专利名称：多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒。
背景技术：
ABCC2基因局部存在于肝细胞的胆管，对将谷胱甘肽、葡萄糖醛酸、硫酸结合体从胆管输送到胆管的转运体进行编码，并与各种药剂的代谢有关。另外，近年，在分析日本人的ABCC2基因的单核苷酸多态性(SNPs)之后，发现了各 种各样的基因多态性。另外，已给出了通过对ABCC2基因的与5’末端相距24个碱基的胞嘧啶(C)突变成胸腺嘧啶(T)的C-24T进行测定有可能能够预测药物耐受性的启示(参见Drug Metabolism and Disposition, 2002 年，Vol. 30, No. 4, p. 363-364)。因此，人们期待正确且短时间、低成本并且简便地测定ABCC2基因的多态性的方法。另外，作为与药剂的敏感性相关的突变，例如，除了 C-24T突变之外，还已知有MDRl基因的外显子26中的第3435位的胞嘧啶(C)突变成胸腺嘧啶(T)的C3435T突变等多种突变(参见日本专利特许第4454366号公报)。因此，不单单检测ABCC2基因的多态性，而是通过与C-24T突变一起检测其他的与药剂敏感性相关的突变体，有可能能够更高灵敏度地预测药剂耐受性。目前，作为测定基因的多态性的方法，已知有下述的方法使用被设计为扩增含有想要测定的碱基的部分的引物进行PCR，用可以该特定碱基中有无突变来区分是否切断的限制性内切酶进行切断，之后通过电泳检测有没有被切断(PCR-RFLP法)(参见Genet.Mol. Res. ,2010 年，第 9 卷，第 I 号，ρ· 34-40)。另外，还已知有下述的方法在用PCR法扩增含有突变的区域之后，使用用荧光染料标记了的核酸探针进行熔解曲线分析，并基于熔解曲线分析的结果来分析碱基序列的突变(参见特开2002-119291号公报)。
发明内容
发明要解決的问题但是，ABCC2基因的突变中如上述那样存在各种突变。因此，在PCR-RFLP法中，需要在PCR反应之后提取扩增产物来进行限制性内切酶处理。因此，扩增产物有可能混入下一反应体系中，由此有时会获得假阳性、假阴性的结果。另外，由于在PCR结束之后用限制性内切酶进行处理，之后进行电泳，因此有时到检测为止所需的时间非常长。而且，由于操作复杂，因此难以自动化。根据这些现状，期待进一步开发用于检测ABCC2基因多态性的技术。本发明要解决的问题在于提供一种能够高灵敏度、简便地检测ABCC2基因多态性的多态性检测用探针、使用该探针的多态性检测方法。另外，本发明要解决的问题在于提供使用了该多态性检测方法的药效判定方法。而且本发明要解决的问题在于提供使用了该多态性检测用探针的多态性检测用试剂盒。用于解决课题的手段本发明如下所述。<1> 一种多态性检测用探针，其为从包括下述Pl和ΡΓ的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸，用于检测ABCC2基因的多态性，(Pl)荧光标记寡核苷酸，其为含有序列编号I所示的序列中的第207位 第217位的碱基的碱基长为11 60的序列，该序列除了与序列编号I中的第217位的碱基对应的喊基为胞喃唳之外相对于具有与序列编号I相同的喊基的喊基序列具有至少80%以上的同一性，并且与序列编号I所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记； 以及(Pr)荧光标记寡核苷酸，其为含有序列编号I所示的序列中的第207位 第217位的碱基的碱基长为11 60的序列，该序列除了与序列编号I中的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外与具有和序列编号I相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且与序列编号I所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。〈2>根据〈1>所述的多态性检测用探针，其中，所述多态性检测用探针是下述Pl或下述ΡΓ的所述荧光标记核苷酸，(Pl-I)荧光标记寡核苷酸，其为含有序列编号I所示的序列中的第207位 第217位的碱基的碱基长为11 60的序列，该序列除了与序列编号I的第217位的碱基对应的喊基为胞B密卩定之外相对于具有与序列编号I相同的喊基的喊基序列具有至少80%以上的同一性，并且与序列编号I所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记，并且该荧光标记寡核苷酸识别序列编号I的第207位的碱基的多态性；或者(Pr -I)荧光标记寡核苷酸，其为含有序列编号I所示的序列中的第207位 第217位的碱基的碱基长为11 60的序列，该序列除了与序列编号I中的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外与具有和序列编号I相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且与序列编号I所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记，并且该荧光标记寡核苷酸识别序列编号I的第207位的碱基的多态性。<3>根据〈1>或〈2>所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第I位 第3位具有用荧光染料标记的第217位的碱基。<4>根据〈1> 〈3>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的第217位的碱基。<5>根据〈1> 〈4>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸在未与IE标序列杂交时发出突光，并且在与该IE标序列杂交时突光强度减少或增加。<6>根据〈1> 〈5>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与该靶标序列杂交时荧光强度减少。<7>根据〈1> 〈6>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸的碱基长为12 55。<8>根据〈1> 〈7>任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸的碱基长为15 45。
<9>根据<1> 〈8>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸的碱基长为18 35。<10>根据〈1> 〈9>中任一项所述的多态性检测用探针，其中所述多态性检测用探针为用于分析熔解曲线的探针。<11>根据〈1> 〈10>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述多态性检测用探针具有序列编号4、序列编号5、序列编号6、序列编号7、序列编号8、序列编号9、序列编号10、序列编号11、序列编号12、序列编号13、序列编号14、序列编号15或序列编号16所不的喊基序列。〈12>—种多态性检测方法，其通过使用〈1> 〈I 1>中任一项所述的多态性检测用探针来检测ABCC2基因的多态性。<13>根据〈12>所述的多态性检测方法，包括 (I)使〈1> 〈11>中任一项所述的多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸杂交来获得杂交体；(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离，并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动；(III)基于所述荧光信号的变动来测定杂交体的解离温度、即Tm值；以及(IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的ABCC2基因的多态性的存在。<14>根据〈13>所述的多态性检测方法，还包括在所述⑴之前或者与⑴同时扩增核酸。<15>根据〈12> 〈14>中任一项所述的多态性检测方法，还包括通过使用从包括MDRl基因的多态性检测用探针和CYP3A5基因的多态性检测用探针的组中选择的至少一种探针，来检测从包括MDRl基因和CYP3A5基因的组中选择的至少一种基因的多态性。<16> 一种药效评价方法，包括通过〈12> 〈15>中任一项所述的多态性检测方法来检测ABCC2基因的多态性；以及基于检测到的多态性的有无来判定对药剂的耐受性或者药剂的药效。<17> 一种多态性检测用试剂盒，用于检测ABCC2基因的多态性，所述多态性检测用试剂盒包含〈1> 〈11>中任一项所述的多态性检测用探针。<18>根据<17〉所述的多态性检测用试剂盒，还包含能够扩增含有与所述Pl荧光标记寡核苷酸杂交的序列的区域的引物。<19>根据<17〉或〈18>所述的多态性检测用试剂盒，还包含从包括用于检测MDRl基因的多态性的探针以及用于检测CYP3A5基因的多态性的探针的组中选择的至少一种以上的多态性检测用探针。发明效果通过本发明，能够提供可以高灵敏度、简便地检测ABCC2基因多态性的多态性检测用探针、使用该探针的多态性检测方法。另外，本发明能够提供使用了该多态性检测方法的药效判定方法。而且，本发明能够提供使用了该多态性检测用探针的多态性检测用试剂盒。
图I的(A)是核酸混合物的熔解曲线的示例，图I的(B)是微分熔解曲线的示例。图2的㈧ (F)是本发明的实施例I涉及的试样的微分熔解曲线。图3的㈧ (C)是本发明的实施例2涉及的试样的微分熔解曲线。图4的㈧ (C)是本发明的比较例I涉及的试样的微分熔解曲线。
具体实施例方式本发明涉及的ABCC2基因的多态性检测用探针(以下，有时仅称“多态性检测用探 针”)为如下的多态性检测用探针，其为从包括下述Pi和ΡΓ的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸，用于检测ABCC2基因的多态性(Pl)荧光标记寡核苷酸，其为含有序列编号I所示的序列中的第207位 第217位的碱基的碱基长为11 60的序列，该序列除了与序列编号I中的第217位的碱基对应的喊基为胞B密卩定之外相对于具有与序列编号I相同的喊基的喊基序列具有至少80 %以上的同一性，并且与序列编号I所示的序列的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记；以及(Pr)荧光标记寡核苷酸，其为含有序列编号I所示的序列中的第207位 第217位的碱基的碱基长为11 60的序列，该序列除了与序列编号I中的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外与具有和序列编号I相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且与序列编号I所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。本发明涉及的ABCC2基因多态性检测方法包括使用至少一种用于检测所述ABCC2基因的多态性的多态性检测用探针来检测ABCC2基因的多态性。本发明涉及的药剂的药效判定方法包括通过所述ABCC2基因多态性检测方法检测ABCC2基因的多态性；以及基于检测到的多态性的有无来判定针对药剂的耐受性或药剂的药效。本发明涉及的多态性检测用试剂盒包含用于检测ABCC2基因的多态性的多态性检测用探针。本发明中的“ABCC2基因”已经是公知的，其碱基序列表示NCBI的登录号No. NC_000010. 10的101542463 101611662的序列。序列编号I的碱基序列为NCBI的dbSNP的登录号No. rs717620的I 611的序列，相应于ABCC2基因的启动子区域中的核酸的碱基序列的一部分。在本发明中，关于作为检测对象的试样中的试样核酸、多态性检测用探针或者引物的每个的序列，基于它们的相互互补的关系所记述的事项，只要不特别指出，也适用于各个序列和相对于各序列互补的序列。在将本发明的事项适用于相对于各序列互补的该序列时，由该互补的序列识别的序列，在本领域技术人员的技术常识的范围内，视为将说明书全体替换为与对应的本说明书中记载的序列互补的序列。在本发明中，“Tm值”是指双链核酸解离的温度(解离温度Tm)，一般定义为260nm处的吸光度达到吸光度总上升量的50%时的温度。即，当加热含有双链核酸、例如双链核酸DNA的溶液时，260nm处的吸光度上升。这是因为双链核酸DNA中的两条双链之间的氢键由于加热而断裂，解离成单链DNA (DNA的熔解)。并且，当双链核酸DNA解离成单链DNA时，其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链核酸DNA的吸光度)的约I. 5倍左右，由此可以判断熔解完成。Tm值基于该现象而设定。本发明中的Tm值只要不特别指出，均是指吸光度达到吸光度总上升量的50%时的温度。在本发明中，关于寡核苷酸的序列，当称为“从3’末端起数的第I 3位”时是以寡核苷酸链的3’末端为第I位起数的。在本说明书中，“步骤” 一词不仅包含独立的步骤，即使在不能与其他的步骤明确区别的情况下只要达到了本步骤预期的效果，则也包含在本术语之内。另外，在本说明书中，使用“ ”表示的数值范围为将“ ”的前后记载的数值分别 作为最小值和最大值包含的范围。另外，在本发明中，组成物中的各成分的量在组成物中存在多种相当于各成分的物质的情况下只要不特别指出就是指所述组成物中存在的该多种物质的合计量。下面说明本发明。〈ABCC2基因多态性检测用探针>本发明涉及的ABCC2基因的多态性检测用探针(以下，有时仅称为“多态性检测用探针”)为如下的多态性检测用探针，其为从包括下述Pi和ΡΓ的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸，用于检测ABCC2基因的多态性(Pl)荧光标记寡核苷酸，其为含有序列编号I所示的序列中的第207位 第217位的碱基的碱基长为11 60的序列，该序列除了与序列编号I中的第217位的碱基对应的喊基为胞B密卩定之外相对于具有与序列编号I相同的喊基的喊基序列具有至少80 %以上的同一性，并且与序列编号I所示的序列的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记；以及(Pr)荧光标记寡核苷酸，其为含有序列编号I所示的序列中的第207位 第217位的碱基的碱基长为11 60的序列，该序列除了与序列编号I中的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外与具有与序列编号I相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且与序列编号I所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。本发明的从包括所述Pl和所述ΡΓ的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸(以下也称为“所述Pi或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸”。)是能够检测序列编号I所示的碱基序列的第207位的碱基的多态性的探针。另外，本发明的所述Pl和ΡΓ荧光标记寡核苷酸具体为含有序列编号I所示的序列中的第207位 第217位的碱基的序列。在ABCC2基因的野生型中，与序列编号I所示的序列的第207位对应的碱基为C (胞嘧啶)，但在突变型中突变成T (胸腺嘧啶)(以下，称为“C-24T突变”)，该碱基相当于ABCC2基因的第-428位 第183位的碱基中的第207位的碱基。本发明的所述Pl荧光标记寡核苷酸需要除了与序列编号I中的第217位的碱基对应的碱基为c(胞嘧啶)之外相对于具有与序列编号I相同的碱基的碱基序列具有同源性。具体地，本发明的所述Pl荧光标记寡核苷酸除了与序列编号I中的第217位的喊基对应的喊基为c(胞喃唳)之外相对于具有与序列编号I相同的喊基的喊基序列显不80%以上的同一性。另外，从检测灵敏度的观点来说，可以显示85%以上的同一性、90%以上的同一性、95%以上的同一性、96%以上的同一性、97%以上的同一性、98%以上的同一性或99%以上的同一'I"生。在对本发明的所述Pl荧光标记寡核苷酸和除了与序列编号I中的第 217位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之外具有与序列编号I相同的碱基的碱基序列进行比较时的同一性低于80%的情况下，针对含有突变型的ABCC2基因的试样核酸的检测灵敏度变低。另外，作为本发明涉及的所述Pl荧光标记寡核苷酸，也可以是荧光标记寡核苷酸(Pl-I)，其为含有序列编号I所示的序列中的第207位 第217位的碱基的碱基长为11 60的序列，该序列除了与序列编号I的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外相对于具有与序列编号I相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且与序列编号I所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记，并且该荧光标记寡核苷酸识别序列编号I的第207位的碱基的多态性。该荧光标记寡核苷酸具有对含有突变型的ABCC2基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。本发明中的所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸需要除了与序列编号I中的第217位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之外具有与序列编号I相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法，例如Molecular Cloning3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中记载的方法等来进行。该文献通过参考被并入本说明书中。严谨条件是指形成特异性杂交体但不形成非特异性杂交体的条件。典型的严谨条件例如可以举出在钾浓度约25mM 约50mM以及镁浓度约I. OmM 约5. OmM中进行杂交的条件。作为本发明的条件的示例，可以举出在Tris-HCl (pH8. 6)、25mM的KCl以及I. 5mM的MgCl2下进行杂交的条件,但是不限于此。此外,严谨条件被记载在Molecular Cloning3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中。该文献通过参考被并入本说明书中。本领域技术人员能够通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等来容易地选择这样的条件。另外，作为本发明涉及的所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸，也可以是荧光标记寡核苷酸(Pr -I)，其为含有序列编号I所示的序列中的第207位 第217位的碱基的碱基长为11 60的序列，该序列除了与序列编号I中的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外和具有与序列编号I相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且与序列编号I所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记，并且该荧光标记寡核苷酸(ΡΓ -I)识别序列编号I的第207位的碱基的多态性。该荧光标记寡核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列编号I的第207位的碱基的多态性的功能，因此具有对含有突变型的ABCC2基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。另外，本发明的所述Pl或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸还包括在所述Pi或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸中插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸。
该插入、缺失或取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示与所述Pl或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失或取代了碱基的情况下，其插入、缺失或取代的位置无特别限定。插入、缺失或取代的碱基的数量可以举出I个碱基或2个碱基以上，该数量根据荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以举出I个碱基 10个碱基或I个碱基 5个碱基。在插入、缺失或取代中，作为本发明的所述Pl或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸，也可以举出取代了所述Pl或所述Pr荧光标记寡核苷酸的碱基的荧光标记寡核苷酸。取代的位置无特别限定。例如，从检测灵敏度的观点来说，可以举出位于序列编号I所示的序列中的第207位 第217位的碱基之外的碱基被取代。作为被取代的碱基的数量，可以举出I个碱基或2个碱基以上。被取代的碱基的数量根据荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以举出I个碱基 5个碱基、或I个碱基 3个碱基。
本发明的所述Pl或所述ΡΓ的荧光标记寡核苷酸的长度需要是Ilmer 60mer。在所述Pl或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸的长度为IOmer以下或者61mer以上的情况下，ABCC2基因多态性的检测灵敏度变低。另外，本发明的所述Pl或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸的长度可以为12mer 55mer、15mer 45mer或18mer 35mer。通过设成12mer 55mer的范围，例如具有检测灵敏度变高等的倾向。另外，通过改变所述Pl或所述P I’荧光标记寡核苷酸的碱基长，例如能够将由Pl或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸与其互补链(靶标序列)形成的杂交体的解离温度、即Tm值调整至期望的值。以下将本发明的所述Pl或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸中的碱基序列的示例示于表1，但是本发明不限于此。此外，在表I中，将与序列编号I的第207位的碱基对应的碱基用小写字母表示，并且一并不出了与该序列编号I的第207位对应的碱基为A、G、T和C时的寡核苷酸与各个荧光标记寡核苷酸的杂交体的Tm值。另外，相对于序列编号I所示的序列增加了突变的碱基带有下划线。这里Tm 值是使用 Meltcalc 99 free (http://www. meltcalc. com/)在设定条件Oligoconc [ μ Μ] O. 2、Na eq. [mM] 50 的条件下计算的。
序列(5’一3')mer ~mt T「^~一 ^]※字列编号
TCTGGAACgAAGACTCTTC — 1950.2" 43.27.0 4
CATGATTCCTGGACTGCGTCTGGAACaAAGACTCTTC~ 3765.6 62.3__3,3__5
CATGATTCCTGGACTGCGTCTGGAACaAAGACTCTTCTATTAATATGATTGTGTTQT57一 67.4 ■ 65.42.0__6
TCTGgAACgAAGACTCTTC19— 30.139.4— 9.3 7
AATGATACCTGGACTGCGTCTGGAACaAAGACTCTTC37— 61.7 51.8__9,9__8
CATGATTCCTGGACTGCGTCTGGAACaAAGACTCTTCTAGGAATATGATTGTGTTGT5766.7~ 64.6— 2.19
CtAAGACTCTTC12—16.8 12.7__41__10
C^AAGACTCTTCI 12I 12.5I 9.7 I 2.8 I ” ■X Λ为mt (突变型)和WT (野生型)的Tm值之差在本发明中，所述Pl或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸与具有互补的碱基序列的DNA杂交时的Tm值(表I中的Tm(mt))、和与仅序列编号I的第207位的碱基对应的碱基为非互补的寡核苷酸杂交时的Tm值(表I中的Tm(WT))之差，例如可以举出2. 0°C以上、3. 0°C以上、5. O0C以上、或7. O0C以上等。通过所述Tm值之差为2. 0°C以上，例如能够更高灵敏度地检测序列编号I中的第207位的碱基的突变。另外，本发明的所述Pl或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸的第217位的碱基需要用荧光染料标记。在所述Pl或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸中，该荧光标记了的第217位的碱基能够存在于从3’末端起数第I位 第3位的任何位置。另外，能够存在于3’末端。由此，多态性检测灵敏度进一步提高。另外，能够生产性良好地获得Pl或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸。本发明的所述荧光标记寡核苷酸可以是其与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)或增加的荧光标记寡核苷酸。其中，可以是与靶 标序列杂交时的突光强度比未与祀标序列杂交时的突光强度减少的突光标记寡核苷酸。利用了这种突光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针一般称为鸟嘌呤淬灭探针，已知为所谓Q Probe (注册商标)。其中可以举出如下的寡核苷酸其被设计为3’末端或5’末端为胞嘧啶(C)，并用荧光染料标记该末端的C使其靠近鸟嘌呤(G)时发光变弱。若使用这样的探针，则能够根据信号的变动来容易地确认杂交和解离。此外，除了使用Q Probe的检测方法之外，也可以应用公知的检测方式。作为这种检测方式，可举出Taq-man探针法、杂交探针(Hybridization Probe)法、分子信标(Molecular Beacon)法或 MGB 探针法等。作为所述荧光染料无特别限制，例如可以为荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等。所述荧光染料的市售产品例如有Pacific Blue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM> Cy3 和 Cy5、TAMRA 等。所述荧光标记寡核苷酸的检测条件无特别限制，可以根据使用的所述荧光染料适当确定。例如Pacific Blue能够在波长445 480nm下检测，TAMRA能够在波长585 700nm下检测，BODIPY FL能够在波长520 555nm下检测。如果使用具有这种荧光染料的探针，则能够根据各个荧光信号的变动来容易地确认杂交和解离。可以按照通常的方法、例如日本专利文献特开2002-119291号公报等中记载的方法，来将所述荧光染料结合至寡核苷酸。另外，所述荧光标记寡核苷酸例如也可以在3’末端添加有磷酸基。因为通过在所述荧光标记寡核苷酸的3’末端添加磷酸基，能够充分抑制探针自身由于基因扩增反应而延长。如后面所述，检测有无突变的DNA(靶标DNA)可以通过PCR等基因扩增法来制备。此时，通过使用在3’末端添加有磷酸基的荧光标记寡核苷酸，能够使其共存于扩增反应的反应液中。另外，通过在3’末端例如添加前述那样的标记物质(荧光染料)，也能够得到同样的效果。下面示出具有上述碱基序列并且3’末端的C用荧光染料被标记的寡核苷酸的具体例(大写字母的碱基表示突变点，(TAMRA)相当于所述荧光染料)。但是，本发明中的荧光标记寡核苷酸不限于以下的寡核苷酸。表权利要求
1.一种多态性检测用探针，其为从包括下述pi和Pr的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸，用于检测ABCC2基因的多态性 (PD荧光标记寡核苷酸，其为含有序列编号I所示的序列中的第207位 第217位的碱基的碱基长为11 60的序列，该序列除了与序列编号I中的第217位的碱基对应的碱基为胞喃唳之外相对于具有与序列编号I相同的喊基的喊基序列具有至少80以上的同一性，并且与序列编号I所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记；以及 (Pr )荧光标记寡核苷酸，其为含有序列编号I所示的序列中的第207位 第217位的碱基的碱基长为11 60的序列，该序列除了与序列编号I中的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外与具有和序列编号I相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且与序列编号I所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。
2.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其中，所述多态性检测用探针是下述Pl或下述P1’的所述荧光标记核苷酸， (Pl-I)荧光标记寡核苷酸，其为含有序列编号I所示的序列中的第207位 第217位的碱基的碱基长为11 60的序列，该序列除了与序列编号I的第217位的碱基对应的碱基为胞喃唳之外相对于具有与序列编号I相同的喊基的喊基序列具有至少80%以上的同一性，并且与序列编号I所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记，并且该荧光标记寡核苷酸识别序列编号I的第207位的碱基的多态性；或者 (PI’ -D荧光标记寡核苷酸，其为含有序列编号I所示的序列中的第207位 第217位的碱基的碱基长为11 60的序列，该序列除了与序列编号I中的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外与具有和序列编号I相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且与序列编号I所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记，并且该荧光标记寡核苷酸识别序列编号I的第207位的碱基的多态性。
3.根据权利要求I或2所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第I位 第3位具有用荧光染料标记的第217位的碱基。
4.根据权利要求I至3中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的第217位的碱基。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与该靶标序列杂交时荧光强度减少或增加。
6.根据权利要求I至5中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与该靶标序列杂交时荧光强度减少。
7.根据权利要求I至6中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸的碱基长为12 55。
8.根据权利要求I至7中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸的碱基长为15 45。
9.根据权利要求I至8中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸的碱基长为18 35。
10.根据权利要求I至9中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述多态性检测用探针为用于分析熔解曲线的探针。
11.根据权利要求I至10中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述多态性检测用探针具有序列编号4、序列编号5、序列编号6、序列编号7、序列编号8、序列编号9、序列编号10、序列编号11、序列编号12、序列编号13、序列编号14、序列编号15或序列编号16所不的喊基序列。
12.一种多态性检测方法，其通过使用权利要求I至11中任一项所述的多态性检测用探针来检测ABCC2基因的多态性。
13.根据权利要求12所述的多态性检测方法，包括 (I)使权利要求I至11中任一项所述的多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸杂交来获得杂交体； (II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离，并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动； (III)基于所述荧光信号的变动来测定杂交体的解离温度、即Tm值；以及 (IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的ABCC2基因的多态性的存在。
14.根据权利要求13所述的多态性检测方法，还包括在所述(I)之前或者与(I)同时扩增核酸。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的多态性检测方法，还包括通过使用从包括MDRl基因的多态性检测用探针和CYP3A5基因的多态性检测用探针的组中选择的至少一种探针，来检测从包括MDRl基因和CYP3A5基因的组中选择的至少一种基因的多态性。
16.—种药效评价方法，包括 通过权利要求12至15中任一项所述的多态性检测方法来检测ABCC2基因的多态性；以及 基于检测到的多态性的有无来判定对药剂的耐受性或者药剂的药效。
17.一种多态性检测用试剂盒，用于检测ABCC2基因的多态性，所述多态性检测用试剂盒包含权利要求I至11中任一项所述的多态性检测用探针。
18.根据权利要求17所述的多态性检测用试剂盒，还包含能够扩增含有与所述Pl荧光标记寡核苷酸杂交的序列的区域的引物。
19.根据权利要求17或18所述的多态性检测用试剂盒，还包含从包括用于检测MDRl基因的多态性的探针以及用于检测CYP3A5基因的多态性的探针的组中选择的至少一种以上的多态性检测用探针。
全文摘要
本发明提供能够高灵敏度且简便地检测ABCC2基因的多态性的多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒。用于检测ABCC2基因的多态性的多态性检测用探针是(P1)荧光标记寡核苷酸，其为含有序列编号1所示的序列中第207位～第217位的碱基的碱基长11～60的序列，除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的碱基为C之外相对于具有与序列编号1相同碱基的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且与序列编号1所示的序列的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记；或者(P1’)荧光标记寡核苷酸，其与具有与序列编号1相同碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且与序列编号1所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。
文档编号C12N15/11GK102766682SQ20121013213
公开日2012年11月7日 申请日期2012年4月27日 优先权日2011年5月2日
发明者井口亚希 申请人:爱科来株式会社