专利名称：HIV感染疾病进展分子标志物miR-200c的制作方法
技术领域：
本发明涉及HIV感染预后诊断领域，具体来说涉及ー种HIV感染疾病进展分子标志物miR-200c，其可应用于在HIV感染早期进行预后评估，以给患者及时有效地随访、治疗等干预措施，以延长生存时间，提闻生存质量。
背景技术：
microRNA (miRNA)是近年来的研究热点,它是ー种广泛存在于真核生物中的单链小分子RNA，不具编码功能，但它能够结合于基因序列的侧翼区域阻遏或抑制靶mRNA的翻译，具有高度的保守性、时序性和组织特异性，目前在肿瘤、血液病、病毒感染等多种疾病的临床诊断、治疗及预后评价等领域发挥了重要作用。
艾滋病是ー个世界性的重大传染病，严重威胁人们的健康和影响经济社会的发展。HIV感染后，疾病进展速度不同，一般经8-10年进入艾滋病期，称为“典型进展者”。但10%的感染者，在感染三年甚至一年内⑶4+T细胞显著下降至350个/微升以下，称为“快速进展者”。如快速进展者诊断后不能定期随访及尽早治疗，则发病率及死亡率将持续上升，且增加传播风险。目前，我国经性途径HIV感染者不断増加，男男性接触中快速进展者比例较高，如果在HIV感染早期能对预后进行有效预測，区分快速进展者及典型进展者，个体化合理安排病人的随访及治疗，不仅可以提高HIV感染者的生存时间及生存质量，对国家的艾滋病防治工作亦具有重要意义。目前，HIV感染疾病进展及预后评价的方式主要有以下几种CD4+T细胞数量、病毒载量、免疫活化等其他指标。CD4+T细胞数量是HIV感染的靶细胞，可有效反映机体免疫状态，但其检测需要流式细胞仪，仪器及相应试剂价格昂贵，技术要求高，不适合普遍开展，且快速进展者及典型进展者在HIV感染早期，CD4+T细胞数量差异不够显著，不易对未来的疾病进展进行有效预测；病毒载量在HIV感染早期波动较大，且并不与临床免疫状态完全平行；免疫活化等指标虽有报道可预测疾病预后，但对设备要求高，需要专业人员的分析，标本最好选用新鲜标本，储存运输不便，难以推广。近年来的研究表明，HIV感染和miRNA密切相关，miRNA可以通过作用于病毒本身或作用于免疫系统从而影响疾病进展，因此对HIV感染疾病进展的诊断也可能有相应的作用。与HIV感染相关的miRNA种类较多且作用不一，已有研究表明在HIV感染后miRNA普遍下调，miR-17/92基因簇可抑制HIV感染等。虽然已在该领域进行了ー些研究，但是HIV感染早期疾病快速进展者的miRNA表达变化目前还没有研究，在临床和研究中，需寻找可有效预测疾病预后的miRNA标志物。
发明内容
本发明提供了一种新的HIV感染疾病进展相关的miRNA作为疾病进展的分子标志物，该 miRNA 为 miR-200c，其序列为 5’-UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA-3’ (SEQ ID NO: I)。发明人发现，miR-200c在HIV感染早期(120天)快速进展者外周血单个核细胞中的含量相比典型进展者明显降低，可以预测感染一年后疾病进展情况，由此可见，降低的miR-200c与HIV感染疾病进展及预后密切相关。在上述发现的基础上，本发明提供了 miR-200c在制备诊断HIV感染疾病进展的诊断试剂中的用途。具体地，所述诊断试剂通过检测被试者外周血单个核细胞中miR_200c的含量，并与HIV感染典型进展者平均水平相比较来诊断HIV感染疾病进展，其中，miR-200c在HIV感染快速进展者外周血单个核细胞中的含量相对于典型进展者显著下降。在ー个特定的实施方案中，使用定量PCR的方法来检测被试者外周血单个核细胞中miR-200c含量。本发明还提供了一种诊断HIV感染疾病进展的诊断试剂盒，其包括(I)外周血单个核细胞总RNA提取试剂， (2) RNA 加 polyA 试剂，(3) RT-PCR 试剂，(4)定量 PCR 试剂。其中，定量PCR试剂中包括HIV感染疾病进展分子标志物miR-200c的特异性正向引物，优选地，其序列为 5’ -GTAATAGTGCCCGGTAA-3’ (SEQ ID NO :7)。在ー个特定的实施方案中，所述外周血单个核细胞总RNA提取试剂中包括序列为5，-CAACCTCCTAGAAAGA-3’ (SEQ ID NO :2)的 External Control-1 ;所述 RNA 加 polyA 试剂中包括序列为 5’-TGAGCAACGCGAACAA-3’ (SEQ ID NO :3)的 External Control-2 ;所述RT-PCR 试剂中包括序列为 5’ -CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’ (SEQ ID NO 4)的RT-Primer (其中，V为A或C或G，N为A或T或C或G);所述定量 PCR 试剂中包括序列分别为 5’ -CTCACACGACTCACGACAC-3’ (SEQ ID NO :5)和 5’ -CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3’ (SEQ ID NO :6)的通用反向引物 UPM-short 和UPM-long。使用本发明的HIV感染疾病进展分子标志物miR-200c诊断HIV感染疾病进展具有操作简单，安全无创伤，高特异性，高灵敏性以及易于大量筛查的特点。
具体实施例方式I.外周血单个核细胞中总RNA的提取抽取11名HIV感染快速进展者感染120天5ml血液，同时抽取6名HIV感染疾病典型进展者及4名正常人对照血液各5ml作为对照，密度梯度离心法收集外周血单个核细胞,用PBSlml重悬细胞，置于I. 5ml的RNase/DNase-free离心管中。使用RNA提取试剂盒(北京旷博生物技术有限公司)自外周血单个核细胞中提取总RNA,每250 ii I外周血单个核细胞中加入I U I (20nM)序列为5’-CAACCTCCTAGAAAGA-3’(SEQ ID NO :2)的External Control-I (上海生エ生物工程技术有限公司合成)来监控外周血单个核细胞中RNA的提取质量。提取的总RNA使用Thermo NanoDrop2000c测定浓度。2.三步法定量检测外周血单个核细胞中的miRNA(I)加 polyA 尾:i.在无RNA酶的PCR管(Axygen公司，200 ii I)中配制加polyA尾的反应液，体系为 20 ii I。姆 20 ii I 体系中加入 I U I (20nM)序列为 5’ -TGAGCAACGCGAACAA-3’ (SEQ IDNO 3)的External Control-2 (上海生エ生物工程技术有限公司合成)来监控miRNA的加
尾及反转录质量。
组分Ml入Ift(Iil)
External Co_i-2 (20nM)I
E.Coli polyA polymerase0.5
E.Coli polyA polymerase I O^Buffer2dATP (IOmM)2
UMAVS\iHI\A.
RNase - free water14-x
RNase Inhibitor0.5
—总律积_ 20 _(注加入的RNA体积由RNA的浓度确定，x=500ng/RNA浓度，本实验所使用的酶均为北京旷博生物技术有限公司的产品。)ii.将装有配置好反应液的PCR管放入PCR仪(Thermo)中37°C孵育I小时。(2 ) RT-PCR 得到 cDNA 单链i.向(I)得到的反应液中加入 0. 5u I (0. 5ng/iil)序列为 5，-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’ (SEQ ID NO :4)的 RT-Primer (上海生エ生物工程技术有限公司合成)，70°C孵育5min，立即放到冰上冰浴至少2min。ii.配制反转录反应液
纽分加入i'lt(pl)
M-MLV Reverse TranscriptaseI
M-MLV Reverse Transcriptase Sxbuffer8dNTP mix (IOmM)2
RNase InhibitorI
RNase-free water8
总休枳20(注所用产品均为北京旷博生物技术有限公司的产品。)iii.将i与ii得到的溶液混合，50°C孵育50min后70°C保温15min，置冰上冷却，得到cDNA。iv.将iii得到的产物稀释至I U I体系中含有Ing总RNA的反转录产物，分装后-20°C保存。(3)qPCR 定量检测i.在2ml EP管(Axygen公司)中配制反应液
权利要求
1.ー种HIV感染疾病进展分子标志物miR-200c，其序列如SEQ ID NO 1所示。
2.权利要求I所述HIV感染疾病进展分子标志物miR-200c在制备HIV感染预后的诊断试剂中的用途。
3.权利要求2所述用途，其中，所述诊断试剂通过检测被试者外周血单个核细胞中miR-200c的含量，并与HIV感染典型进展者平均水平相比较来判断HIV感染疾病进展。
4.权利要求3所述用途，其中，miR-200c在HIV感染快速进展者外周血单个核细胞中的含量相对于典型进展者显著下降。
5.权利要求3所述用途，其中，使用定量PCR的方法来检测被试者外周血单个核细胞中miR-200c 含量。
6.一种诊断HIV感染疾病进展的诊断试剂盒，其包括 (1)外周血单个核细胞总RNA提取试剂，(2)RNA 加 polyA 试剂，(3)RT-PCR 试剂， (4)定量PCR试剂； 其中，定量PCR试剂中包括权利要求I所述HIV感染疾病进展标志物miR-200c的特异性正向引物。
7.权利要求6所述诊断试剂盒，其中，所述外周血单个核细胞总RNA提取试剂中包括序列为 SEQ ID NO 2 的 External Control-I
8.权利要求6所述诊断试剂盒，其中，所述RNA加polyA试剂中包括序列为SEQID NO:3的 External Control-2。
9.权利要求6所述诊断试剂盒，其中，所述RT-PCR试剂中包括序列为SEQID NO :4的RT-Primer0
10.权利要求6所述诊断试剂盒，其中，所述定量PCR试剂中包括序列分别为SEQIDNO 5和6的通用反向引物UPM-short和UPM-long。
11.权利要求6所述诊断试剂盒，其中，所述HIV感染疾病进展分子标志物miR-200c的特异性正向引物的序列如SEQ ID NO 7所示。
全文摘要
本发明提供了一种HIV感染疾病进展分子标志物miR-200c，及其在制备HIV感染疾病进展诊断试剂中的用途。HIV感染快速进展者miR-200c在外周血单个核细胞中的含量比典型进展者外周血单个核细胞中的含量低，能够预测感染一年后疾病进展程度。本发明还提供了一种诊断HIV感染疾病进展的诊断试剂盒。使用本发明的HIV感染疾病进展分子标志物miR-200c诊断疾病进展具有操作简单，安全无创伤，高特异性，高灵敏性以及易于大量筛查的特点。
文档编号C12N15/113GK102839173SQ20121030584
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月24日 优先权日2012年8月24日
发明者尚红, 李启靖, 张子宁, 徐俊杰, 付雅静 申请人:中国医科大学附属第一医院, 北京旷博生物技术有限公司