专利名称：基因突变检测用探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因突变检测用探针。
背景技术：
“基因多态性”是指编码基因的碱基序列中的碱基变为与某个群体的大多数的性状不同的喊基，例如广生了单喊基取代、缺失、插入、基因融合等基因结构(喊基序列)的差
巳另一方面，“基因多态性”是指作为“基因突变”的一部分的、某个群体中频率最高的突变或者等位基因(allele)为99%以下的状态，换言之，是指频率低的突变和/或等位基因的合计频率为1%以上的状态。该1%—值虽简单，但仍具意义。每代产生的大多数新的突变通过自然选择而从群体中被去除，因此可在逻辑上计算其平衡频率。将比该平衡频率高的值、1%作为“多态性”的基准。即，被视为多态性现象是指由于某种机理而导致群体中这些突变的频率变高并世代被维持的意思。已被指出基因突变与各种疾病的罹患率和/或由于施药而产生副作用的频率相关联，从而认为通过检测基因多态性，能够预测各种疾病发生频率和/或耐药性等。因此，人们期待正确且短时间、低成本地测定基因突变的方法。基因多态性和基因突变的种类中有由于碱基序列中的一个碱基被取代而产生的单碱基取代、缺失一个以上的碱基的缺失型突变、插入一个以上的碱基的插入型突变、或者基因融合等。以下，将基因多态性和基因突变统称为基因突变。目前，已知有下述测定基因突变的方法将含有突变的区域用PCR法扩增之后，使用荧光染料标记的核酸探针与靶标核酸杂交，测定荧光染料的发光的减少量，并基于熔解曲线分析的结果来分析碱基序列的突变(参见特开2002-119291号公报)。
发明内容
发明要解决的问题然而，为了通过上述使用核酸探针的方法来检测基因突变，需要使用具有适合于每个突变的序列的核酸探针。另外，在使用核酸探针进行熔解曲线分析时，如果核酸探针内 存在作为检测对象的基因突变之外的突变，则由于受到基因突变检测对象之外的基因突变的影响，熔解温度(Tm值)产生偏差，因此难以特异性检测作为检测对象的基因突变。根据这些现状，人们期待进一步开发用于即使编码基因的碱基序列含有多个基因突变也不受基因突变检测对象之外的基因突变的影响而精度良好地检测作为检测对象的特定基因突变的技术。本发明要解决的问题在于，提供一种能够从编码基因的碱基序列中包含的多个基因突变中不受非目标基因突变的碱基型的影响地仅特异性地检测出作为检测对象的特定的基因突变的基因突变检测用探针，以及使用该基因突变检测用探针的基因突变检测方法。另外，本发明要解决的问题在于，提供一种使用了该基因突变检测用探针的基因突变检测用试剂盒。用于解决问题的手段本发明如下所述。〈1> 一种基因突变检测用探针，所述探针包括从包括下述PU Pl-U ΡΓ及ΡΓ -I的组中选择的至少一种寡核苷酸，用于检测对含有目标基因突变和非目标基因突变的对象基因进行编码的碱基序列中的所述目标基因突变(PD寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置处具有与所述目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者互补的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置处具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非 互补的碱基，而且其相对于与编码所述对象基因的碱基序列的全部或部分互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性；(Pl-I)寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置处具有与所述目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者互补的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置处具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基，而且其与和编码所述对象基因的碱基序列具有相同碱基序列的寡核苷酸在严谨条件下杂交；(ΡΓ )寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置处具有与所述目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置处具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基，而且其相对于与编码所述对象基因的碱基序列的全部或部分具有至少80 %以上的同一性；以及(ΡΓ -I)寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置处具有与所述目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置处具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基，而且其与具有和编码所述对象基因的碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸在严谨条件下杂交。<2>根据〈1>所述的基因突变检测用探针，其中，所述基因突变检测用探针满足下述(a)至(f)中的任一条件(a)在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为A和T中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为A和T中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基或者与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为C或G ;(b)在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为C和G中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为C和G中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基或者与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为A或T ;(C)在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为A和C中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为A和C中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基或者与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为T或G ;(d)在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为从A和G中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为A和G中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基或者与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为T或C ;(e)在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为T和C中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为T和C中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基所述非互补的碱基为T或C，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为A或G ;(f)在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为T和G中的一者，并且所述 非目标基因突变的突变型碱基为T和G中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基为T或G，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为A或C。<3>根据〈1>或〈2>所述的基因突变检测用探针，其中，所述寡核苷酸为荧光标记寡核苷酸。〈4>根据〈3>所述的基因突变检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸的3’末端或5’末端的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记。<5>根据〈3>或〈4>所述的基因突变检测用探针，其中所述荧光标记寡核苷酸位于从3’末端或者5’末端起数第I 3位的任意位置。<6>根据〈1> 〈5>中任一项所述的基因突变检测用探针，其中，所述基因突变检测用探针为用于分析熔解曲线的探针。<7>根据〈3> 〈6>中任一项所述的基因突变检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少或增加。<8>根据〈3> 〈7>中任一项所述的基因突变检测用探针，所述荧光标记寡核苷酸与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少。〈9> 一种基因突变检测方法，其使用〈1> 〈8>中任一项所述的基因突变检测用探针来检测作为检测对象的突变目标基因突变。<10> 一种目标基因突变检测方法，包括(I)使〈3> 〈8>中任一项所述的基因突变检测用探针和试样中的单链核酸接触来获得杂交体；(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离，并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动；(III)基于所述荧光信号的变动来获得杂交体的解离温度，即Tm值；(IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中目标基因突变的存在。<11>根据〈10>所述的目标基因突变检测方法，还包括在获得所述(I)的杂交体之前或者与获得所述(I)的杂交体的同时扩增核酸。<12> 一种基因突变检测用试剂盒，包含〈1> 〈8>中任一项所述的基因突变检测用探针。<13>根据〈12>所述的基因突变检测用试剂盒，还包含引物，所述引物能够扩增具有与<1> 〈8>中任一项所述的基因突变检测用探针杂交的区域的碱基序列。发明效果通过本发明，能够提供即使编码基因的碱基序列含有多个基因突变也不受基因突变检测对象之外的基因突变的影响而特异性地检测作为检测对象的特定的基因突变的基因突变检测用探针、以及使用该探针的基因突变检测方法。另外，通过本发明，能够提供使用了该基因突变检测用探针的基因突变检测用试剂盒。
图I的(A)为核酸混合物的熔解曲线的示例，图I的(B)为微分熔解曲线的示例； 图2的㈧ ⑵为本发明的实施例I涉及的试样的微分熔解曲线；图3的㈧ ⑶为本发明的实施例2涉及的试样的微分熔解曲线；图4的㈧ ⑵为本发明的比较例I涉及的试样的微分熔解曲线。
具体实施例方式本发明涉及的基因突变检测用探针包括从包括PU Pl-U ΡΓ及ΡΓ -I的组中选择的至少一种寡核苷酸，用于检测对含有目标基因突变和非目标基因突变的对象基因进行编码的喊基序列中的该目标基因突变。由此，即使对基因进行编码的碱基序列含有多个基因突变，本发明涉及的基因突变检测用探针也不受检测对象之外的基因突变的影响而特异性地检测作为检测对象的特定的基因突变。本发明涉及的基因突变检测方法包括使用至少一种用于检测所述基因突变的基因突变检测用探针，即使编码基因的碱基序列含有多个基因突变，也不受基因突变检测对象之外的基因突变的影响地进行检测。本发明涉及的基因突变检测用试剂盒含有用于检测目标基因突变的所述基因突变检测用探针。在本发明中，关于作为检测对象的试样中的试样核酸、基因突变检测用探针或者引物的每个的碱基序列，基于它们的相互互补的关系所记述的事项，只要不特别指出，也分别适用于其互补碱基序列。在将特定碱基序列的说明适用于其互补碱基序列时，对由该特定的碱基序列识别的碱基序列的说明在本领域技术人员的技术常识的范围内应当如下地应用视为由该特定碱基序列进行的识别被替换成该特定碱基序列的互补碱基序列进行的识别。在本发明中，“Tm值”是双链核酸解离的温度(解离温度Tm)，一般定义为260nm处的吸光度由于双链核苷酸的完全解离而导致总吸光度增加50%时的温度。S卩，当加热含有双链核酸、例如双链DNA的溶液时，260nm处的吸光度逐渐上升。这是因为双链DNA中的双链间的氢键通过加热而断裂，解离(DNA的熔解)成单链DNA。并且，当双链DNA全部解离形成单链DNA时，其吸光度显示加热开始时的吸光度(当全部DNA为双链DNA的形式时的吸光度)的约I. 5倍左右，由此能够判断熔解完成。Tm值基于该现象来设定。在本发明中，关于寡核苷酸的序列，当称为“从3’末端起数的第I 3位”时，假定寡核苷酸链的3’末端的碱基为从3’末端起第I位碱基。同样地，当称为“从5’末端起数第I 3位”时，假定寡核苷酸链的5’末端的碱基为从5’末端起第I位碱基。在本说明书中，“步骤” 一词不仅包含独立的步骤，也包含哪些不能与其他的步骤明确区别但达到了本步骤预期的效果的过程。在本说明书中，使用“ ”表示的数值范围表示将“ ”前后记载的数值分别作为最小值和最大值包含的范围。另外，在本发明中，组成物中的各成分的量在组成物中存在多种相当于各成分的物质的情况下只要不特别指出就是指组成物中存在的该多种物质的合计量。下面说明本发明。 <基因突变检测用探针>本发明涉及的基因突变检测用探针包括从包括下述PU Pl-U ΡΓ和ΡΓ -I的组中选择的至少一种寡核苷酸，并用于检测对含有目标基因突变和非目标基因突变的对象基因进行编码的碱基序列中的该目标基因突变。由此，即使编码基因的碱基序列含有多个基因突变，本发明涉及的基因突变检测用探针也不受检测对象之外的基因突变的影响地特异性地检测作为检测对象的特定的基因突变。(PD寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置处具有与所述目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者互补的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置处具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基，而且其相对于与编码所述对象基因的碱基序列的全部或部分互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性；(Pl-I)寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置处具有与所述目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者互补的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置处具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基，而且其与和编码所述对象基因的碱基序列具有相同碱基序列的寡核苷酸在严谨条件下杂交；(ΡΓ )寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置处具有与所述目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置处具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基，而且其相对于与编码所述对象基因的碱基序列的全部或部分具有至少80 %以上的同一性；以及(ΡΓ -I)寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置处具有与所述目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置处具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基，而且其与具有和编码所述对象基因的碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸在严谨条件下杂交。本发明中“对应于目标基因突变的碱基位置”是指与当寡核苷酸的碱基序列与含有目标基因突变和非目标基因突变的试样碱基序列以使它们之间最匹配的方式进行比对时，寡核苷酸中与试样碱基序列中的目标基因突变的碱基位置相对应的碱基位置。腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)分别形成氢键。AT对形成两个氢键，而GC对形成三个氢键。也就是说在“A-T之间”、“G-C之间”形成氢键，并维持双螺旋结构。在这些碱基之外的碱基的组合中不能形成足以维持双螺旋结构的氢键。例如，在试样核酸中所含的非目标基因突变的碱基位置处的野生型和突变型的碱基的组合为A和T的组合、并且基因突变检测探针中与非目标基因突变的野生型和突变型均不互补的碱基为C或G的情况下，则非目标基因突变的突变型碱基和非目标基因突变中的野生型碱基(从A和T中选择的碱基)与跟非目标基因突变中的突变型碱基和非目标基因突变中的野生型碱基均非互补的碱基(C或G)不形成氢键，因此，该基因突变检测用探针的Tm值不受非目标基因突变的影响。另一方面，若将基因突变检测用探针中与非目标基因突变的野生型和突变型均不互补碱基替换成A，则该碱基在非目标基因突变的碱基位置处的碱基为A时试样核酸中的非目标基因突变的碱基位置处的碱基不形成氢键,而在非目标基因突变的碱基位置处的碱基为T的情况下形成氢键。在这种状况下，该基因突变检测用 探针的Tm值不仅受到目标基因突变的影响，而且也受到非目标基因突变的影响，从而在使用该本发明的范围之外的基因突变检测用探针的情况下，不能适当地检测目标基因突变的状态。如此，在编码对象基因的碱基序列中所含的多个基因突变中使用与和该碱基序列互补的碱基序列具有同源性的基因突变检测用探针来检测目标基因突变的情况下，通过将探针上对应于非目标基因突变的碱基位置处的碱基设为与该非目标基因突变的正常型和突变型中任何一者均不结合的碱基(非互补的碱基)，能够避免受到非目标基因突变的影响。本发明涉及的包括所述(PD或(Pl-I)寡核苷酸的基因突变检测用探针能够不受非目标基因突变的碱基位置处的碱基型的影响而特异性地检测目标基因突变。同样地，在编码对象基因的碱基序列中所含的多个基因突变中使用相对于与该碱基序列相同的碱基序列具有同源性的基因突变检测用探针来检测目标基因突变的情况下，通过将探针上对应于非目标基因突变的碱基位置处的碱基设为与该非目标基因突变的正常型和突变型中任何一者均不同的碱基(不同的碱基)，能够避免受到非目标基因突变的影响。本发明涉及的包括所述(ΡΓ )或(ΡΓ -I)寡核苷酸的基因突变检测用探针能够不受非目标基因突变的碱基位置处的碱基型的影响而特异性地检测目标基因突变。本发明涉及的基因突变检测用探针能够识别包括单碱基取代型、缺失型以及插入型在内的突变中的任意一种突变。其中，从检测灵敏度的观点来说，本发明涉及的基因突变检测用探针作为识别单碱基取代型的突变(单碱基突变)的基因突变检测用探针尤其有用。本发明涉及的(Pl)或(P1-1)寡核苷酸是除了对应于非目标基因突变的碱基位置处之外，相对于与编码含有目标基因突变的基因的碱基序列互补的碱基序列具有同源性的寡核苷酸。另一方面，(Pr )或(ΡΓ -I)的寡核苷酸为除了对应于非目标基因突变的碱基位置处之外，相对于与编码含有目标基因突变的基因的碱基序列相同的碱基序列具有同源性的寡核苷酸。公知的所有基因均可以应用于本发明涉及的对象基因。另外，本发明的对象基因中含有结构基因和转录调控区中的某个。在本说明书中，转录调控区是指广泛存在于基因信号序列的5’上游区域(也可以存在于第一内含子)的序列，是在RNA聚合酶从基因转录RNA时控制其转录的序列。另外，在结构基因中，外显子的位点或内含子的位点可以存在基因突变。在更具体的实施例中，基因突变也可以存在于外显子的位点。在本发明中“具有同源性”例如可以是编码本发明的基因突变检测用探针的碱基序列和“与编码所述对象基因的碱基序列的全部或部分互补的碱基序列”之间具有80 % 100%的同源性的寡核苷酸。另外，从检测灵敏度的观点来说，可以显示85%以上的同一性、90%以上的同一性、95%以上的同一性、96%以上的同一性、97%以上的同一性、98%以上的同一性或者99%以上的同一性。
如果同源性为80%以上，则针对含有包含作为检测对象的目标基因突变的对象基因的试样核酸的检测灵敏度变得良好。在一实施例中，根据本发明的Pl或Pl-I寡核苷酸除了对应于非目标基因突变的碱基位置、以及可选地除了对应于目标基因突变的碱基位置之外，与编码含有目标基因突变和非目标基因突变的对象基因的部分碱基序列互补(完全互补)。在另一实施例中，根据本发明的Pl或Pl-I寡核苷酸除了对应于非目标基因突变的碱基位置、以及可选地除了对应于目标基因突变的碱基位置之外，与编码含有目标基因突变和非目标基因突变的对象基因的全部碱基序列互补。在一实施例中，根据本发明的ΡΓ或ΡΓ -I寡核苷酸除了对应于非目标基因突变的碱基位置、以及可选地除了对应于目标基因突变的碱基位置之外，与编码含有目标基因突变和非目标基因突变的对象基因的部分碱基序列相同。在另一实施例中，根据本发明的ΡΓ或ΡΓ -I寡核苷酸除了对应于非目标基因突变的碱基位置、以及可选地除了对应于目标基因突变的碱基位置之外，与编码含有目标基因突变和非目标基因突变的对象基因的全部碱基序列相同。下面说明本发明中的“在严谨条件下杂交”。杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法，例如可以根据MolecularCloning 3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中记载的方法等来进行。该文献通过参考被并入本说明书中。严谨条件是指发生特异性杂交而形成杂交体但非特异性杂交不发生的条件。典型的严谨条件是指，例如可以举出在钾浓度为约25mM 约50mM、以及镁浓度为约I. OmM 约5. OmM中进行杂交的条件。作为本发明的条件的示例，例如可以举出在Tris-HCl (pH8. 6)、25mM的KC1、以及I. 5mM的MgCl2下进行杂交的条件，但是不限于此。此外，严谨条件被记载在 Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press,2001)中。该文献通过参考被并入本说明书中。本领域技术人员能够通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等来容易地选择上述条件。以下说明本发明涉及的(PD、(Pl-I)、(ΡΓ)和(ΡΓ-l)的寡核苷酸。根据需要，以序列编号I或序列编号2所示的碱基序列为例进行说明，但是本发明涉及的(Pl)、(Ρ1-1)、(Pr )和(ργ -D的寡核苷酸不限于此。序列编号I所示的碱基序列为对药物代谢酶CYP3A4的基因突变(CYP3A4*lBrs2740574)进行编码的碱基序列。对CYP3A4进行编码的CYP3A4基因位于人的第7染色体。CYP3A4基因突变例如被报告与免疫抑制剂他克莫司(TaciOlimus)等药物代谢相关联(Clin. Pharmacol. Ther.，2006 年，Vol. 80, p. 179-191)。因此，CYP3A4 基因的突变的检测结果在选择更有效的疾病治疗方法时等是极其重要的信息。这里，作为CYP3A4基因突变的rs2740574在序列编号I的第501位碱基处具有突变喊基。该 rs 编号表不 National Center for Biotechnology Information 的 dbSNP 数据库(//www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/SNP/)的登录编号(以下相同)。在 CYP3A4 基因的野生型中，与序列编号I所示的碱基序列的第501位对应的碱基为A (腺嘌呤)，在突变型中突变为G (鸟嘌呤)。序列编号2所示的碱基序列示出了用于检测序列编号I所示的碱基序列中第501位的目标基因突变的、本发明涉及的基因突变检测用探针的示例。 本发明中的、编码对象基因的碱基序列含有多个基因突变。具体地，编码所述对象基因的碱基序列含有两个以上的基因突变，例如可以含有三个基因突变、四个基因突变。在编码对象基因的碱基序列中所含的多个基因突变中，可以根据需要从编码对象基因的碱基序列中适当选择目标基因突变。例如，在编码序列编号I的CYP3A4基因的碱基序列中，可以将第501位的基因突变选择为作为检测对象的目标基因突变。因此，以序列编号I为例，本发明涉及的“目标基因突变的突变型碱基”为A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)，本发明涉及的“目标基因突变的野生型碱基”为A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)中的另一者。在(Pl)或(Pl-I)寡核苷酸中，以序列编号I所示的碱基序列为例，T (胸腺嘧啶)或C(胞嘧啶)对应于“对应于目标基因突变的碱基位置处的、与目标基因突变的碱基的野生型和突变型中任意一者互补的碱基”。在(Pl)或(Pl-I)寡核苷酸的示例中，以序列编号I所示的碱基序列为例，序列编号I所示的碱基序列的第507位的R对应于“非目标基因突变的突变型碱基”。第507位碱基位置处，R在野生型中为A(腺嘌呤)，在突变型中突变成了 G(鸟嘌呤)。在(Pl)或(Pl-I)寡核苷酸中，以序列编号I所示的碱基序列为例，A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)对应于“对应于非目标基因突变的碱基位置处的、与非目标基因突变的碱基的野生型和突变型中任何一者均非互补的碱基”。在(Pl)寡核苷酸中，以序列编号I所示的碱基序列为例，与由编码CYP3A4基因的碱基序列中的第496位 第516位的碱基形成的碱基序列互补的碱基序列对应于“与编码所述对象基因的喊基序列互补的喊基序列”。在(Pl-I)寡核苷酸中，以序列编号I所示的碱基序列为例，具有与由编码CYP3A4基因的碱基序列中的第496位 第516位的碱基形成的碱基序列相同碱基序列的寡核苷酸对应于“与编码所述对象基因的碱基序列具有相同碱基序列的寡核苷酸”。在(ΡΓ)或(ΡΓ-l)寡核苷酸中，以序列编号I所示的碱基序列为例，A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)对应于“与目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱
其”在(ΡΓ )或(ΡΓ -I)寡核苷酸中，以序列编号I所示的碱基序列为例，T (胸腺嘧啶)或C(胞嘧啶)对应于“与非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基”。关于(ΡΓ )或(ΡΓ -I)寡核苷酸的与(Pl)或(Pl-I)寡核苷酸共同的除上述以外的方面，适用对所述(PD或(Pl-I)寡核苷酸描述的所有事项。
此外，目标基因突变的碱基位置处的碱基是一个野生型的碱基和一个突变型的碱基的情况、是一个野生型的碱基和两个突变型的碱基的情况、以及是一个野生型的碱基和三个突变型的碱基的情况中的任意情况均被包括在本发明的“目标基因突变”中。本发明中的(PI)、(Pl-I)、(ΡΓ )或(ΡΓ -I)寡核苷酸可以举出满足下述(a)至(f)中任一关系的寡核苷酸。(a)在所述非目标基因变异为从A和T中选择的碱基的情况下，所述非互补的碱基或所述不同的碱基为C或G。即，在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为A和T中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为A和T中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基或者与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为C或G。(b)在所述非目标基因变异为从C和G中选择的碱基的情况下，所述非互补的碱基 或所述不同的碱基为A或T。即，在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为C和G中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为C和G中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基或者与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为A或T。(C)在所述非目标基因变异为从A和C中选择的碱基的情况下，所述非互补的碱基为A或C，所述不同的碱基为T或G。在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为A和C中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为A和C中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基或者与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为T或G。(d)在所述非目标基因变异为从A至G中选择的碱基的情况下，所述非互补的碱基为A或G，所述不同的碱基为T或C。在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为从A和G中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为A和G中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基或者与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为T或C。(e)在所述非目标基因变异为从T和C中选择的碱基的情况下，所述非互补的碱基为T或C，所述不同的碱基为A或G。在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为T和C中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为T和C中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基所述非互补的碱基为T或C，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为A或G。(f)在所述非目标基因变异为从T和G中选择的碱基的情况下，所述非互补的碱基为T或G，所述不同的碱基为A或C。在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为T和G中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为T和G中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基为T或G，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为A或C。另外，本发明中的寡核苷酸中也包含通过插入、缺失或取代了至少一个碱基来修饰所述Ρ1、Ρ1-1、ΡΓ或ΡΓ -I的寡核苷酸而获得的寡核苷酸。通过插入、缺失或取代了至少一个碱基来修饰所述Ρ1、Ρ1_1、ΡΓ或ΡΓ -I的寡核苷酸而获得的寡核苷酸只要显示与所述PU Pl-U ΡΓ或ΡΓ -I的寡核苷酸同等程度的作用即可。在插入、缺失或取代了碱基的情况下，该插入、缺失或取代的位置无特别限定。作为插入、缺失或取代了的碱基的数量，可以举出一个碱基或两个碱基以上，根据寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以举出I碱基 10碱基或I碱基 5碱基。作为本发明的所述Ρ1、Ρ1_1、ΡΓ或ΡΓ-l的寡核苷酸的长度，可以举出为Ilmer 60mer的情况。在为该范围的情况下，基因突变的检测灵敏度变得良好。另外，作为本发明的所述PU Pl-U ΡΓ或ΡΓ -I的寡核苷酸的长度，可以为12mer 55mer> 15mer 45mer、或 18mer 40mer。倉泛够设置为 12mer 55mer 的范围。由此，例如有检测灵敏度变高等的倾向。另外，通过改变所述PU Pl-I、ΡΓ或ΡΓ -I的寡核苷酸的碱基长，例如能够将所 述PU Pl-U ΡΓ或ΡΓ -I的寡核苷酸与其互补链(靶标序列)所形成的杂交体的解离温度、即Tm值调节至期望的值。以下，对用于设计本发明的基因突变检测用探针的方法，举出具体例进行说明。但是，本发明不限于这些。序列编号3所示的碱基序列为含有rs20542的序列。在序列编号3所示的碱基序列中，含有第251位碱基的目标基因突变和其附近的第256位碱基的非目标基因突变。在这种情况下，在相当于所述(PD或(P1-1)的寡核苷酸的基因突变检测用探针中，将第251位的碱基处与野生型碱基和突变型碱基中任意一者互补的碱基选择作为Pl或Pl-I中对应碱基位置处的碱基，而将第256位碱基处与非目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基均不互补的碱基，选择作为Pl或Pl-I寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基。具体地，在表I中，可举出序列编号4或序列编号5所示的基因突变检测用探针。另外，在相当于所述(ΡΓ)或(ΡΓ-l)的寡核苷酸的基因突变检测用探针中，将第251位的碱基处与野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基选择作为ΡΓ或ΡΓ -I中对应碱基位置处的碱基，而将第256位碱基处与非目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基均不同的碱基，选择作为ΡΓ或ΡΓ -I寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基。具体地，在表I中，可举出序列编号6或序列编号7所示的基因突变检测用探针。通过使用所得到的序列编号4 序列编号7所示的基因突变检测用探针中的任意一种探针，当检测有无序列编号3所示的碱基序列中的第251位的目标基因突变时，即使在该第251位的碱基的附近存在非目标基因突变的情况下，也能够特异性地检测有无该第251位的目标基因突变。在表I中，带下划线的大写字母表示作为检测对象的目标基因突变，未带下划线的大写字母表示非目标基因突变。以下相同。表I
序列编号4(突光染料)-cTccagCagggcgagga
序列编号5(突光染料)-cAccagCagggcgagga
序列编号6(突光染料)-cctcgccctActggAgct
序列编号7(突光染料)-cctcgccctActggTgct
序列编号8所不的喊基序列为含有rsll881222的序列。在序列编号8所不的喊基序列中，含有第355位中的目标基因突变和其附近的第364位的非目标基因突变。在这种情况下，在相当于所述(Pl)或(P1-1)的寡核苷酸的基因突变检测用探针中，将第355位的碱基处与野生型碱基和突变型碱基中任意一者互补的碱基选择作为Pl或Pl-I中对应碱基位置处的碱基，而将第364位碱基处与非目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基均不互补的碱基，选择作为Pl或Pl-I寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基。具体地，在表2中，可以举出序列编号9或序列编号10所示的基因突变检测用探针。另外，在相当于所述(ΡΓ)或(ΡΓ-l)的寡核苷酸的基因突变检测用探针中，将第355位的碱基处与野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基选择作为ΡΓ或ΡΓ -I中对应碱基位置处的碱基，而将第364位碱基处与非目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基均不同的碱基，选择作为P1’或Pl’-l寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基。具体地，在 表2中，可举出序列编号11或序列编号12所示的基因突变检测用探针。通过使用所得到的序列编号9 序列编号12所示的基因突变检测用探针中的任意一种探针，当检测有无序列编号8所示的碱基序列中的第355位的目标基因突变时，即使在该第355位的碱基的附近存在非目标基因突变的情况下，也能够特异性地检测有无该355位的目标基因突变。表2
序列编号9 tccAtctctcctCtcccc-(荧光染料)
序列编号10 tccGtctctcctCtcccc-(荧光染料)
序列编号11 gggaGaggagagaTggac-(荧光染料)
序列编号12 gggaGaggagagaCggac-(荧光染料)序列编号13所示的碱基序列为含有rs80230660的序列。在序列编号13所示的碱基序列中，含有第201位的目标基因突变和其附近的第187位的非目标基因突变。在这种情况下，在相当于所述(Pl)或(Pl-I)的寡核苷酸的基因突变检测用探针中，将第201位的碱基处与野生型碱基和突变型碱基中任意一者互补的碱基选择作为Pl或Pl-I中对应碱基位置处的碱基，而将第187位碱基处与非目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基均不互补的碱基，选择作为Pl或Pl-I寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基具体地，在表3中，可举出序列编号14或序列编号15所示的基因突变检测用探针。另外，在相当于所述(ΡΓ)或(ΡΓ-l)的寡核苷酸的基因突变检测用探针中，将第201位的碱基处与野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基选择作为ΡΓ或ΡΓ -I中对应碱基位置处的碱基，而将第187位碱基处与非目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基均不同的碱基，选择作为P1’或Pl’-l寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基。具体地，在表3中，可举出序列编号16或序列编号17所示的基因突变检测用探针。通过使用所得到的序列编号14 序列编号17所示的基因突变检测用探针中的任意一种探针，当在序列编号13所示的碱基序列中检测有无第201位的目标基因突变时，即使在该第201位的碱基的附近存在非目标基因突变的情况下，也能够特异性地检测有无该第201位的目标基因突变。表权利要求
1.一种基因突变检测用探针，用于检测对含有目标基因突变和非目标基因突变的对象基因进行编码的碱基序列中的所述目标基因突变，所述探针包括从下述pi、pi-i、pi’及pr -I的组中选择的至少一种寡核苷酸 (PD寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置处具有与所述目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者互补的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置处具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基，而且其相对于与编码所述对象基因的碱基序列的全部或部分互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性； (Pl-I)寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置处具有与所述目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者互补的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置处具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基，而且其与和编码所述对象基因的碱基序列具有相同碱基序列的寡核苷酸在严谨条件下杂交； (pr )寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置处具有与所述目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置处具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基，而且其相对于与编码所述对象基因的碱基序列的全部或部分具有至少80%以上的同一性；以及 (pr -D寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置处具有与所述目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置处具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基，而且其与具有与编码所述对象基因的碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸在严谨条件下杂交。
2.根据权利要求I所述的基因突变检测用探针，其中，所述基因突变检测用探针满足下述(a)至(f)中的任一条件 (a)在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为A和T中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为A和T中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基或者与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为C或G ; (b)在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为C和G中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为C和G中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基或者与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为A或T ; (c)在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为A和C中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为A和C中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基或者与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为T或G ; (d)在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为从A和G中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为A和G中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基或者与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱 基中任何一者均不同的碱基为T或C ; (e)在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为T和C中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为T和C中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基所述非互补的碱基为T或C，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为A或G ; (f)在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为T和G中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为T和G中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基为T或G，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为A或C。
3.根据权利要求I所述的基因突变检测用探针，其中，所述寡核苷酸为荧光标记寡核苷酸。
4.根据权利要求3所述的基因突变检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸的3’末端或5’末端的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记。
5.根据权利要求3所述的基因突变检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸位于从3’末端或5’末端起数第I 3位的任意位置。
6.根据权利要求I所述的基因突变检测用探针，其中，所述基因突变检测用探针为用于分析熔解曲线的探针。
7.根据权利要求3所述的基因突变检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少或增加。
8.根据权利要求3所述的基因突变检测用探针，所述荧光标记寡核苷酸与靶标序列杂交时的突光强度比未与祀标序列杂交时的突光强度减少。
9.一种基因突变检测方法，其使用权利要求I至8中任一项所述的基因突变检测用探针来检测作为检测对象的目标基因突变。
10.一种目标基因突变检测方法，包括 (I)使权利要求3至8中任一项所述的基因突变检测用探针和试样中的单链核酸接触来获得杂交体； (II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离，并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动； (III)基于所述荧光信号的变动来获得杂交体的解离温度，即Tm值； (IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中目标基因突变的存在。
11.根据权利要求10所述的目标基因突变检测方法，还包括在获得所述(I)的杂交体之前或者与获得所述(I)的杂交体的同时扩增核酸。
12.—种基因突变检测用试剂盒，包含权利要求I至8中任一项所述的基因突变检测用探针。
13.根据权利要求12所述的基因突变检测用试剂盒，还包含引物，所述引物能够扩增具有与权利要求I至8中任一项所述的基因突变检测用探针杂交的区域的碱基序列。
全文摘要
本发明提供一种即使对基因进行编码的碱基序列含有多个基因突变也能够不受基因突变检测对象之外的基因突变的影响而特异性地检测作为检测对象的特定的基因突变的基因突变检测用探针。基因突变检测用探针用于检测编码含有目标基因突变和非目标基因突变的对象基因的碱基序列中的所述目标基因突变，并包括(P1)寡核苷酸等，(P1)寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置具有与所述目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基互补的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基均非互补的碱基，而且相对于与编码所述对象基因的碱基序列的全部或部分互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性。
文档编号C12Q1/68GK102766683SQ20121013217
公开日2012年11月7日 申请日期2012年4月27日 优先权日2011年5月2日
发明者井口亚希, 平井光春, 黑瀬熏 申请人:爱科来株式会社