专利名称：采用芥菜型油菜基因ans和埃塞俄比亚芥ban共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种基因工程和微生物发酵技术领域的方法，特别是一种采用双关键酶基因共转化和在培养基中添加关键酶基因催化反应如体物的粗提物来提闻大肠杆菌合成原花色素的方法。
背景技术：
原花色素(Proathocyanidins),也叫原花青素,是类黄酮的一种。原花色素是清除自由基最强的抗氧化剂之一，能保护大脑与神经组织，改善血液循环，灵活关节和年轻皮肤的作用。长期食用高含原花色素的食品，可以缓解心血管等疾病。科学家还发现原花色素及其衍生物还具有抗炎、抗逆境、抗肿瘤以及免疫调节的功能，可见原花色素素是一种极具潜力的天然药物，消费需求越来越大。
目前原花色素的主要来源是从植物组织部分提取，但植物生长需要较长的时间，原花色素的含量不高且提取工艺比较复杂，产率低，使得原花色素的大规模商业化生产受到了限制。由于原花色素人工合成难度较大，产量低，成本高，可行性不强。我们在前期的研究中发现芥菜型油菜基因ANS (anthocyanidin synthase,花色素合成酶)和埃塞俄比亚BAN (anthocyanidin reductase花色素还原酶)的表达量与种皮原花色素的含量呈正相关。经对现有技术文献检索发现YanY J等(2008)在《生物工程与生物技术》(Biotechnol. Bioeng. 2008; 100: 126 - 140)上报道了利用在大肠杆菌中表达拟南芥、非洲菊(Gerbera),矮牵牛(Petunia)、金鱼草(Antirrhinum)中的花色素(Anthocyanin)合成途径中的基因可以提高大肠杆菌花色素的合成量，花色素和原花色素都属于类黄酮类物质，但未见有采用芸薹属物种原花色素合成基因来提高大肠杆菌原花色素的合成量的报道。花色素合成酶ANS和花色素还原酶BAN是原花色素合成途径中的二个关键酶，研究表明，花色素合成酶和花色素还原酶的活性越高，越有利于合成原花色素，采用基因工程手段，用关键酶基因ANS和BAN共转化大肠杆菌，加强它们在大肠杆菌中的表达，将打破原花色素生物合成限速瓶颈，从而获得原花色素高产的菌株，为规模化生产原花色素提供一条新途径。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种采用基因ANS和BAN共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法。本发明涉及的关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、原花色素提取及含量测定。本发明建立了提高大肠杆菌中产原花色素的方法，为利用转基因大肠杆菌大规模生产原花色素奠定坚实的基础。本发明是通过以下技术方案实现的一种采用芥菜型油菜基因ANS和埃塞俄比亚芥BAN共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法，包括以下步骤
(O从芥菜型油菜种子的cDNA中克隆花色素合成酶ANS基因和埃塞俄比亚芥种子的cDNA中克隆花色素还原酶BAN基因；
(2)把ANS和BAN基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含ANS和BAN基因的原核表达载体；
(3)将ANS和BAN基因同时导入BL21大肠杆菌，转化的单菌落在O.5-1. O mL的LB液体培养基中，28-380C，150-250rpm (转/分钟)培养6_12小时候后，再在含黑色葡萄皮提取物的LB液体培养基中，28-380C，150-250rpm震荡培养36-54小时后，常温下，10000-12000g离心10_20min收集菌体；
(4)采用DMACA-HC1法测定大肠杆菌所含原花色素的量，筛选获得原花色素含量提高的大肠杆菌菌株。所述的LB液体培养基中含O. 2-0. 8g/L的黑色葡萄皮提取物。所述的黑色葡萄皮提取物提取方法是将黑色或深红色的葡萄皮用粉碎机粉碎， 过I.O mm的筛，将用20%-50%的甲醇(v/v)作为萃取溶剂，葡萄皮量与溶剂用量之比为I : 3-5(w/w)，萃取温度为50°C-60°C，萃取时间为3-6h。回收甲醇后的浓缩液在10000-12000g离心10-15min，过滤去渣，然后在浓缩液中加入丙酮，浓缩液与丙酮之比为I l-2(v/v)，搅拌混匀5-10min，，过滤除去杂质，浓缩液经回收丙酮后，在40°C _60°C下真空干燥即得葡萄皮提取物。本发明的ANS和BAN共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法，是采用基因工程方法，将关键酶基因ANS和BAN导入大肠杆菌中，获得了原花色素含量显著提高的转基因大肠杆菌株，共转ANS和BAN基因大肠杆菌中原花色素的含量最高可达到14. 5mg/gFW(鲜重)，是非转化普通大肠杆菌的(O. 6-1. lmg/g Fff)的13. 2-24. 2倍，该发明对于为原花色素规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的《分子克隆实验室手册》(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),郑伟娟等的《现代分子生物学实验》(北京高等教育出版社，2010)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。(一)油菜ANS和BAN基因的克隆
(O芥菜型油菜种子和埃塞俄比亚芥种子总RNA的提取
分别少量取芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥授粉后20-25天的种子，具体操作按严明理等(严明理，刘忠松，官春云，陈社员，刘显军.一种提取高质量油菜种子和种皮RNA的方法.生物技术通报.2007，6:97-100)的方法进行总RNA的提取。(2)芥菜型油菜ANS和BAN基因的克隆
将所获的油菜种皮总RNA通过反转录酶(AMV)反转录获得第一链cDNA，根据所述油菜ANS基因的编码序列(序列表中的序列I)和BAN基因的编码序列(序列表中的序列2)，分别设计扩增出完整编码序列的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(根据选用的载体而定)，以便构建表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后，产物连接到PMD18-T克隆载体后进行测序。DNA序列测定由生物公司采用3730测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与预测的ANS(序列表中的序列I)和BAN基因(序列表中的序列2)的编码序列一致。采用基因克隆方法从芥菜型油菜中获得序列正确的原花色素生物合成关键酶基因ANS和BAN，为通过双关键酶基因共转化策略提高大肠杆菌中原花色素含量提供了两个重要关键酶基因。(二)黑色葡萄皮提取物的提取
将黑色或深红色的葡萄皮用粉碎机粉碎，过I. O mm的筛，将用30%的甲醇(v/v)作为萃取溶剂，葡萄皮量与溶剂用量之比为I : 4(w/w)，温度为60°C时，萃取为3-6h。回收甲醇后的浓缩液在10000-12000g的室温下离心15min，过滤去渣，然后在浓缩液中加入丙酮，浓 缩液与丙酮之比为I : 2(v/v)，搅拌混匀lOmin，，过滤除去杂质，浓缩液经回收丙酮后，在50°C下真空干燥即得葡萄皮提取物。(三)含ANS和BAN基因的原核双元表达载体的构建
选用pMD18-ANS、pMD18-BAN和pET为基本元件，构建载体pET_ANS_BAN，具体的操作参考文献(Yan YJ, Li Z, Koffas MA. High-Yield Anthocyanin Biosynthesis inEngineered Escherichia coli. Biotechnol Bioeng, 2008, 100: 126 - 140)中报道的方法进行.
将原花色素生物合成途径关键酶基因ANS和BAN可操作性地连接于表达调控序列，形成含ANS和BAN基因的原核表达载体，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高大肠杆菌中原花色素的含量。(四)载体pET-ANS-BAN遗传转化获得高产原花色素的转基因大肠杆菌株
(1)转基因大肠杆菌株的获得
把含ANS和BAN基因原核表达载体通过热激转化法转化到BL21大肠杆菌，经过抗性选择并进行PCR验证。结果表明，含ANS和BAN基因植表达载体己成功转化到BL21大肠杆菌·
(2)大肠杆菌的培养选取含载体pET-ANS-BAN的BL21单菌落，以未转化的的BL21为对照，在I. OML的液体培养基中，37°C，200rpm(转/分钟)培养12小时候后，再转入到含黑色葡萄皮提取物(0. 2-0. 8g/L)的LB液体培养基中，37°C，200rpm培养48小时。(3)采用DMACA-HC1法测定大肠杆菌中原花色素含量
将培养好的菌液在常温下，12000g的离心力下，室温离心10分钟，收集大肠杆菌菌体。菌体中原花色素的提取和含量测定按文献(Li YG, Tanner GJ, Larkin PJ. TheDMACA-HCI Protocol and the Threshold Proanthocyanidin Content for Bloat Safetyin Forage Legumes, Journal of Science of Food and Agriculture, 1996,70:89-101)的方法进行，试验设置3次重复。本发明的共转ANS和BAN基因显著提高了大肠杆菌中原花色素含量，共转ANS和BAN基因大肠杆菌中原花色素的含量最高可达到14. 5mg/g FW，是同种培养基下非转化普通大肠杆菌的(0. 6mg/g Fff)的24. 2倍。
本实施例是采用ANS和BAN基因的代谢工程策略获得了原 花色素高产的大肠杆菌，为规模化生产原花色素提供了一种较理想的方法。
权利要求
1.一种采用芥菜型油菜基因ANS和埃塞俄比亚芥BAN共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤 (O从芥菜型油菜种子的cDNA中克隆花色素合成酶ANS基因和埃塞俄比亚芥种子的cDNA中克隆花色素还原酶BAN基因； (2 )把ANS和BAN基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含ANS和BAN基因的原核表达载体； (3)将ANS和BAN基因同时导入BL21大肠杆菌，转化的单菌落在O.5-1. O mL的LB液体培养基中，28-380C，150-250rpm (转/分钟)培养6_12小时候后，再在含黑色葡萄皮提取物的LB液体培养基中，28-38°C，150-250rpm震荡培养36-54小时后，常温下，10000-12000g离心10_20min收集菌体； (4)采用DMACA-HC1法测定大肠杆菌所含原花色素的量，筛选获得原花色素含量提高的大肠杆菌菌株。
2.根据权利要求I所述的采用芥菜型油菜基因ANS和埃塞俄比亚芥BAN共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法，其特征是，所述的LB液体培养基中含O. 2-0. 8g/L的黑色葡萄皮提取物。
3.根据权利要求I或2所述的采用芥菜型油菜基因ANS和埃塞俄比亚芥BAN共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法，其特征是，所述的黑色葡萄皮提取物提取方法是将黑色或深红色的葡萄皮用粉碎机粉碎，过1.0 mm的筛，将用20% -50%的甲醇(v/v)作为萃取溶剂，葡萄皮量与溶剂用量之比为I : 3-5(w/w)，萃取温度为50°C-60°C，萃取时间为3-6h ;回收甲醇后的浓缩液在10000-12000g离心10_15min，过滤去渣，然后在浓缩液中加入丙酮，浓缩液与丙酮之比为I : l-2(v/v)，搅拌混匀5-10min，，过滤除去杂质，浓缩液经回收丙酮后，在40°C -60°C下真空干燥即得葡萄皮提取物。
全文摘要
本发明公开了一种采用芥菜型油菜基因ANS和埃塞俄比亚芥基因BAN共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法。本发明从芥菜型油菜种子的cDNA中克隆花色素合成酶ANS基因和埃塞俄比亚芥种子的cDNA克隆花色素还原酶BAN基因，构建含ANS和BAN基因的原核表达载体pET-ANS-BAN，将ANS和BAN基因同时导入BL21大肠杆菌菌株。转化菌株在的LB液体培养基中，28-38℃，150-250rpm(转/分钟)培养6-12小时候后，再转移到葡萄皮提取物(0.2-0.8g/L)的LB液体培养基中，28-38℃，150-250rpm震荡培养36-54小时后，离心收集菌体，采用DMACA-HCl法测定大肠杆菌所含的原花色素的量。本发明获得的转基因大肠杆菌中原花色素的含量显著提高，最高达到非转化对照菌株的24.2倍。
文档编号C12N15/70GK102827861SQ201210295300
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月20日 优先权日2012年8月20日
发明者刘丽莉, 严明理, 向建华, 孙婵, 尹小明 申请人:湖南科技大学