一种海洋广盐性绿藻分离淡化培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种海洋广盐性绿藻分离淡化培养方法，其特征为：所述的海洋广盐性绿藻分离淡化方法步骤如下：a、将从海洋中采集的水样稀释后直接涂布于蒸馏水配制的琼脂培养基上，在适应的条件下培养出单藻落；b、将上述培养出的单菌落转移到新的琼脂培养基上通过划线方法进一步纯化；c、将上述划线纯化的单藻落接入液体培养基放在适宜的条件下放大培养出单种藻。本发明的方法经多种海洋绿藻分离淡化培养实验证明，是一种操作简单有效，效率较高的方法，很适应于大量筛选海洋广盐性绿藻中推广应用，有利于筛选优质的藻类资源，大幅度提高优质藻种筛选效率。
【专利说明】一种海洋广盐性绿藻分离淡化培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及到微藻的【技术领域】，具体说是一种用于广盐性绿藻快速分离筛选及淡化的培养方法。
技术背景
[0002]微藻是一种分布广、生长快微型光合水生生物，其光能利用率比大田作物高几倍到几十倍，可以利用微藻开发各种食品、化学药品及人类健康的生物活性物质等各种产品，如胡萝卜素、虾青素、藻胆素、脂肪酸、多糖类、维生素、乙醇和生物柴油等产品。以上各种产品极具有经济价值。
[0003]鉴于以上藻类的优良特点及较高的商业价值，以此对藻类的应用和选择具有重要意义，优良藻种的选择显得更为重要。优良的藻种首先要具备生长快、适应性强、所需活性物质含量较高。盐度的广泛适应性是微藻适应性强和商业化的重要指标之一，现有几种商业化的藻类(如盐藻，雨生红球藻)皆满足生长速度快和所需活性物质含量较高，但对于盐度的适应性较差，在培养过程中极易因盐度的变化而导致培养失败；海洋中含有丰富的微藻种质资源，为从海洋中选择广盐性微藻提供了有利条件，现有技术首先将微藻分离后用海水培养，然后通过逐步加淡水的方式淡化，用时较长，效率较低且操作盲目性较大，不适合大量筛选广盐性藻类。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种海洋广盐性绿藻快速分离筛选及淡化的培养方法，它可丰富现有广盐性藻的种类及淡化方法。
[0005]为了实现上述目的，本发明的技术方案是:一种海洋广盐性绿藻分离淡化培养方法，其特征在于:所述的海洋广盐性绿藻分离淡化方法包括如下步骤:a、采集的海水为海湾内或入海口处，将采集的海水用蒸馏水稀释10后后直接涂布于蒸馏水配制的琼脂培养基上，在20-28度，光照1000-4000LUX的条件下根据单藻落得生长速度培育7-20天，直到单藻落达到1mm左右的时候再进行转培养；b、将上述达到1mm左右的的单藻落用牙签或者接种环转移到新的蒸馏水配制的琼脂培养基上，通过划线方法进一步将藻类纯化，在20-28度光照1000-4000LUX的情况下培养7-20天；C、将上述琼脂培养基上生长良好的菌落再次接入蒸馏水配制的液体培养基培养，培养10天左右，生长出来的微藻就实现分离与淡化的效果。
[0006]我们用这种方法分离并淡化了大约30种海洋绿藻，30种海洋绿藻的成功分离及淡化培养的实验表明，此方法是一种有效的，效率高的方法，适合于海洋广盐性藻类分离、淡化、筛选，有较高的应用价值，为筛选广适应性的藻类提供了有效的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1为海水稀释后直接涂板的藻类菌落生长效果图。[0008]图2为转移划线培养后的藻类实体生长效果图。
[0009]图3为分离纯化后的微藻在淡水液体培养基内的生长效果图。
【具体实施方式】
[0010]下面结合实施例对本发明做进一步的描述。
[0011]本发明一种海洋广盐性绿藻快速分离筛选及淡化的培养方法，其特征在于:所述的一种海洋广盐性绿藻快速分离筛选及淡化的培养方法包括如下步骤:a、将从海洋中采集的水样用蒸馏水稀释直接涂布于蒸馏水配制的琼脂培养皿上，每个培养皿含有琼脂培养及15-40ml。其琼脂培养基组成如下:溶液20ml包含K2HPO4 0.02g; MgSO4.7H20 0.02g；KNO3 0.2g; 土壤抽提液100ml，琼脂0.96-1.5g;b、将上述培养出的单菌落转移到新的琼脂培养基上通过划线方法进一步纯化；C、将上述划线纯化的单藻落接入液体培养基内培养，其液体培养基的组成如下:溶液20ml包含K2HPO4 0.02g; MgSO4.7H20 0.02g ; KNO3
0.2g; 土壤抽提液100ml，a步骤中将海水水样用10倍的蒸馏水稀释，取水样0.1-1ml直接涂与琼脂培养基上，放在温度20-28光照1000-4000Lux的环境下进行培养7_20天，a步骤和b步骤中琼脂培养是15-40ml，是液体培养加入0.8%-1.5%的琼脂后在121度灭菌20分钟后分装到各个培养皿内，用无菌封口膜密封备用，C、步骤中液 体培养基是用蒸馏水配置好在121度高压灭菌20分钟后冷却备用，液体培养基体积为100ml。
[0012]实施例1 一种海洋广盐性绿藻快速分离筛选及淡化的培养方法。
[0013]具体步骤操作如下:a、从沿海或河流入海口处用500ml的白色塑料瓶，在海水表层或海水不深于3m处取回水样，取回来的水样放入15玻璃试管内，海水水样1ml，用9ml的蒸馏水进行稀释，用移液枪吸取稀释的水样0.1-1ml滴在琼脂培养基上，用玻璃棒将水滴涂抹均匀后，用封口膜将培养皿封存好，放在培养箱内培养，培养条件2 O - 2 8度，光照1000-4000Lux,培养7-20天(参考图1)。琼脂培养基组分为:溶液20ml包含K2HPO4 0.02g;MgSO4.7H20 0.02g ; KNO3 0.2g; 土壤抽提液 100ml，琼脂 0.96-1.5g。
[0014]等待a中的藻落涨到Imm左右时，用消毒后的牙签或者接种环在无菌操作台内将单藻落用划线的方法接种到新的琼脂培养基上培养(参考图2)，在培养箱内温度20-28度，光照1000-4000Lux范围内培养。
[0015]等到所划线藻生长到如图2状态时，同样在无菌操作台中用消毒后的牙签或者接种环将上述的藻细胞转移到蒸馏水配置的液体培养基中培养。液体培养基组分为溶液20ml包含 K2HPO4 0.02g; MgSO4.7H20 0.02g ; KNO3 0.2g; 土壤抽提液 100ml。
[0016]将上述接种到IOOml三角烧瓶内培养7-20天，等到藻类生长到如图3的状态，然后通过显微镜检验藻类的纯度和形态。
[0017]通过上述方法我们将已经分离纯化的藻类进行ISsrDNA的分子鉴定
通过这种方式我们已经分离出28个藻类:0urococcus sp.C24, Scenedesmusobtususgene, Chlorella sp.CCAP 222/18, Chlorella sp.KMMCC FC-21, Chlorella sp.CB 2008/110
Micractinium sp.CCAP 248/14, Scenedesmus armatus var.subalternans,Chlorellasorokiniana, Chlorellaceae sp.M7,Monoraphidium contorturnstrain AS6-3,Chlorella sp.CB 2008/110, Nannochloris sp.,Sphingomonas sp.Frlj Desmodesmus pannonicus，Chlorella vulgaris strain KMMCC FC—42，Desmodesmusintermedius,Hindakiafal lax strain CCAP 222/30, Chlorella sp.CB2008/110，Mychonastes rotundus strain CCAP 260/14， Chlorella vulgaris strainKMMCC FC-42, Chlorella sp.CB 2008/110, Chlorella sp.KMMCC FC-21, RaphidonemaspiculiformeChlorella sp.，CCAP 222/18，Chlorella sp.CB 2008/110，Micractiniumsp., CCAP 211/92Monoraphidiumcontortum strain AS6-3，Scenedesmusobliquus (斜生栅藻)。
[0018] 上述所分离出的藻种现在保存于北京大学深圳研究院环境与能源藻类工工程研发及应用 实验室。
【权利要求】
1.一种海洋广盐性绿藻分离淡化培养方法，其特征在于:所述的广盐性绿藻的分离培养方法包括如下步骤:a、将从海洋中采集的水样稀释后直接涂布于蒸馏水配制的琼脂培养基上，在适应的条件下培养出单藻落；b、将上述培养出的单菌落转移到新的琼脂培养基上通过划线方法进一步纯化；C、将上述划线纯化的单藻落接入液体培养基放在适宜的条件下放大培养出单种藻。
2.根据权利要求1所述的一种海洋广盐性藻类的分离淡化培养方法，其特征在于:步骤a中的海水为海湾处或入海口处海水，所述的稀释用水为蒸馏水，稀释浓度为原海水的10倍。
3.根据权利I所述的一种海洋广盐性藻类的分离淡化培养方法，其琼脂培养基组成如下:溶液 20ml 包含 K2HPO4 0.02g; MgSO4.7H20 0.02g ; KNO30.2g; 土壤抽提液 100ml，琼脂0.96-1.5 ;土壤抽提液的制备方法:土壤取自无污染、无施肥的、无喷洒化学药物的树林内土壤，将土壤取出一些杂物等在空气中风干用2-4_的筛子过滤，加入两倍体积的蒸馏水高压灭菌15分钟用whatman Nol过滤后方可使用。
4.根据权利I所述的一种海洋广盐性藻类的分离淡化培养方法，其特征在于:a步骤和c步骤中所述的是以培养条件为:温度20-28度，光照1000-3000Lux。
5.根据权利I所述的一种海洋广盐性藻类的分离淡化培养方法，其特征在于:按步骤中所述的琼脂培养基和c 步骤中所述的液体培养基所用水均为蒸馏水。
【文档编号】C12N1/12GK103451102SQ201210169713
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年5月29日 优先权日:2012年5月29日
【发明者】张善发, 汪光义, 邵聪, 刘 英 申请人:北京大学深圳研究生院