮细胞施用给所述患者。本发明也提供将人内皮细胞施用给有此需要的患者的方法，包括步骤(a)选择有此需要的患者； (b)以至少10，000个细胞的数量提供人血管瘤集落形成细胞；(C)将所述人血管瘤集落形成细胞分化成人内皮细胞；和(d)将一些或所有所述人内皮细胞施用给所述患者。在某些实施方案中，所述人血管瘤集落形成细胞的数量在10，000到4百万个细胞之间。本发明也提供治疗需要治疗的患者的内皮细胞紊乱的方法，包括步骤(a)选择有此需要的患者，(b)提供由上述方法产生和扩增的人血管瘤集落形成细胞，(C)将所述人血管瘤集落形成细胞分化成人内皮细胞，和(d)将一些或所有所述人内皮细胞施用给所述患者。本发明也提供治疗需要治疗的患者的内皮细胞紊乱的方法，包括步骤(a)选择有此需要的患者；(b)以至少10，000个细胞的数量提供人血管瘤集落形成细胞；(c)将所述人血管瘤集落形成细胞分化成人内皮细胞；和(d)将一些或所有所述人内皮细胞施用给所述患者。在某些实施方案中，所述人血管瘤集落形成细胞的数量在10，000到4百万个细胞之间。有待用这些方法治疗的内皮细胞紊乱包括心肌梗塞、中风、动脉粥样硬化和缺血。所述缺血可发生在脑、四肢、心脏、肺、皮肤和眼。本发明提供体外产生人造血干细胞的方法，包括步骤(a)提供由本发明方法产生和扩增的人血管瘤集落形成细胞；和(b)使所述人血管瘤集落形成细胞在适于将所述人血管瘤集落形成细胞诱导分化成人造血干细胞的条件下生长。本发明提供体外产生人内皮细胞的方法，包括步骤(a)提供由本发明方法产生和扩增的人血管瘤集落形成细胞；和(b)使所述人血管瘤集落形成细胞在适于将所述人血管瘤集落形成细胞诱导分化成人内皮细胞的条件下生长。本发明也提供扩增血管瘤集落形成细胞的方法，包括在存在足够支持所述血管瘤集落形成细胞增殖的量的包括同源异型盒蛋白(例如H0XB4)或其功能等效物或其活性片段的蛋白的情况下，使哺乳动物血管瘤集落形成细胞在无血清培养基中生长。所述待扩增的血管瘤集落形成细胞可以从脐带血、外周血或骨髓富集、纯化，或者分离。所述血管瘤集落形成细胞可以是人血管瘤集落形成细胞。所述方法可以产生包含10，000到4X IO6个，或者更多的人血管瘤集落形成细胞的溶液。本方法使用的H0XB4蛋白可以是适用于本发明的产生和扩增人血管瘤集落形成细胞的方法的任何蛋白。本发明也提供利用由本发明方法产生和扩增，或扩增的人血管瘤集落形成细胞诱导免疫耐受性的方法。筛选与同种异体移植物共享组织相容性标记物的耐受性人血管瘤集落形成细胞，并可将所述耐受性人血管瘤集落形成细胞于同种异体移植或细胞处理(再生患者需要的细胞功能)前，或与同种异体移植或细胞处理同时施用给人受者。产生的免疫耐受性随即降低对同种异体移植物或细胞治疗的急性或慢性排斥的风险。
由本文公开的方法产生的大量血管瘤集落形成细胞能够除去耐受方案中的毒性预处理步骤。可在植入移植物，或植入与供者血管瘤集落形成细胞匹配的器官、组织或细胞前给人受者施用供者的人血管瘤集落形成细胞。可从同一供者获得所述人血管瘤集落形成细胞和移植物。所述移植物可以来源于分化的供者人血管瘤集落形成细胞。也可从不同供者获得所述人血管瘤集落形成细胞和移植物，其中所述供者之间相匹配。可将所述人血管瘤集落形成细胞施用给人受者，以在有此需要的受者中诱导耐受性。在某些实施方案中，本发明涉及诱导人受者对供者同种异体移植物的耐受性的方法，其中所述方法包括步骤(a)给受者施用抑制T细胞共刺激的制剂(b)将由本文描述的方法产生和扩增，或扩增的人血管瘤集落形成细胞导入所述受者，和(C)将所述同种异体移植物移植给受者。所述人血管瘤集落形成细胞(供者细胞)促进所述受者接受所述同种异体移植物。在某些实施方案中，抑制T细胞共刺激的制剂是抑制或阻断CD40配体-CD40共刺激相互作用的制剂。所述方法还可包括施用抑制CD28-B7相互作用的制剂。所述方法可包括或不包括胸腺照射和/或T细胞耗尽或灭活。上述方法也可在没有全身照射产生的造血空间(hematopoietic space)的情况下产生混合嵌合现象。本发明也提供促进人受者对供者同种异体移植物的耐受性的方法，其中所述方法包括步骤(a)在所述受者中制造胸腺空间(thymic space) ； (b)在所述受者中耗尽或灭活供者反应性T细胞；(C)将所述供者人血管瘤集落形成细胞或与所述供者匹配的人血管瘤集落形成细胞导入受者；和(d)将所述同种异体移植物移植给受者，其中所述供者血管瘤集落形成细胞诱导对所述同种异体移植物的耐受性。在某些实施方案中，所述方法不包括制造造血空间的照射。所述方法可包括通过给受者施用至少一种选自胸腺照射、类固醇、皮质激素、布喹那(brequinar)、或免疫抑制剂或药物来制造胸腺空间。本发明也提供产生适用于输血的细胞的方法。例如本发明提供产生适用于输血的红细胞的方法。照这样，本发明提供溶液，以帮助缓解献血量的长期不足。在某些实施方案中，本发明提供将人血管瘤集落形成细胞体外分化成造血细胞的方法，所述方法包括步骤(a)提供人血管瘤集落形成细胞；和(b)将所述血管瘤集落形成细胞分化成分化的造血细胞。在某些实施方案中，本发明提供用体外分化自人血管瘤集落形成细胞的造血细胞进行输血的方法，所述方法包括步骤(a)提供人血管瘤集落形成细胞；(b)将所述血管瘤集落形成细胞分化成分化的造血细胞；和
(c)用所述分化的造血细胞进行输血。在某些实施方案中，所述血管瘤集落形成细胞恢复自冷冻培养物。在某些实施方案中，本发明提供用体外分化自人血管瘤集落形成细胞的造血细胞进行输血的方法，所述方法包括步骤(a)在存在至少一种足够将人胚胎衍生细胞诱导分化成胚状体的量的生长因子的情况下，培养包含所述胚胎衍生细胞的细胞培养物；(b)向所述含胚状体的培养物中加入至少一种生长因子，其中所述生长因子的量足够使人血管瘤集落形成细胞在所述胚状体培养物中扩增；(C)将所述血管瘤集落形成细胞分化成分化的造血细胞；和(d)用所述分化的造血细胞进行输血。在某些实施方案中，在所述方法步骤(a)的整个过程中使所述胚胎衍生细胞、胚状体和血管瘤集落形成细胞在无血清培养基中生长。在某些实施方案中，所述胚胎衍生细胞是胚胎干细胞。在某些实施方案中，本发明提供用体外分化自人血管瘤集落形成细胞的造血细胞进行输血的方法，所述方法包括步骤(a)在存在至少一种足够将人胚胎衍生细胞诱导分化成胚状体的量的生长因子的情况下，培养包含所述胚胎衍生细胞的细胞培养物；(b)向所述含胚状体的培养物中加入至少一种生长因子，其中所述生长因子的量足够使人血管瘤集落形成细胞在所述胚状体培养物中扩增；(C)将所述血管瘤集落形成细胞分化成分化的造血细胞；和(d)用所述分化的造血细胞进行输血。在某些实施方案中，在所述方法步骤(a)和(b)的整个过程中使所述干细胞、胚状体和血管瘤集落形成细胞在无血清培养基中生长。在本发明的某些实施方案中，所述胚胎衍生细胞是胚胎干细胞。在某些实施方案中，所述血管瘤集落形成细胞恢复自冷冻培养物。在某些实施方案中，本发明提供用体外分化自人血管瘤集落形成细胞的造血细胞进行输血的方法，所述方法包括步骤(a)在存在至少一种足够将人胚胎衍生细胞诱导分化成胚状体的量的生长因子的情况下，培养包含所述胚胎衍生细胞的细胞培养物；(b)向所述含胚状体的培养物中加入至少一种生长因子，其中所述生长因子的量足够使血管瘤集落形成细胞在所述胚状体培养物中扩增；(C)将所述胚状体解聚成单细胞；(d)向所述含所述单细胞的培养物中加入至少一种生长因子，其中生长因子的量足够使人血管瘤集落形成细胞在所述含所述单细胞的细胞培养物中扩增；(e)将血管瘤集落形成细胞分化成分化的造血细胞；和(f)用所述分化的造血细胞进行输血。在某些实施方案中，在所述方法步骤(a)-(b)的整个过程中使所述干细胞、胚状体和血管瘤集落形成细胞在无血清培养基中生长。 在本发明的某些实施方案中，所述胚胎衍生细胞是胚胎干细胞。
在某些实施方案中，所述生长因子是包括同源异型盒蛋白，或其功能变体，或其活性片段的蛋白质。在某些实施方案中，所述同源异型盒蛋白包括H0XB4蛋白，或其功能变体，或其活性变体。在某些实施方案中，所述分化的造血细胞以单个细胞类型产生。在某些实施方案中，所述单个细胞类型选自红细胞、血小板或吞噬细胞。在某些实施方案中，所述吞噬细胞选自粒细胞嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞或单核细胞。在某些实施方案中，其中所述红细胞表达血红蛋白F。在某些实施方案中，以约等于见于血液中的分化的细胞类型的比例混合所述单个细胞类型，其中所述见于血液中的分化的细胞类型的比例是96%的红细胞、I %的血小板和3%的吞噬细胞。在某些实施方案中，在同一步骤中产生多种分化的造血细胞类型。在某些实施方案中，所述多种分化的造血细胞类型选自红细胞、血小板或吞噬细胞。在某些实施方案中，所述吞噬细胞选自粒细胞嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞或单核细胞。在某些实施方案中，红细胞表达血红蛋白F。在某些实施方案中，产生的以约等于 见于血液中的分化的造血细胞类型的比例产生所述多种分化的造血细胞类型，其中所述见于血液中的分化的细胞类型的比例是96 %的红造血造血细胞、I %的血小板和3 %的吞噬细胞。在某些实施方案中，在输血前向所述分化的造血细胞中加入血浆。在某些实施方案中，所述血管瘤集落形成细胞与患者匹配，以保证能产生患者自身血型的分化的造血细胞。在某些实施方案中，所述血管瘤集落形成细胞对抗原因子A、B、Rh或它们的任意组合呈阴性。在某些实施方案中，所述分化的造血细胞是红细胞，且其中分化所述红细胞的步骤包括促红细胞生成素(EPO)。本发明也提供人血管瘤集落形成细胞，所述细胞至少能分化产生造血细胞或内皮细胞类型，其中所述人血管瘤集落形成细胞与其他人血管瘤集落形成细胞松散粘连。在某些实施方案中，本发明也提供人血管瘤集落形成细胞，所述细胞至少能分化产生造血细胞和内皮细胞类型，其中所述人血管瘤集落形成细胞与其他人血管瘤集落形成细胞松散粘连。在某些实施方案中，本发明提供人血管瘤集落形成细胞，所述细胞至少能分化产生造血细胞和内皮细胞类型，其中所述人血管瘤集落形成细胞与其他人血管瘤集落形成细胞松散粘连，且其中所述人血管瘤集落形成细胞不表达⑶34蛋白。在某些实施方案中，本发明提供人血管瘤集落形成细胞，所述细胞至少能分化产生造血细胞和内皮细胞类型，其中所述人血管瘤集落形成细胞不表达下列任何一种蛋白CD34、CD31、KDR 和 CD 133。在某些实施方案中，本发明提供包含人血管瘤集落形成细胞的细胞培养物，所述细胞至少能分化产生造血细胞或内皮细胞类型，其中所述人血管瘤集落形成细胞相互松散粘连。在某些实施方案中，本发明提供包含人血管瘤集落形成细胞的细胞培养物，所述细胞至少能分化产生造血细胞和内皮细胞类型，其中所述人血管瘤集落形成细胞相互松散粘连。在某些实施方案中，本发明提供包含基本纯化的人血管瘤集落形成细胞群的细胞培养物，所述细胞至少能分化产生造血细胞和内皮细胞类型，其中所述人血管瘤集落形成细胞相互松散粘连，并且其中所述人血管瘤集落形成细胞不表达⑶34蛋白。在某些实施方案中，本发明提供包含分化自胚胎衍生细胞的人血管瘤集落形成细胞的细胞培养物，其中所述人血管瘤集落形成细胞相互松散粘连。在某些实施方案中，所述细胞培养物包含至少I X IO6个人血管瘤集落形成细胞。在某些实施方案中，所述细胞培养物包含至少5 X IO6个人血管瘤集落形成细胞。在某些实施方案中，所述胚胎衍生细胞是胚胎干细胞系。在某些实施方案中，所述胚胎衍生细胞选自胚胎、卵裂球、胚泡或内细胞团。在某些实施方案中，本发明提供包含人血管瘤集落形成细胞的药物制剂，所述细胞至少能分化产生造血细胞或内皮细胞类型，其中所述人血管瘤集落形成细胞相互松散粘连。 在某些实施方案中，本发明提供包含人血管瘤集落形成细胞的药物制剂，所述细胞至少能分化产生造血细胞和内皮细胞类型，其中所述人血管瘤集落形成细胞相互松散粘连。在某些实施方案中，本发明提供包含人血管瘤集落形成细胞的药物制剂，所述细胞至少能分化产生造血细胞和内皮细胞类型，其中所述血管瘤集落形成细胞不表达下列任何一种蛋白CD34、CD31、KDR 和 CD 133。在某些实施方案中，所述药物制剂包含至少I X IO6个人血管瘤集落形成细胞。在某些实施方案中，所述制剂包含至少5 X IO6个人血管瘤集落形成细胞。在某些实施方案中，所述包含血管瘤集落形成细胞的药物制剂分化自胚胎衍生细胞。在某些实施方案中，所述胚胎衍生细胞是胚胎干细胞。在某些实施方案中，所述胚胎衍生细胞选自胚胎、卵裂球、胚泡或内细胞团。在某些实施方案中，本发明提供之前任何一段所述血管瘤集落形成细胞的冷藏制剂。在某些实施方案中，本发明提供含至少IXlO6个人血管瘤集落形成细胞的冷藏制齐U，其中所述血管瘤集落形成细胞不表达下列任何一种蛋白⑶34、⑶31、KDR和⑶133。在某些实施方案中，所述冷藏制剂包含至少5 X IO6个人血管瘤集落形成细胞。在某些实施方案中，所述含有人血管瘤集落形成细胞的冷藏制剂不表达CD34蛋白。在某些实施方案中，所述含有人血管瘤集落形成细胞的冷藏制剂不表达CD34、CD31、CD133和KDR蛋白。在某些实施方案中，所述含有人血管瘤集落形成细胞的冷藏制剂表达LM02 和 GATA2 蛋白。在某些实施方案中，本发明提供含有分化自前述血管瘤集落形成细胞的造血细胞的培养物。在某些实施方案中，本发明提供含有分化自前述血管瘤集落形成细胞的内皮细胞的培养物。在某些实施方案中，本发明提供含有分化自前述血管瘤集落形成细胞的平滑肌细胞的培养物。在某些实施方案中，本发明提供含有分化自前述血管瘤集落形成细胞的心肌细胞的培养物。
在某些实施方案中，本发明提供上述人血管瘤集落形成细胞在制备用于治疗有此需要的患者病况的药物中的用途。在某些实施方案中，本发明提供上述细胞培养物在制备用于治疗有此需要的患者病况的药物中的用途。在某些实施方案中，本发明提供上述药物制剂在制备用于治疗有此需要的患者病况的药物中的用途。本发明涵盖前述本发明的任何方面和实施方案的组合。附图简述图I显示衍生自成血管细胞的造血CFU，所述成血管细胞产生自Hl-GFP ES细胞。图2显示培养于无血清(干细胞系)培养基中的红细胞系集落形成单位(CFU-E)的细胞形态。图3显示培养于无血清(干细胞系)培养基中的多能集落形成单位(CFU-GEMM/Mix)的细胞形态。图4显示培养于无血清(干细胞系)培养基中的多能集落形成单位(CFU-GEMM/Mix)的细胞形态。图5显示培养于无血清(干细胞系)培养基中的粒细胞集落形成单位(CFU-G)和巨噬细胞集落形成单位(CFU-M)的细胞形态。图6显示培养于无血清(干细胞系)培养基中的粒细胞/巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)和巨核细胞巨噬细胞集落形成单位(CFU-Mk)的细胞形态。图7显示通过将衍生自(a)H9 ES细胞和(b)ACT30 ES细胞的成血管细胞重接种于基于基质胶的培养基中而形成管-索结构。图8显示由如实施例2所述培养于包被有纤维连接蛋白的培养皿中的EGM-2培养基中后，再培养于基质胶培养基中的Hl-GFP ES细胞产生的成血管细胞管-索结构。图8也显示当如实施例2所述将细胞与Alexa fluor标记的Ac-LDL温育时对Ac-LDL的吸收。中图上和右图上显不相差图。图9显示由如实施例2所述培养于包被有纤维连接蛋白的培养皿中的EGM-2培养基中的Hl-GFP ES细胞产生的成血管细胞中von Willebrand因子(vWF)(浅灰色染色)的表达。
图10显示如实施例4所述注射到SCID小鼠中的经苏木精和曙红(H&E)染色的基质胶填料横切片中的血管形成。图11显示如实施例4所述针对人特异核抗体的阳性染色(浅灰色染色)表明，基质胶填料横切片中的血管是衍生自人成血管细胞的细胞。图 12 显示人 H0XB4(登录号 NM_024015. 4 ;GI :85376187) (SEQ ID NO :2)的 mRNA序列。图13 显示人 H0XB4(登录号 NP_076920. I ；GI :13273315) (SEQ ID NO :1)的氨基
酸序列。图14 显示人 H0XB4(登录号 BC049204. I ；GI :29351567) (SEQ ID NO :4)的 mRNA 序列。图15 显示人 H0XB4(登录号 AAH49204. I ；GI :29351568) (SEQ ID NO :3)的氨基酸、序列。图16显示如实施例I和2所述衍生自人ES细胞的成血管细胞(BL-CFC)的表型特征(a)成血管细胞集落 或胚细胞集落(BL-CFC或BC，X 400) ； (b)次级EB (X 400) ； (c)经赖-吉染色的胚细胞(hES-BC细胞)(X1000) ； (d-f) =GATA-I染色；(d)用GATA-1染色的胚细胞(X600)和(e)用GATA-I和DAPI染色的胚细胞；(f)用GATA-1和DAPI染色的BM细胞(X400)。(g-i) LM02染色；(g)用LM02染色的胚细胞(X600)和(h)用LM02和DAPI染色的胚细胞(X600)；⑴用LM02和DAPI染色的K562细胞(X1000) ； (j-m) :CD71染色(亮灰色或浅灰色)；(j)用CD71染色的胚细胞(X600)和(k)用CD71和DAPI染色的胚细胞(X600) ； (m)用CD71和DAPI染色的BM细胞(X1000) ； (n-p) CXCR-4染色(亮灰色或浅灰色)；(n)用CXCR-4染色的胚细胞(X600)和(o)用CXCR-和DAPI染色的胚细胞(X600) ;(p)用CXCR-4和DAPI染色的BM细胞(X600) ; (q_s)Epo受体染色(中灰色)；(q)用Epo受体染色的胚细胞(X600)和(r)用Epo受体和DAPI染色的胚细胞(X600)；(s)用Epo受体和DAPI染色的BM细胞(X 600) ; (t_v) Tpo受体染色(中灰色)；⑴用Tpo受体染色的胚细胞(X600)和(U)用Tpo受体和DAPI染色的胚细胞(X600) ； (v)用Tpo受体和DAPI染色的BM细胞(X 1000)。注意将本图(d)和(n)中的hES_BC(成血管细胞)细胞用GATA-I和CXCR-4抗体进行双重染色，但分别呈现；也将本图(q)和⑴中的hES-BC (成血管细胞)细胞用Epo-受体和Tpo-受体抗体进行双重染色，并分别呈现。图17显示体外衍生自人ES细胞的成血管细胞(BL-CFC或胚细胞)的功能特征(a-d)衍生自经纯化的成血管细胞的造血CFU (a) CFU-红细胞系(X 100) ； (b) CFU-粒细胞(XlOO) ; (c)CFU-巨噬细胞；和(d)CFU-多谱系(混合，X 100) ; (e_h)CFU-细胞的Wright-Giemsa 染色(e)红细胞系(XlOOO) ； (f)粒细胞(XlOOO) ； (g)巨噬细胞(X400)和(h)，混合(X 1000)。(i-k) :CFU细胞的免疫染色(i)用CD235a染色的CFU-红细胞(箭标，X 1000) ； (j)用CD13染色的CFU-粒细胞(箭标，X 1000)和(k)用CD45染色的CFU-混合细胞(箭标，X 1000)。(m-p和v-y)混合的CFU细胞的FACS分析(m)小鼠IgG同种型对照；(n) CD45 ； (O) CD13 和(p) CD235 ； (v)小鼠 IgG 同种型对照；(w) CD45 和 CD235a ； (x) CD13和⑶45 ;和(y)⑶13和⑶235a。(q_u和z-cc)衍生自经纯化的成血管细胞的内皮细胞，或胚细胞或hES-BC细胞(q)将衍生自成血管细胞的粘连细胞平板接种后在基质胶上形成的毛细管样结构(X100) ;(r)衍生自成血管细胞的内皮细胞的Ac-LDL吸收(灰色)(X200)；(s)衍生自成血管细胞的内皮细胞的vWF表达(箭标)，用DAPI染色核(X600) ； (t)在衍生自成血管细胞的内皮细胞中定位PEC AMI (亮色染色)，用DAPI染色核(图中的圆形)(X200) ；(u)在衍生自成血管细胞的内皮细胞中定位VE-该粘蛋白(箭标)，用DAPI染色核(圆形)(X200)。(z)最新的Ac-LDL(箭头)和vWF表达(箭标，X600) ;aa) Ac-LDL吸收(箭头)和VE该粘蛋白的表达(箭标，X 600) ； (bb) vWF (箭标)和CD31 (箭头，X 600)的表达；(Cc)VE-该粘蛋白(箭标)和⑶31 (箭头，X 600)的表达。见实施例2。图18显示衍生自hES细胞的胚细胞集落的集落生成。(a-c):胚细胞集落的集落生成，(a)和(b)，在WAOl-GFP和MAOl EB的混合物中形成的两个胚细胞集落，它们证明了所述胚细胞集落的克隆起源；(a)相位图象(X 100) ； (b)GFP图像(X 100) ； (c)从单个细胞形成的胚细胞集落(X400)。(d)和(e):在液体培养中扩增单个胚细胞集落，观察造血和内皮两种谱系(X200)。(d)，X 200(e), X400 ；(f-h):衍生自单个BC的内皮细胞(f)在基质胶上平板接种衍生自单个BC的粘附细胞后形成的毛细管样结构(XlOO) ；(g)衍生自单个BC的内皮细胞对Ac-LDL的吸收(箭标)，用DAPI染色核(X400) ； (h)在单个BC衍生内皮细胞中vWF的表达(箭标)，用DAPI染色核(X400)。(i-m):衍生自单个BC的造血 CFU: (i) CFU-红细胞系(X100) ;(j) CFU-粒细胞(X100) ;(k)CFU_ 巨噬细胞(X100)；和(m) CFU-多谱系(混合，X 100)。凝胶电泳图显示对衍生自WAOl-GFP+和MAOl-GFP细胞的平板接种混合物的GFP+和GFP-hES-BC (成血管细胞)中GFP序列的PCR分析。泳道WA01-GFP+，亲本 WAOl/GFP+hES 细胞；MA01 GFP,亲本 MAOl hES 细胞；H20，水阴性对照；BC-GFP+,来自细胞混合接种物的GFP阳性BC ； 1-10,来自细胞混合接种物的GFP阴性BC。将肌形成蛋白基因用作PCR反应对照。见实施例2。图19提供tPTD-H0XB4融合蛋白的特征。( A)融合了 6xHis的tPTD_H0XB4重组蛋白在大肠杆菌中表达，用镍ProBand树脂对其进行纯化。通过SDS-PAGE凝胶电泳检验两批(命名为(I)和(2))经脱盐的tPTD-H0XB4蛋白的纯度和浓度。(B) tPTD_H0XB4蛋白在含5% FBS的培养基中不稳定，但是(C)在含活ES细胞的无血清培养基中保持完整(N =仅StemlineII培养基；h =小时)。图20显示全身注射hES-衍生成血管细胞后缺血视网膜血管系统的稳健修复。通过对小鼠眼前房施加2小时流体静压来诱导视网膜缺血。七天后玻璃体内或者静脉内注射经荧光标记的(GFP+)成血管细胞。一天后对动物实施安乐死。将眼摘出、解剖，并将视网膜展平，用激光扫描共聚焦显微术成像，或进行切片用于成像，(a)来自典型对照(未受伤害的)眼的拼接图象，显示典型的视网膜血管解剖学没有绿色荧光背景；也各自显示了 GFP+通道(下插图)和GFP-通道(上插图)；(b)来自同一动物的经处理的眼的拼接图象，显示经荧光标记的(GFP+)成血管细胞衍生细胞(血管系统的明亮区域)掺入缺血的血管系统；也各自显示了绿色细胞(GFP+成血管细胞，下插图)和未标记细胞(上插图)，如实施例5所述。(c)未受损伤的对照的拼接图象(没有GFP荧光(亮灰或浅灰))，(d)和(e)是全身注射成血管细胞2天后(d)和7天后(e)缺血眼的拼接图象(GFP+细胞显示亮灰或浅灰)。(f，X 600，共聚焦)，荧光免疫细胞化学共定位成血管细胞(hES-BC)细胞-衍生的内皮细胞存在于经历了 I/R损伤的小鼠眼横切片的受损伤的血管系统中；相邻内界膜的神经节细胞层中的血管腔的高倍放大视图显示所述血管腔被内皮细胞(箭头，CD31)和衍生自成血管细胞(hES-BC)的成熟内皮细胞围绕(箭标,人核抗原)。上插图和中插图各自是用来制造合成图象的人核抗原和⑶31通道。下插图是同一区域的低倍放大视图，其中方框显示全图(all panels)描绘的区域。V =玻璃体；IPL =内丛状层；RPE =视网膜色素上皮细胞层；Ch =脉络膜。见实施例5。图21显示成血管细胞、或胚细胞或hES-BC细胞掺入糖尿病大鼠的视网膜血管系统。(a)和(b)显示向玻璃体内施用成血管细胞2天后，糖尿病大鼠的融合的视网膜血管系统图像，显示成血管细胞大范围掺入大小血管(明亮区域或浅灰色区域)；(C)，施用成血管细胞2天后，对照大鼠(非糖尿病大鼠)的融合，显示成血管细胞(或成血管细胞衍生细胞)并为掺入血管系统而形成位于视网膜顶部的层(浅灰色层)。(d，X 100)，向非糖尿病对照大鼠玻璃体内注射胚细胞2天后得到的切片，它对人核抗原染色呈阴性，但对内皮明显呈阳性(⑶31，箭标)。(e, X 100)和(f，X600，共聚焦)是向糖尿病大鼠玻璃体内注射成血管细胞2天后得到的大鼠眼切片，并用CD31和人核抗原抗体进行染色，清楚地显示用CD31和人核抗原的染色共定位于视网膜神经节细胞层的血管腔中内衬的细胞中，刚好位于将神经视网膜从玻璃体中分离的内界膜后(箭标表示明亮区域)。见实施例6。图22显示注射成血管细胞后缺血后肢肌肉和梗塞心脏中的内皮分化。a、b、h和i :梗塞心脏中成血管细胞或hES-BC细胞的分化。(a(200X))，用人特异性vWF抗体免疫染色的对照小鼠的梗塞心肌切片，显示没有人vWF着色；(b，200X)和(i，X600共聚焦)，注射成血管细胞4周后的用人特异性vWF抗体免疫染色((b)和(i)的浅灰色或明亮区域)的梗塞心肌切片；(h)经假手术(sham operation)、对照培养基和成血管细胞处理的小鼠的存活曲线。c-g :在缺血后肢肌肉中的成血管细胞分化，(c，50X)，用人特异性vWF抗体免疫染色的对照小鼠的后肢肌肉切片，显示没有人vWF着色；(d，50X)和(e，600X，共聚焦)，注射成血管细胞4周后的用人特异性vWF抗体免疫染色(浅灰色)的缺血后肢肌肉切片；
(f)通过手术诱导的缺血四肢中的血流恢复。将接受6 X IO5个成血管细胞的小鼠和仅仅接 受培养基的小鼠结扎后的3-30天连续监控后肢血流。通过缺血肢和非缺血肢之间的流量比计算血流；(g)，激光多普勒血流图像。对照(培养基)图像和注射BC细胞的缺血动物图像(每组n = 6)。见实施例7和8。图23显示GFP (最浅或最亮的区域)和cTnl (中灰)在心肌梗塞(MI)小鼠的心脏组织切片上的免疫染色(放大200X)。见实施例8。箭标指出衍生自注射的成血管细胞(hES-BC)的双阳性着色细胞。图24显示成血管细胞(hES-BC)分化成平滑肌细胞。对分离自成血管细胞(hES-BC)的RNA进行PCR测定得知，成血管细胞表达平滑肌特异基因。成血管细胞(hES-BC)也体外分化成平滑肌细胞。钙调理蛋白(calponin)和a-SMA的免疫染色显示分化的细胞表达这两种平滑肌细胞标记物。发明的详细说明为有助于完全理解本发明，提供以下详细说明。除非另有定义，本文所用的全部技术和科学术语的含义与本发明所述领域技术人员通常所理解的一致。尽管可将与本文描述类似或等同的方法和材料用于本发明或测试本发明，下面描述适当的方法和材料。仅将这些材料、方法和实施例用于说明，而非意在限制本发明的范围。将本文提到的所有出版物、专利、专利公开和申请及其他文献通过引用整体并入本文。可将说明书中通篇使用的术语“包含”理解为包含一定的整数或整数群的意思，但并不排除任何其他整数或整数群。为了进一步定义本发明，提供下列术语和定义。本文使用的术语"人胚胎干细胞"(hES细胞)与本领域使用的一样。所述术语包括衍生自人胚泡或桑椹胚的内细胞团的可以作为细胞系连续传代的细胞。所述hES细胞可源于卵细胞与精子或DNA的受精，核移植，单性生殖，或通过使HLA区域纯合的方法产生hES细胞。人ES细胞也源于合子，卵裂球，或胚泡阶段的哺乳动物胚胎，可通过精子和卵细胞融合，核移植，单性生殖，或染色质重编程及随后将所述重编程的染色质融合到质膜而产生细胞来产生所述人ES细胞。本发明的人胚胎干细胞可以包括但不限于ACT-4、No. 3、H1、H7、H9、H14和ACT30胚胎干细胞。
术语“蛋白转导域”(“PTD”)指可穿过细胞膜进入细胞，或者可协调或增加例如有PTD附着的另一个分子(例如蛋白结构域)穿过细胞膜进入细胞的速度的任何氨基酸序列。所述蛋白转导域可以是天然存在的大蛋白的一部分(例如病毒蛋白(例如HIV TAT)的PTD)的结构域或序列，或者是合成或人造的氨基酸序列。概述本发明提供产生和扩增源自人胚胎衍生细胞的人血管瘤集落形成细胞的方法，含人血管瘤集落形成细胞的制剂和组合物，产生从血管瘤集落形成细胞部分或终端分化的多种细胞类型的方法，治疗性应用血管瘤集落形成细胞的方法，和治疗性应用从血管瘤集落形成细胞部分或终端分化的多种细胞类型的方法。术语“成血管细胞”和“血管瘤集落形成细胞”在本申请中可互换使用。这些细胞 可以基于多种结构和功能特征进行描述，包括但不限于，一种或多种标记物的表达(RNA或蛋白)或不表达(RNA或蛋白)。血管瘤集落形成细胞至少能够分化成造血细胞类型或内皮细胞类型。血管瘤集落形成细胞优选有双重潜能，至少能够分化成造血细胞类型和内皮细胞类型。同样地，本发明的血管瘤集落形成细胞至少有一种潜能，优选有双重潜能。然而此夕卜，血管瘤集落形成细胞可具有更大程度的发育潜力，并在某些实施方案中，可分化形成其他谱系的细胞类型。在某些实施方案中，所述血管瘤集落形成细胞能够分化形成其他中胚层衍生物，如心脏细胞(例如心肌细胞)和/或平滑肌细胞。本发明也提供扩增从任何来源或通过本领域已知的任何其他方法获得的哺乳动物血管瘤集落形成细胞的方法，所述任何来源的哺乳动物血管瘤集落形成细胞包括ES细胞，胚泡或卵裂球，胎盘或脐带组织的脐带血，外周血，骨髓，或其他组织。人血管瘤集落形成细胞还可以产生自人胚胎衍生细胞。人胚胎衍生细胞可以是基本上同质种群的细胞，异质种群细胞，或胚胎组织的全部或部分。作为可用于本发明方法的胚胎衍生细胞的例子的人血管瘤集落形成细胞可以产生自人胚胎干细胞。这样的胚胎干细胞包括胚胎干细胞，来源于或利用如无论是否由受精、体细胞核移植(SCNT)、单性生殖、雄核发育、或其他有性或无性方法产生的胚泡，平板培养的ICMs，一个或多个卵裂球，或其他前移植阶段的胚胎或胚胎样结构部分。在某些实施方案中，成血管细胞还可分化成造血细胞，包括但不限于血小板和红细胞。这样的细胞可用于输血。能够产生大量用于输血的细胞将缓解全国血库和医院的血液长期存储不足。在某些实施方案中，本发明的方法使产生用于输血的通用细胞。具体可容易得到0型和Rh-型红细胞，并可以将它们作为输血的通用血液来源。本发明的方法使体外大量扩增成血管细胞，用于各种商业和临床应用。成血管细胞的体外扩增指成血管细胞的增殖。当本发明的方法能将人成血管细胞细胞扩增到商业上有用的数量时，本发明也涉及大量的成血管细胞和包含大量人成血管细胞(例如至少10，000、100，000或500，000个细胞)的细胞制剂。在某些实施方案中，所述细胞制剂包含至少I X IO6个细胞。在其他实施方案中，所述细胞制剂包含至少2 X IO6个人成血管细胞，再一个实施方案中至少3 X IO6个人成血管细胞。仍在其他的实施方案中，所述细胞制剂包含至少4X IO6个人成血管细胞。本发明涉及包含10,000到4百万或更多哺乳动物(例如人)成血管细胞的溶液，制剂，以及组合物。在所述溶液、制剂和组合物中的成血管细胞数目可以是10，000到4百万，或以上中的任意值。所述数目可以是，例如20，000、50，000、100，000、500，000、1百万
坐坐寸寸O类似地，本发明涉及人成血管细胞后代细胞(例如人造血细胞，包括人造血干细胞和内皮细胞)的制剂。本发明还涉及产生、贮存和分配成血管细胞和/或成血管细胞谱系细胞的方法。本发明也提供适于给人或动物患者输血的方法和溶液。在特定实施方案中，本发明提供制备红细胞和/或血小板，和/或其他用于输血的造血细胞类型的方法。在某些实施方案中，本发明适用于向血库和医院提供用于在外伤或在血液相关疾病和病症的治疗中输血的血液。在某些实施方案中，本发明提供通用供血细胞红细胞。在某些实施方案中，所述红细胞在输血之前有功能，且表达血红蛋白F。
本发明也提供人血管瘤集落形成细胞，含基本上纯化的人血管瘤集落形成细胞群的细胞培养物，含人血管瘤集落形成细胞的药物制剂和所述血管瘤集落形成细胞的冷藏制齐U。在某些实施方案中，本发明提供所述人血管瘤集落形成细胞在制备用于治疗有此需要的患者病况的药物中的用途。此外，本发明也提供所述细胞培养物在制备用于治疗有此需要的患者病况的药物中的用途。本发明也提供所述药物制剂在制备用于治疗有此需要的患者病况的药物中的用途。可以根据所述血管瘤集落形成细胞的结构特性对其进行识别和表征。在某些实施方案中，这些细胞具体是独特的，因为它们相互之间松散粘连(与其他的血管瘤集落形成细胞松散粘连)。因为这些细胞仅仅相互松散粘连，可以只利用机械解离技术(而无需酶解技术)即可将血管瘤集落形成细胞的培养物或集落解离成单细胞。这些细胞相互粘连足够松散，仅仅只需要机械解离(而非酶解或者机械和酶解结合)就足以将培养物或集落解聚，基本上无损于细胞活力。换句话说，相比用酶解细胞团块后观察到的实质损伤和死亡，机械解离不需要可导致细胞实质损伤和死亡的力度。此外，可以通过一种或多种标记物的表达或不表达(在基因或蛋白水平上估计)识别或表征血管瘤集落形成细胞。例如在某些实施方案中，可以根据一种或多种下列细胞表面标记物的不表达(例如可以根据至少一种，至少两种，至少三种或四种下列标记物不表达来表征所述细胞)来识别或表征血管瘤集落形成细胞⑶34、KDR、⑶133或⑶31。此夕卜，也可以根据GATA2和/或LM02的表达来识别或表征血管瘤集落形成细胞。此外，也可以通过一种或多种标记物(分析于表2)的表达或不表达来识别或表征(在基因或蛋白水平上估计)血管瘤集落形成细胞。可以根据这些结构或功能特点中的一点或任意组合识别或表征本发明的血管瘤集落形成细胞。需知，虽然这些细胞可以有任意种来源，例如胚胎组织、产前组织、围产期组织，所述术语"血管瘤集落形成细胞"适用于至少能够分化形成造血细胞类型和/或内皮细胞类型，并且具有一种或多种前述结构或功能特点的无论任何的来源的细胞。体外分化人胚胎干细胞以获得胚状体和成血管细胞本发明提供产生和扩增衍生自人胚胎干细胞，或人胚泡或卵裂球的人成血管细胞的方法。可纯化和/或分离如此产生的所述成血管细胞。人血管瘤集落形成细胞还可以产生自人胚胎衍生细胞。人胚胎衍生细胞可以是基本上同质种群的细胞，异质种群细胞，或胚胎组织的全部或部分。作为可用于本发明方法的胚胎衍生细胞的例子的人血管瘤集落形成细胞可以产生自人胚胎干细胞。这样的胚胎干细胞包括衍生自或利用无论是否由受精、体细胞核移植(SCNT)、单性生殖、雄核发育、或其他有性或无性方法产生的如胚泡，培养ICMs，一个或多个卵裂球，或其他前移植阶段的胚胎或胚胎样结构部分的胚胎干细胞。此外，血管瘤集落形成细胞还可以产生自其他胚胎衍生细胞。例如，血管瘤集落形成细胞可以产生自(无需经历胚胎干细胞衍化步骤)或利用无论是否由受精、体细胞核移植(SCNT)、单性生殖、雄核发育、或其他有性或无性方法产生的平板培养的胚胎，ICMs，胚泡，滋养层/滋养外胚层细胞，一个或多个卵裂球，滋养层干细胞，胚胎生殖细胞，或移植前阶段的胚胎或胚胎样结构的其他部分。血管瘤集落形成细胞还可以类似利用部分分化自胚胎衍生细胞的细胞或细胞系产生。例如如果将人胚胎干细胞系用于产生比血管瘤集落形成细胞处于更早发育阶段的的细胞，根据发展潜力和可塑性，则可将这样的胚胎衍生细胞用于产生血管瘤集落形成细胞。 此外，血管瘤集落形成细胞也可产生自其他产前或出生前后来源，包括但不限于脐带、脐带血、羊水、羊膜干细胞和胎盘。注意，当血管瘤集落形成细胞产生自人胚胎组织时，可能需要形成胚状体的步骤。然而，假设胚状体的形成至少部分有助于重演发育早期胚层的三维空间相互作用，当胚胎衍生细胞已经具有实现与胚状体形成步骤实质上相同目的的结构或组织时，这一步骤不是必需的。举例来说，当血管瘤集落形成细胞产生自平板培养的胚泡时，所述胚泡的细胞中间已经存在三维空间组织水平。同样地，无需胚状体形成步骤来提供细胞间的信号，诱导的线索，或三维结构。可将本发明的方法和用途用于产生源于胚胎衍生细胞的血管瘤集落形成细胞。在某些实施方案中，所述胚胎衍生细胞是胚胎干细胞。在某些其他实施方案中，所述胚胎衍生细胞是平板培养的胚胎，ICMs，胚泡，滋养层/滋养外胚层细胞，一个或多个卵裂球，滋养层干细胞，或早期移植前胚胎的其他部分。对于任何前述事项，所述胚胎衍生细胞可以来自由受精，体细胞核移植(SCNT)，单性生殖，雄核发育，或其他有性或无性方式产生的胚胎。在本申请中，当描述具体涉及从胚胎干细胞产生血管瘤集落形成细胞的方法时，本发明类似预期产生来自或使用其他胚胎细胞的血管瘤集落形成细胞，，以及利用产生的细胞实施任何相同的治疗用途。在本发明的某些方面，所述人胚胎干细胞可以是本方法的起始材料。可以用本领域已知的任何方法培养所述胚胎干细胞，例如在有无饲养细胞的情况下。胚胎干细胞可以在含血清培养基中形成悬浮的胚状体("EB" ) (Wang等，2005J Exp Med(201) :1603-1614 ；ffang 等，2004 Immunity(21) :31-41 ;Chadwick 等，2003Blood (102) :906-915)。然而血清的加入引入一些挑战，包括实验的可变性，成本，潜在感染物和有限的供应。进一步，对于临床和某些商业应用，血清的使用需要额外遵照美国政府和国际社会的关于生物制品的规定。本发明提供不使用血清从胚胎干细胞产生和扩增人成血管细胞的方法。相对于需要血清的条件，所述无血清条件更有助于在好的生产工艺(GMP)指导下进行规模化生产。此外，无血清条件延长加入到培养基的某些因子的半衰期(例如无血清培养基中蛋白质(包括生长因子、细胞因子和H0XB4)的半衰期增加)。在某些实施方案中，在本发明的所有方法中使用无血清培养基产生和扩增人成血管细胞。产生和扩增人成血管细胞的方法的第一步中，使人干细胞在无血清培养基中生长，并将其诱导分化成胚状体。为了诱导胚状体形成，可将胚胎干细胞沉淀并重悬浮在无血清培养基(例如，在Stemline I或II培养基(Sigma )，培养基中补充有一种或多种形态因子和细胞因子，然后平板接种于附着性差(例如附着性超差)的培养皿上。形态因子和细胞因子可以包括但不限于，骨形态生成蛋白(例如BMP2、BMP-4、BMP-7，但非BMP-3)和VEGF、SCF和FL。可将骨形态生成蛋白和VEGF单独使用，或与其他因子联合使用。可在细胞培养的0-48小时内将形态因子和细胞因子加入到培养基。于这些条件下在存在早期造血扩增细胞因子(包括但不限于促血小板生成素(TPO)、Flt-3配体和干细胞因子(SCF))的情况下进行温育，使所述平板培养的ES细胞形成EB。除TPO、Flt-3配体和SCF外，还可将VEGF、BMP-4和HoxB4加入到培养基。在一个实施方案中，使人ES细胞首先在BMP-4和VEGF165 (例 如25-100ng/ml)存在的条件下生长，然后在BMP-4、VEGF16S、SCF、TPO和FLT3配体(例如10-50ng/ml)和HoxB4(例如1.5_5iig/ml的本文公开的三重蛋白质转导域_HoxB4融合蛋白)存在的条件下生长。可以在平板接种后48-72小时时加入所述额外因子。在本发明的方法中，人成血管细胞分离自早期胚状体(“EB”)。从早期EB分离成血管细胞支持这些细胞的体外扩增。对于人细胞，可以从生长短于10天的EB中获得成血管细胞。在本发明的某些实施方案中，成血管细胞细胞出现在生长2-6天的人EB中。根据一个实施方案，可从生长4-6天的人EB中鉴定和分离成血管细胞。在其他的实施方案中，使人EB生长2-5天，然后分离成血管细胞。在某些实施方案中，使人EB生长3-4. 5天，然后分离成血管细胞。在某些实施方案中，洗脱并解离早期EB (例如，使用胰蛋白酶/EDTA或胶原酶B)。将选定数量的细胞(例如2-5 X IO5个细胞)随后与优化成适于成血管细胞生长的无血清甲基纤维素培养基(例如BL-CFU培养基，如干细胞技术目录H4436，或成血管细胞细胞扩增培养基(HGM)，或含1.0%甲基纤维素于MDM，1-2%牛血清白蛋白，0. ImM 2-巯基乙醇，10 y g/ml rh_ 膜岛素,200 u g/ml 饱和铁人转铁蛋白，20ng/ml rh-GM-CSF, 20ng/ml rh-IL-3,20ng/ml rh-IL-6,20ng/ml rh-G_CSF(" rh"代表"重组的人 ")的任何培养基)混合。可向所述培养基补充早期细胞因子(包括但不限于，EPO、TPO、SCF、FL、FLt_3、VEGF、BMP (例如BMP2、BMP4和BMP7，但不是BMP3))和H0XB4 (或另一个同源异型盒蛋白)。在某些实施方案中，将促红细胞生成素(EPO)加入到培养基。再一个实施方案中，将EPO、SCF、VEGF, BMP-4和HoxB4加入到培养基。在另一个实施方案中，使所述细胞在EPO、TPO和FL存在的条件下生长。在某些H9是起始人ES细胞系的实施方案中，将EP0、TP0和FL加入到培养基。除EPO、TPO和FL外，源于H9或其他ES细胞的细胞培养基还可包含VEGF、BMP-4和 HoxB4。将通过所述方法获得的细胞(细胞可能在BL-CFU培养基中)(包括成血管细胞)平板接种于附着性超差的培养皿上，并在CO2恒温箱中温育直到长出成血管细胞集落。一些细胞可能形成次级EB。大约3-6天(且在一些情况下是3-4. 5天)后观察到成血管细胞集落。可根据成血管细胞集落特殊的葡萄状形态和/或小尺寸将其与其他细胞如(如次级EB)区分开。另外，可通过某些标记物的表达(例如，早期造血细胞和内皮细胞标记物的表达)，以及至少能分化成造血细胞和内皮细胞的能力(见下文，衍生成成血管细胞谱系细胞)鉴定成血管细胞。例如当成血管细胞缺乏成熟内皮细胞或造血细胞的某些特征时，可通过某些标记物的存在(例如CD71+)和其他标记物的不存在(例如CD34-)鉴定这些细胞。成血管细胞也可表达GATA-I和GATA-2蛋白，CXCR-4和TPO和EPO受体。另外，成血管细胞可通过其他标记物(例如⑶31、⑶34、KDR或其他粘附分子)不表达或低表达来表征。而且，成血管细胞的可通过某些基因(例如与成血管细胞和早期成红血细胞发育相关的基因(如SCL、LM02、FLT-1、胚胎胎儿球蛋白基因、NF-E2、GATA-U EKLF, ICAM-4、血型糖蛋白(glycophoriuns)和EPO受体)的表达进行表征。因此，成血管细胞可按大小分离(小于其他细胞)或用抗⑶71+抗体纯化，例如通过免疫亲合柱层析。
成血管细胞细胞可以按大小和/或形态分离，过程如下。生长6到7天后，细胞混合物包含EB (圆形且呈多细胞团)盒成血管细胞(葡萄状，小于EB，且是单细胞)。因此，成血管细胞可根据它们的形态和大小进行分离。成血管细胞可以人工挑选，例如当在显微镜下观察细胞混合物的时候。所述细胞接着可以生长成集落，每个集落具有100-150个细胞。可挑选如上所述衍生的人成血管细胞集落，并重平板接种于甲基纤维素CFU培养基上，以形成造血CFU。在某些实施方案中，CFU培养基包括StemCell Technologies H4436。再一个实施方案中，将成血管细胞平板接种于补充有细胞因子及其他因子的Stemline II培养基上。例如可以人工挑选单个BL-CFC集落，并将其转移到平板接种有纤维连接蛋白的含 Stemline II 和重组人 SCF(例如 20ng/ml)、TP0(例如 20ng/ml)、FL(例如 20ng/ml)、IL-3(例如 20ng/ml)、VEGF (例如 20ng/ml)、G_CSF (例如 20ng/ml)、BMP_4(例如 15ng/ml)、IL-6(例如10ng/ml)、IGF-1 (例如lOng/ml)、内皮细胞生长补充因子(ECGS，例如100 u g/ml)、Epo (例如3U/ml)的培养皿上。体外生长一周后,可通过温和移液移走非粘连的造血细胞，并直接用于造血CFU试验。移去非粘附细胞后，可使粘附的细胞群在EGM-2内皮细胞培养基(Cambrex )中再生长一周,然后检验vWF的表达。成血管细胞的体外扩增本发明的某些方面涉及成血管细胞的体外扩增。在某些实施方案中，如上所述，通过本发明方法扩增的成血管细胞获自源于人胚胎干细胞的早期胚状体。除了来自人胚胎干细胞(hES细胞)的衍生成血管细胞以外，待扩增的成血管细胞液可以分离自其他哺乳动物来源，例如哺乳动物胚胎(Ogawa等，2001 Int RevImmunol (20) :21_44，美国专利
发明者R·兰扎, 卢世江 申请人:先进细胞技术公司