一株生产己二酸前体物顺,顺-粘康酸的大肠埃希氏菌及应用的制作方法
【专利摘要】顺，顺-粘康酸是一种重要的化工有机酸，该产品具有广泛的用途，可以作为己二酸的前体物。把顺，顺-粘康酸氢化转化为己二酸就可以用于生产尼龙66等聚合物。本发明利用组合代谢工程的方法，把不同微生物来源、经过密码子优化的3-脱氢莽草酸脱水酶，原儿茶酸脱羧酶、儿茶酚1，2-双氧化酶以及人工设计的组成型启动子和终止子组合成异源表达模块，并导入莽草酸脱氢酶突变的大肠埃希氏菌中构建了一株生产顺，顺-粘康酸的重组大肠埃希氏菌(Escherichia?coli)TIB-LEc340?CGMCC?No?6435。大肠埃希氏菌(Escherichia?coli)TIB-LEc340CGMCC?No?6435在30℃-40℃发酵16小时-120小时，得到的发酵液中顺，顺-粘康酸粘康酸的含量最高可达52g/L，具有广泛的应用前景。
【专利说明】—株生产己二酸前体物顺，顺-粘康酸的大肠埃希氏菌及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及到生产己二酸前体物顺，顺-粘康酸的代谢工程菌,大肠埃希氏菌(Escherichia coli) TIB-LEc340 CGMCC No 6435和利用该菌发酵生产顺，顺-粘康酸的方法。
【背景技术】
[0002]己二酸(Adipic acid)是六碳二元酸，具有脂肪族二元酸的通性，能发生成盐反应、酯化反应、酰胺反应，能与二元胺缩合成高分子聚合物，是生产己二胺、尼龙66、纤维和工程塑料及其树脂的重要工业基础原料(van Duuren JB, Brehmer B, Mars AE, Eggink G,Dos Santos VA, Sanders JP.A limited LCA of bio—adipic acid !Manufacturing thenylon-6,6 precursor adipic acid using the benzoic acid degradation pathway fromdifferent feedstocks.Biotechnol Bioeng.2011 108(6):1298-306) ?统计表明，全球己二酸消耗量超过300万吨，其中尼龙66纤维占37%，尼龙66树脂占25%，聚氨酯占25%。我国的消耗量超过了 50万吨。我国的己二酸需求量每年都在增长，聚氨酯生产企业的需求量每年增长在10%以上。
[0003]当前己二酸的生产主要是以环己烷为原料的硝酸氧化法，占全球生产能力的90%以上。该法中硝酸的使用严重腐蚀设备，而且产生的副产物氮氧化物被认为是引起全球变暧和臭氧减少的原因之一，给环境造成了极大的污染。因此，研究开发新的清洁无害己二酸生产工艺越来越受到人们的重视。微生物转化生产己二酸有几十年的研究经历，不动杆菌、短杆菌、假单胞菌和黄色杆菌等属微生物可以转化苯甲酸、儿荼酚、环己醇、环己烷等化合物生产己二酸(Cheng Q, Thomas SMiKostichka K，Valentine JRiNagarajan V.Geneticanalysis of a gene cluster for cyclohexanol oxidation in Acinetobactersp.strain SE19 by in vitro transosition.J Bacteriol.2000 182(17):4744-4751.)，这些生物转化不需要化学催化剂、氧化剂以及溶剂，是洁净无害的生产工艺。但是微生物的转化生广能力和效率有待进一步提1?。
[0004]然而，化学法和微生物转化法生产己二酸所需的苯类原料需要来自于石油资源，是不可再生的。因此利用可再生的生物质资源代替石油资源来生产己二酸是可持续发展的需要。近年来，随着工业生物技术的快速进步，特别是基因合成与遗传改造、代谢工程与合成生物学以及系统生物学等的快速进步发展(Keasling JD.Manufacturingmolecules through metabolic engineering.Science.2010330(6009):1355-8;Na D， Kim TY, Lee SY.Construction and optimization of synthetic pathways inmetabolic engineering.Curr Opin Microbiol.201013 (3):363-70 ;Dhamankar H，Prather KL.Microbial chemical factories:recent advances in pathway engineeringfor synthesis of value added chemicals.Curr Opin Struct Biol.2011 21(4):488-94 ；Du J，Shao Z，Zhao H.Engineering microbial factories for synthesis ofvalue-added products.J Ind Microbiol Biotechnol.201138(8):873-90)，设计、合成生产己二酸及其前体化合物的实用人工细胞工厂，从可再生的生物质资源生物制造己二酸引起了人们的极大关注(Burgard AP，Pharkya Osterhout RE.Microorganismsfor the production of adipic acid and other compounds.US Patent US7799545B2 ；Fruchey OS，Manzer LE, Dunuwila D，Keen BT, Albin BA，Clinton NA，DombekBD.Processes for producing adipic acid from fermentation broths containingdiammonium adipate.US Patent Application Publication，US 2011/0269993A1 ；BurgardAP, Pharkya Osterhout RE.Microorganisms and methods for the biosynthesis ofadipate, hexamethylenediamine and 6-aminocaproic acid..US Patent ApplicationPublication，US2010/0317069A1 ；Wu L, Trefzer AC，de Wilddeman S，van den Berg,B.Adipate ester or thioester synthesis.W0/2009/113853.)。
[0005]美国密歇根州立大学John Frost研究组通过来源于不同的微生物的3-脱氢莽草酸脱水酶(3-dehydroshikimate dehydratase，AroZ)，原儿荼酸脱羧酶(Protocatechuatedecarboxylase，AroY)和儿荼酌I，2_双氧化酶(Catechol-1，2-dioxygenase，CatA)组成的异源合成途径。把异源合成途径转入大肠埃希氏菌后催化3-脱氢莽草酸转化为顺，顺-粘康酸，初步打通了从来源于可再生资源的葡萄糖到顺，顺-粘康酸的生化合成通道(FrostJW, Draths KM.Synthesis of adipic acid from biomass-derived carbon sources.USPatent 5487987，1996 ;Niu W,Draths KM,Frost JW.Benzene-free synthesis of adipicacid.Biotech Prog.2002 18:201-212.)。发酵液中的顺，顺-粘康酸可以以钼为催化剂、在低压室温下化学氢化转化为己二酸，该步转化率在95%以上(Niu W，Draths KM，FrostJW.Benzene-free synthesis of adipic acid.Biotech Prog.2002 18:201-212 ;ThomasJM,Raja R，Johnson BF,Or Connell TJ,Sankar GiKhimyak T.Bimetallic nanocatalystsfor the conversion of muconic acid to adipic acid.Chem Commun(Camb).2003(10):1126-7.)。然而John Frost等人开发己二酸生物合成途径需要添加昂贵的诱导剂异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)来进行顺，顺-粘康酸生产。IPTG的使用会从而增加过程费用，限制将来的大规模工业化生产。
[0006]对于己二酸等大宗化学品而言，由于价值相对不高，提高合成和生产效率是影响其生产成本降低、产业开发的根本前提。由于顺，顺-粘康酸到己二酸的转化过程非常容易实现，而且转化效率高、成本较低。因此要通过顺，顺-粘康酸实现的己二酸生产，关键是怎样有效提高葡萄糖到顺，顺-粘康酸的产量和产率。根据合成途径的碳流量分析表明，I摩尔葡萄糖在理论上可以生产出0.75摩尔的顺，顺-粘康酸，即理论糖酸转化率为0.60g/g。目前报道最高转化率只有理论转化率的33 %，其他原料葡萄糖由于异源合成途径的代谢不平衡、乙酸等副产物积累、能量代谢以及分支途径的分流等原因而被损失浪费掉了。所以必须消除这些碳硫(carbon flow)的损失,引导更多的碳硫流向目标产物合成的方向,提高产物的产率(转化率)。另外，在细胞内代谢途径往往不是独立的，而是存在于复杂的代谢网络中，受到各种各样的调控，影响着目标产物的过量积累。为了使细胞工厂能够定向、高效地积累人们所需要的目标生物产品和生物过程，就必须去干扰、改变或修饰细胞原有的调控体系，提高目标产物的产量。针对以上问题，为了提高己二酸及其前体化合物的(生物)合成能力和效率，必须从代谢调控与细胞代谢网络优化的关键科学问题出发，深入发掘和研究各种重要影响因素，通过优化改造提高目标产品的生产效率。
[0007]己二酸及其前体物的生物制造将具有污染少、产品质量高等优点，极具发展前景。但是高效、经济性地实现己二酸及其前体物的生物制造，仍然有一系列的关键技术，其中高性能生产菌株的选育改造是实现己二酸及其前体物生物制造的核心，其他包括发酵工艺的优化和产物的绿色分离纯化等也需要进一步的研究和开发。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一株能够生产己二酸前体物顺，顺-粘康酸的大肠埃希氏菌和发酵法生产顺，顺-粘康酸的方法及应用。
[0009]本发明所提供的顺,顺-粘康酸生产酵母菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TIB-LEc340已于2012年8月16日藏保于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC)，保藏号为 CGMCC No 6435。
[0010]利用组合代谢工程策略引入由来自不同微生物的3-脱氢莽草酸脱水酶，原儿茶酸脱羧酶和儿茶酚I，2-双氧化酶组成的异源代谢途径催化芳香族氨基酸合成途径的中间产物3-脱氢莽草酸经原儿茶酸、儿茶酚转化为顺，顺-粘康酸，把合成途径转入莽草酸脱氢酶(AroE)突变、芳香族氨基酸合成途径阻断的大肠埃希氏菌AB2834 (Escherichia coliAB2834)中，构建了能从葡萄糖生产顺，顺-粘康酸大肠埃希氏菌。
[0011]本发明的另一个目的提供了一种发酵生产己二酸前体物-顺，顺-粘康酸的方法。
[0012]本发明所提供的生产顺,顺-粘康酸的方法,是发酵大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB-LEc340 CGMCC No 6435 得到顺，顺-粘康酸。
[0013]利用大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 生产顺，顺-粘康酸的培养基，包括碳源、氮源和无机盐。所述碳源可为质量百分含量1-20%的葡萄糖和/或蔗糖和/或淀粉和/或糖蜜和/或生物质水解糖液；所述氮源可为质量百分含量为0.1% -3%的玉米浆和/或牛肉膏和/或酵母提取物和/或蛋白胨和/或豆柏和/或豆饼粉和/或花生柏和/或铵盐和/或硝酸盐和/或尿素；所述无机盐包括质量百分含量^ 0.1% -0.8% Na2HPO4,0.05-0.5% KH2PO4,0.01% -0.1% NaCl, 0.005% -0.1 % MgSO4 和
0.005-0.05% CaCl20为了提高顺，顺-粘康酸的产量，所述培养基中还含有质量百分含量为0.001-0.008%的莽草酸。
[0014]本发明的发酵大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 在30°C _40°C发酵16小时-120小时，得到的发酵液中顺，顺-粘康酸粘康酸的含量最高可达52g/L，具有广泛的应用前景。
[0015]具体实施
[0016]以下为列举的实施例，以便于更好地理解本发明。
[0017]实施例1 3-脱氢莽草酸脱水酶基因，原儿茶酸脱羧酶基因和儿茶酚1，2_双氧化酶基因的优化设计合成
[0018]分别根据Klebsiella pneumoniae A170-40的3_脱氢莽草酸脱水酶基因aroZ、原儿茶酸脱羧酶基因aroY和Acinetobacter calcoaceticus的儿茶酌.1，2_双氧化酶基因catA的序列，通过密码子优化获得适合大肠埃希氏菌密码子偏好性的新基因aroZ-jCat，aroY-jCat和catA-jCat (附图1-3)，然后利用DNA化学合成的方法获得这些设计优化的基因，可用于异源合成途径的创建。
[0019]实施例2 3-脱氢莽草酸脱水酶，原儿茶酸脱羧酶和儿茶酚1，2-双氧化酶组成的异源表达模块组装
[0020]通过合适的限制性内切酶，把人工设计合成的组成型启动子P3 (TCTAGAATATGTTATCTCTGGCGGTGTTGACATTTCCGTTTTTTCATGATATAATCGCTCCTGAGCGGATAACAATTTCAAGGAGGACAGCTCCATCAT)、上述设计合成的新基因aroZ-jCat, aroY-jCat和catA-jCat以及人工设计合成的终止子 T1(CCGGCTTATCGGTCAGTTTCACCTGAITTACGTAAAAACCCGCTTCGGCGGGITITTGCTITTGGAGGGGCAGAAAGATGAATGACTGTCCACGACGCTATACCCAAAAGAAA)连接起来组成的异源表达模块CCMA。P3，aroZ-jCat，aroY-jCat，catA-jCat 和 Tl 之间的限制性内切酶分别是 Ndel，SacI，NheI，XhoI。另外分别在aroY-jCat和catA-jCat基因的起始密码子ATG前加入RBS结合区(AAGAAGGAGATATAGTA)。CCMA模块的示意图和序列分别见附图4和5。
[0021]实施例3 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 的构建
[0022]将上述构建3-脱氢莽草酸脱水酶，原儿茶酸脱羧酶和儿茶酚1，2_双氧化酶异源表达模块CCMA的DNA序列两端分别加上ClaI和SalI限制性酶切位点，然后把该DNA片段插入质粒PACYC184的相应位点，得到重组质粒pACYC-CCMA(附图6)。然后把重组质粒pACYC-CCMA转入莽草酸脱氢酶(AroE)突变的大肠埃希氏菌AB2834(Escherichia coliAB2834)中，获得目标菌种大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TIB-LEc340 CGMCC No 6435。
[0023]实施例4 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 摇瓶发酵生产顺，顺-粘康酸
[0024]大肠埃希氏菌( Escherichiacoli) TIB_LEc340 CGMCC No 6435 接种装有 25mL 发酵培养基的500mL摇瓶中，该培养基的pH为7.0，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖2%，NH4Cl 0.5%,NaCl 0.1%,Na2HPO4 0.3%,KH2PO4 0.1%,MgSO4.7Η20 0.05%,CaCl 0.01%,莽草酸0.004%。在37°C、220r/min的摇床发酵24小时后，离心分离菌体，按常规方法测定上清液中含有顺，顺-粘康酸为1.5g/l。
[0025]实施例5 大肠埃希氏菌(Escherichia coli) TIB-LEc340 CGMCC No 6435 的 5L发酵罐发酵生产顺，顺-粘康酸
[0026]大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 接种装有 500mL种子培养基的500mL摇瓶中，该培养基的pH为7.0，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖2%，蛋白胨l%，NaCl 0.5%，在37°C、220r/min的摇床培养16小时后，把500mL培养液接种有5000mL发酵培养基7.5L发酵罐(NBS BioFlo?115)中，该培养基含有下述质量百分比的组分:葡萄糖 15%，NH4Cl 1.5%, NaCl 0.5%, Na2HPO4 0.3%, KH2PO4 0.1%, MgSO4.7H20
0.05%, CaCl 0.01%，莽草酸0.006%。，通过5M的NaOH实时控制pH为7左右。在35°C，通气量为1:1的条件下发酵84小时后，离心分离菌体，按常规方法测定上清液中含有丙酮酸为52g/l。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]附图1:根据Klebsiella pneumoniae A170-40的3_脱氢莽草酸脱水酶基因密码子优化的新基因aroZ-jCat序列
[0028]附图2:根据Klebsiella pneumoniae A170-40的原儿茶酸脱羧酶基因密码子优化的新基因aroY-jCat序列
[0029]附图3:根据Acinetobacter calcoaceticus的儿茶酌.I, 2_双氧化酶基因密码子优化的新基因catA-jCat序列
[0030]附图4:3_脱氢莽草酸脱水酶，原儿茶酸脱羧酶和儿茶酚1，2-双氧化酶组成的异源表达模块CCMA示意图
[0031]附图5:3_脱氢莽草酸脱水酶，原儿茶酸脱羧酶和儿茶酚1，2-双氧化酶组成的异源表达模块CCMA序列
[0032]附图6:重组质粒pAC`YC-CCMA图谱
【权利要求】
1.一株能够发酵生产顺，顺-粘康酸的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TIB_LEc340CGMCC No 6435。
2.根据权利I要求，菌的含有经过密码子优化的附图3-脱氢莽草酸脱水酶基因aroZ-jCat，原儿茶酸脱羧酶基因aroY-jCat和儿茶酚1，2_双氧化酶基因catA-jCat及人工设计的组成型启动子P3和终止子Tl。
3.根据权利I要求，菌的生长及发酵生产的培养基包括碳源、氮源、无机盐和莽草酸，pH6.5-7.5。
4.根据权利要求3所述，其特征在于:所述碳源为质量百分含量为1%-20%的葡萄糖和/或蔗糖和/或淀粉和/或糖蜜和/或生物质水解糖液。
5.根据权利要求3所述，其特征在于:所述氮源为质量百分含量为0.1% -3%的玉米浆和/或牛肉膏和/或酵母提取物和/或蛋白胨和/或豆柏和/或豆饼粉和/或花生柏和/或铵盐和/或硝酸盐和/或尿素。
6.根据权利要求3所述，其特征在于:所述无机盐包括质量百分含量为0.1% -0.8%的 Na2HPO4 和 / 或 0.05-0.5 % 的 KH2PO4 和 / 或 0.01 % -0.1 % 的 NaCl 和 / 或 0.005 % -0.1%的 MgSO4 和 / 或 0.005-0.05% 的 CaCl2。
7.根据权利要求3所述，其特征在于:所述莽草酸添加的范围是质量百分含量0.001% -0.008%。
8.根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述,其特征在于:大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB-LEc340 CGMCC No 6435 的生长和发酵温度为 30_40°C。
9.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述,其特征在于:大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB-LEc340 CGMCC No 6435 的发酵时间为 16 小时-120 小时。
10.根据权利要求1所述的菌株在顺，顺-粘康酸生产中的应用。
11.根据权利要求2、3、4、5、6、7、8或9所述的配方和方法在大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 顺，顺-粘康酸的生产中的应用。
【文档编号】C12R1/19GK103667166SQ201210362308
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月21日 优先权日:2012年9月21日
【发明者】王钦宏, 吴元庆, 陈五九, 张媛媛, 彭彦峰, 元飞, 马延和 申请人:天津工业生物技术研究所