专利名称：斑蝥类毒素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种药品原料的制备方法，尤其是一种斑蝥类毒素的制备方法。
背景技术：
一种致病性细菌所产生的特异性毒性物质一细菌毒素经脱毒处理而保留免疫原性，称之为类毒素。类毒素是一种自动免疫制剂，用于细菌毒素性疾病的预防及治疗。现常用生产类毒素的方法是选择培养基和菌种，菌种经人工培养后产生毒素，毒素脱毒后形成类毒素。目前非常成熟的类毒素有破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱类毒素等
女口
广叩ο CN101869704A公开了单剂免疫破伤风类毒素阳离子葡聚糖微球及其制备方法，其特征是由破伤风类毒素通过静电作用后载在阳离子甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖微球上制得；CN87104279公开了类毒素制备新方法，包括用一定量氧化剂处理至少部分分离的毒素以对所说毒素进行化学灭活，但同时保留其免疫性，此后从中获得灭活的毒素；CN1798548公开了基于含吸附类毒素或含多糖抗原微球体的免疫原性组合物，该发明是将类毒素抗原或含多糖的抗原吸附在微粒体上形成免疫原性组合物。斑蝥为芫青科昆虫南方大斑蝥或黄黑小斑蝥的干燥体，辛、热、有大毒，归肝、胃肾经，具有破结攻毒，除血积，利水道的功能，南方大斑蝥含斑蝥素1-1. 2%、脂肪油12%以及树月旨、蚁酸、黄黑小斑蝥含斑蝥素O. 97-1. 3%。人类用斑蝥治疗疾病已有二千多年的历史，由于斑蝥毒性较大，因此人们已合成各种斑蝥衍生物达一百多种。CN1966508公开了一种提取斑蝥素的方法，包括冷浸、浓缩、纯化等工艺过程。CN1023367565A公开了从斑蝥中提取斑蝥素的方法，用丙酮浸提，浓缩液冷却结晶，二次溶解冷却析晶。CN101948528A公开了一种来自斑蝥的纤溶活性蛋白及其制备方法和应用，从斑蝥中提取一种具有纤溶活性的单一组分蛋白。CN101633661公开了制备斑蝥酸钠的工艺，由斑蝥虫体提取斑蝥素并合成斑蝥酸钠。CN1868471公开了一种甲基斑蝥胺注射制剂及其制备方法，在甲基斑蝥胺中添加磷脂、环糊精、聚乙烯吡咯烷酮、尿素等助剂增加甲基斑蝥胺的水溶性。传统炮制的目的是为了减轻其毒性，常用湿米贴锅炒斑蝥或清炒两种炮制方法加热使得斑蝥有效成份损失较多，如何充分利用斑蝥这一种药材资源是国内外药界长期研究的课题。
发明内容
鉴于斑蝥作为药材时具有毒副作用，本发明提供一种斑蝥类毒素的制备方法。本发明的目的是通过以下技术案实现的1、以斑蝥为原料，经粉碎处理后加入蛋白酶进行酶解反应；2、分离机固液分离；3、脱毒；4、化学法或物理法灭活；5、微滤过滤除杂及超滤法浓缩；6、超声驻波液相制备色谱纯化；7、稳定化处理。具体步骤如下
(O以斑蝥为原料，经粉碎处理后加入蛋白酶进行酶解反应；
(2)用分离机以3000-15000r/min分离上述酶解液；
(3)调节收集液体pH=5.8-8. O，控制温度25-45°C，加H2O2溶液或甲醛进行脱毒处理，成为斑蝥类毒素粗品液相；
(4)斑蝥类毒素粗品液相采用化学法或物理法进行灭活处理；
(5)用膜孔径O.2-5 μ m微孔过滤机过滤，并且用膜孔径IO-IOOnm超滤机超滤处理，收集超滤液；
(6)超滤液溶于溶剂体系中，泵入超声驻波液相制备色谱中连续分离纯化，超声驻波频·率2450-5000kHz，声强O. 2-1. 5kw，流量O. 2-1. OL/min，紫外分光光度检测器波长260nm ；
(7)稳定化处理分离纯化斑蝥类毒素中加入稳定剂，在20-30°C条件下吸附10-24h，成为稳定性斑蝥类毒素。斑蝥素化学名称为外-1，2-顺-二甲基-3，6-氧桥-六氢化邻苯二甲酸酐，有剧毒，小鼠急性毒性实验表明，斑蝥素的LD50为I. 25mg/kg,经去毒处理后LD50为82mg/kg。本发明制备的斑蝥类毒素是以中药材斑蝥或斑蝥干为原料制备的一种类毒素，其相对分子量为37 X IO4Da,制品振摇后为乳黄色均匀悬浮液，pH=6. 6-7. 4，氢氧化铝含量少于2. 5mg/mL，游离甲醛含量小于O. 02% (g/mL)。本发明的制备过程不涉及传统类毒素生产的菌种和培养基筛选，生产工艺简单，节能、无环境污染，工艺过程易于控制，制备的斑蝥类毒素成分明确，成本较低，适合工业化生产。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的描述。实施例I :
(1)选用新鲜中药材斑蝥放入绞肉机绞碎斑蝥机体，用高压匀浆破碎法进一步破碎机体，调节压力IOOOOOkpa,流速至70cm/ml,重复破碎2_5次，以离心机1250_3000r/min固液分离，收集液相；
(2)收集液相IOOOml加入2000-10000ml纯净水混合均匀后加入O.5-10g胃蛋白酶，保持温度20-50°C，酶解6-48h ；
(3)用分离机以3000-15000r/min分离上述酶解液，收集液体用O.2mol/LNa2HPO4-O. 2moI/LNaH2PO4 组成的缓冲液调节 pH=5. 8-8. O,控制温度 25-45 V，加IO-IOOgH2O2溶液脱毒处理15-45d,成为斑蝥类毒素粗品液相；
(4)IL斑蝥类毒素粗品液相置于微波炉中，在功率O. 5-2kw加热I-IOmin进行灭活；
(5)将IOOml斑蝥类毒素粗品液相加入O.2mol/LNa2C03-0. 2moI/LNaHCO3缓冲溶液调pH=8-12，再加入50-100gNa2S04& 20-200g活性白土，在10-30°C条件下生成沉淀并放置10-24h ；
(6)上述物料用膜孔径O.2-5 μ m微孔过滤机过滤，并且用膜孔径IO-IOOnm超滤机超滤处理，收集超滤液；
(7)收集的IL超滤液溶于2-10L由甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水按照2:2:1:6的体积比组成的溶剂体系中，其中有机相中加入10-30mmol/L的三氟乙酸，水相中加入I-5mmo I/L氨水，泵入超声驻波液相制备色谱中，超声驻波频率2450-5000kHz，声强O. 2-1. 5kw，流量O. 2-1. OL/min，紫外分光光度检测器波长260nm，连续分离纯化；
(8)分离纯化斑蝥类毒素1000L加入200-1000L含量为5_20g/L Al (OH)3溶液中，在20-30°C条件下吸附10-24h，成为稳定性斑蝥类毒素。实施例2:
(1)IOOOg斑蝥干品用粉碎机以275-500r/min连续粉碎，并用100-200目筛子筛选，收集粉末；
(2)将IOOOg粉末放入微波炉中以功率O.5-2kw，加热10-20min杀菌处理，然后自然冷却至 25-30 0C ； (3)上述杀菌处理后斑蝥干品粉末加入1-10L纯净水混合均匀后，加入I.5-50g胰蛋白酶，保持温度25-50°C，酶解5-48h ；
(4)用分离机以3000-15000r/min分离上述酶解物，收集的液体用O.2mol/LNa2CO3-O. 2 mo I/LNaHCO3组成的缓冲溶液调pH=5. 8-8，控制温度25_45°C，加IO-IOOg甲醛脱毒处理30-45d,成为斑蝥类毒素粗品；
(5)IOOOml斑蝥类毒素粗品用10000-15000高斯磁感强度处理2_5min，处理3_5次灭
活；
(6)将IKg斑蝥类霉素粗品加入氨水调整pH=7-9，加入100-300g(NH4) 2S04及150-500g沸石，常温条件下生成沉淀并吸10_24h ；
(7)上述脱毒液用膜孔径O.2-10 μ m微滤机过滤再用膜孔径IO-IOOnm超滤机超滤浓缩，收集浓缩液；
(8)IL浓缩液溶于2-10L由甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水按照2:2:1:6的体积比组成的溶剂体系中，其中有机相中加入10-30mmol/L三氟乙酸，水相中加入l_5mmol/L氨水，泵入超声驻波液相制备色谱中，超声驻波频率2450-5000kHz，声强O. 2-1. 5kw，流量O. 5-1. OL/min,紫外分光光度检测器波长260nm，连续分离纯化；
(9)分离纯化的IL斑蝥类毒素加入20.0-50. OL含量为10_20g/LCa3 (PO4)2溶液中，在20-30°C条件下吸附10-24h，成为稳定性斑蝥类毒素。
权利要求
1.斑蝥类毒素的制备方法，其特征在于所述制备方法如下 (1)以斑蝥为原料，经粉碎处理后加入蛋白酶进行酶解反应； (2)用分离机以3000-15000r/min分离上述酶解液； (3)收集液体进行脱毒处理，成为斑蝥类毒素粗品液相，控制pH=5.8-8. O，温度25-45 0C ； (4)斑蝥类毒素粗品液相采用化学法或物理法进行灭活处理； (5)用膜孔径0.2-5 u m微孔过滤机过滤，并且用膜孔径IO-IOOnm超滤机超滤处理，收集超滤液； (6)超滤液溶于溶剂体系中，泵入超声驻波液相制备色谱中连续分离纯化，超声驻波频率2450-5000kHz，声强0. 2-1. 5kw，流量0. 2-1. OL/min，紫外分光光度检测器波长260nm ； (7)稳定化处理分离纯化斑蝥类毒素中加入稳定剂，在20-30°C条件下吸附10-24h，成为稳定性斑蝥类毒素。
2.根据权利要求I所述的斑蝥类毒素的制备方法，其特征在于所述蛋白酶为胃蛋白酶或膜蛋白酶。
3.根据权利要求I所述的斑蝥类毒素的制备方法，其特征在于所述溶剂体系由甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水按照2:2:1:6的体积比组成。
4.根据权利要求3所述的斑蝥类毒素的制备方法，其特征在于所述溶剂体系的有机相中加入10_30mmol/L三氟乙酸,水相中加入l_5mmol/L氨水。
5.根据权利要求I所述的斑蝥类毒素的制备方法，其特征在于所述稳定剂为Al(OH)3溶液或Ca3 (PO4)2溶液。
全文摘要
斑蝥类毒素的制备方法，涉及一种药品原料的制备方法。鉴于斑蝥作为药材时具有毒副作用，本发明的斑蝥类毒素的制备方法是通过以下技术案实现的1、以斑蝥为原料，经粉碎处理后酶解；2、分离机固液分离；3、脱毒；4、化学法或物理法灭活；5、微滤过滤除杂及超滤法浓缩；6、超声驻波液相制备色谱纯化；7、稳定化处理。本发明制备的斑蝥类毒素是以中药材斑蝥或斑蝥干为原料制备的一种类毒素，制备过程不涉及传统类毒素生产的菌种和培养基筛选，生产工艺简单，节能、无环境污染，工艺过程易于控制，制备的斑蝥类毒素成分明确，成本较低，适合工业化生产。
文档编号C12P21/06GK102796794SQ20121031586
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者徐华民, 赵荣华, 赵艳琨, 徐萌 申请人:哈尔滨工业大学