一种利用木质纤维素原料高温同步糖化发酵生产乙醇的新工艺的制作方法
【专利摘要】乙醇是一种洁净、可再生、生产过程不净排放碳的交通燃料，是目前使用量最大的生物运输燃料。本发明涉及一种利用木质纤维素原料在高温高固形物含量情况下同步酶解糖化发酵生产乙醇工艺。木质纤维素原料经过预处理之后，利用纤维素酶和耐温酿酒酵母(TIB-S.C?Y01)进行高温同步糖化发酵，通过合理分批补料提高底物浓度，提高乙醇产量，使其达到经济的蒸馏浓度。实验利用不同原料进行高温同步糖化发酵，乙醇产量在5-10％(v/v)。利用耐温酿酒酵母进行高温同步糖化发酵，为木质纤维素原料高温同步糖化发酵奠定基础。
【专利说明】—种利用木质纤维素原料高温同步糖化发酵生产乙醇的新工艺
【技术领域】
[0001]本发明属于工业生产乙醇生物【技术领域】，特别涉及一种利用木质纤维素原料在高温、高固形物含量底物条件下的同步酶解糖化发酵生产乙醇工艺。
【背景技术】
[0002]当今传统化石能源的供给日益紧张，以及人类对使用传统化石能源所造成的严重环境污染有了充分认识的情况下，纤维质燃料乙醇作为一种新型的、可再生清洁能源越来越受到世人的重视。中国是一个农业大国，各类农作物纤维资源十分丰富，仅秸杆一项就达7.0X10nkg以上，其中玉米秸杆约2.2X10nkg，这些资源长期没有得到合理的开发利用。如果将它们转化成气体或液体燃料，这样不但缓解人类所面临的资源危机，食物短缺，环境污染等一系列问题，也为人类持续发展提供了保证。
[0003]目前，国内多数的燃料乙醇生产线，主要采用分步糖化发酵的生产工艺，进行燃料乙醇的生产。然而与分步糖化发酵相比，同步糖化发酵有很多优点:1)可以促进反应动力学过程，减少酶解产物对酶的反馈抑制；2)葡萄糖生成与消耗几乎同时进行，增加了发酵产率；3)糖化与发酵在一个反应器中进行，减少了设备投资；4)由于同时糖化发酵可以缩短反应时间等。1977年，Takgt首次报道了同步糖化发酵法。他将里氏木霉产生的纤维素酶和酿酒酵母放在一个容器里，创造了边糖化边发酵的所谓同步糖化发酵法(simultaneoussaccharification and fermentation, SSF),俗称一步法。在同一容器中，加入纤维素材料、纤维素酶和酵母等乙醇生产菌，使纤维素糖化产生的葡萄糖、纤维二糖和各种寡糖分子在第一时间被发酵成乙醇。SSF法中常用的微生物是霉菌和酿酒酵母，主要特点是纤维素的糖化和糖的发酵在同一装置内同时进行。
[0004]由于糖化和发酵可在同一反应器里进行，SSF节省了设备投资，反应时间可缩短一半，大幅度减少了纤维素的酶解成本。与纤维素糖化和乙醇发酵相继进行的两步法相比，SSF过程中，水解终产物一葡萄糖不断被`乙醇生产菌利用，生成与消失几乎同步，消除了葡萄糖浓度的增加对纤维素酶的反馈抑制作用，增加了乙醇的发酵产率。乙醇的存在和PH值降低使发酵过程污染杂菌的可能性减少。而葡萄糖苷酶及时降解反馈抑制纤维素酶活的纤维二糖，减轻了酶解中间产物对酶活性发挥的抑制，促进了酶促反应的动力学过程。
[0005]同步糖化发酵虽然被认为是纤维素乙醇转化最有效的途径，可以使抑制纤维素酶的水解产物——葡萄糖和纤维二糖的积累降到最低。但常用作工业生产的纤维素酶生产菌的β -葡萄糖苷酶在酶系中含量相对较低，而发酵体系中水解的中间产物一纤维二糖只能通过β_葡萄糖苷酶来降解，因此发酵液中的纤维二糖不能得到完全的降解。作为纤维素酶的竞争性抑制物，纤维二糖的利用或减少就成为提高酶解效率的重要环节。
[0006]同步糖化发酵的效率通常以乙醇产量来表示。由于发酵中存在多种影响因素，乙醇浓度受到多方面的影响。其中，发酵温度、底物浓度和酶液浓度是影响较大的因素。纤维素酶解与酵母糖化同时进行，最为突出的是两者的温度不协调。在SSF过程中，表现纤维素酶的最佳温度为45~50°C，而乙醇发酵的最佳温度为20~40°C。折衷两者的最佳温度得到的温度既不最适合发酵、也不最适合水解。美国可再生能量研究所的1.Ballesteros等人选用耐热酵母对提高SSF过程的转化率进行了研究，但由于酵母产酒能力较差而无法应用到实际生产中。在工业生产中，发酵的乙醇达到5%为比较经济的蒸馏浓度，要达到这个浓度最可简单的办法是提高底物浓度和酶液浓度。理论上，底物浓度和酶液浓度直接影响底物糖化后的总糖量，进而影响酵母的生长。由于纤维素材料在预处理过程中，会产生糠醛、羟甲基糠醛等一系列酵母生长的抑制物，因而底物浓度的一味提高会影响工业酵母的生长，继而降低乙醇发酵浓度。而高剂量纤维素酶的使用会直接增加乙醇的生产成本。适宜的底物浓度和酶液浓度是同步糖化发酵体系里基础的工艺标准。
[0007]为了克服上述缺点，我们经过适应性进化改造工业酿酒酵母，提高菌种的发酵温度以及对乙酸、糠醛、羟甲基糠醛等一系列酵母生长的抑制物的耐受性，为木质纤维素原料高温同步糖化发酵奠定基础。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种利用木质纤维素原料在高温、高固形物含量情况下同步酶解糖化发酵生产乙醇的工艺，本发明所用菌种为耐高温生产乙醇酵母菌，酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae) TIB-S.C YOl已于2011年12月30日藏保于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No5679。
[0009]为达到上述发明目的本发明所采用的技术方案是:
[0010]—种利用木质纤维素原料高温同步酶解糖化发酵(high temperature SSF,ΗΤ-SSF)生产乙醇的工艺，包括如下步骤:
[0011]I)培养种子，其中又包括下述步骤:
[0012](I)配置培养基:在250mL三角瓶中，盛放50mL的YH)培养基，在1000mL三角瓶中，盛放250mL的YPD培养基，成分包括葡萄糖2%，蛋白胨2%，牛肉膏1%，pH为5.5，121°C，灭菌 20min。
[0013](2)种子活化:将耐温酿酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679从_80°C中拿出转接到有50mL —级种子培养基的250mL三角瓶中，40°C、200r/min的摇床培养24小时后。
[0014](3)种子培养:将活化的酵母菌转接IOml到含有250ml的种子培养基的1000mL三角瓶中，共准备4个1000mL三角瓶，共1000mL的种子培养基，在40°C、200r/min的摇床培养16小时后，加入到发酵罐中进行同步糖化酶解发酵。
[0015]2)发酵消毒，其中又包括下述步骤:
[0016](I)准备发酵罐:将发酵罐罐内清理干净，并将pH电极、溶氧电极等安装。
[0017](2)灭菌消毒:将发酵罐内注入水至浸没电极之后进行灭菌，110°C，0.1lOMpa灭菌20min之后冷却并将罐内水放掉。
[0018]3) HT-SSF过程，包括下述步骤:
[0019](I)计算物料含水量:将一定质量的物料盛放在玻璃平皿中，在85°C条件下烘干至恒重之后冷却，称其质量并计算含水量。
[0020](2)物料液化:将12%物料加入到发酵罐中，并加入对应的水和纤维素酶，温度40°C，转速lOOrpm，罐压0.005Mpa，通气10L/min条件下液化12小时。[0021](3)加入菌种:12小时时，将菌种接入到发酵罐中，并补入6%的物料和相对应的纤维素酶，温度40°C，转速lOOrpm，罐压0.005Mpa,通气3L/min开始SSF，每隔12小时取样。
[0022](4)补料补酶:24小时时，补入6%的物料和相对应的纤维素酶。
[0023](5)补菌种补料补酶:36小时时，接入一定量菌种，并补入3%的物料和相对应的
纤维素酶。
[0024](6)补料补酶:48小时时，补入3%的物料和相对应的纤维素酶，SSF总时间为96小时。
[0025](7)样品检测:样品中葡萄糖、木糖、乙醇、乙酸和乳酸等用HPLC检测。
【具体实施方式】
[0026]下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0027]实施例1 30L发酵罐进行玉米芯高温同步糖化酶解发酵生产乙醇
[0028]测定含水量:称取IOg原料，85°C烘干后称取干重后测得含水量，根据含水量数据计算30%底物所对应原料总质量(本次实验测得原料固形物含量为93.9% )。
[0029]发酵罐准备:30L发酵罐进行空气过滤器消毒，安装pH电极并加水没过电极后进行实消，之后排空水并清零。
[0030]发酵菌种准备:耐温酿酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679接种装有50mL —级种子培养基的250mL摇瓶中，该培养基的pH为5.5，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖2 %，蛋白胨2%，酵母膏I %。在40°C、200r/min的摇床培养24小时后，将培养的酵母菌转接IOml到含有250ml的二级种子培养基的1000mL三角瓶中，准备4个1000mL三角瓶，共1.0L的种子，该培养基的PH为5.5，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖10%，蛋白胨2%，酵母膏1%。在40°C、200r/min的摇床培养16小时。
[0031]HT-SSF过程:根据含水量及补料方案计算出反应体系需加水量(本次实验反应体系15L，一次性加水11L，称取12%底物含量对应的原料(1.9Kg)，纤维素酶0.465L(20FPU/g底物)，开搅拌并投料。完成后设定SSF程序，温度40°C，pH5.0，转速IOOrpm，罐压0.005Mpa，微通气。待搅拌均匀后取样，之后12小时补料6%及对应酶量；24小时补料6%及对应酶量；36小时补料3%及对应酶量；48小时补料3%及对应酶量；12小时和36小时时接入耐温酿酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679各IL总接种量为15 %。然后每12小时取一次样，取样在加料之前，总底物浓度为30%。利用HPLC测定96小时时剩余葡萄糖0.305g/L，乙醇产量为56.216g/L，酶解率为73%。
[0032]实施例2 30L发酵罐进行汽爆玉米秸杆物料高温同步糖化酶解发酵生产乙醇
[0033]测定含水量:称取IOg原料，85°C烘干后称取干重后测得含水量，根据含水量数据计算30%底物所对应原料总质量(本次实验测得原料固形物含量为96.1% )。
[0034] 发酵罐准备:30L发酵罐进行空气过滤器消毒，安装pH电极并加水没过电极后进行实消，之后排空水并清零。
[0035]发酵菌种准备:耐温酿酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679接种装有50mL —级种子培养基的250mL摇瓶中，该培养基的pH为5.5，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖2 %，蛋白胨2%，酵母膏I %。在40°C、200r/min的摇床培养24小时后，将培养的酵母菌转接IOml到含有250ml的二级种子培养基的1000mL三角瓶中，准备4个1000mL三角瓶，共1.0L的种子，该培养基的pH为5.5，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖10%，蛋白胨2%，酵母膏1%。在40°C、200r/min的摇床培养16小时。
[0036]HT-SSF过程:根据含水量及补料方案计算出反应体系需加水量(本次实验反应体系15L，一次性加水11L，称取12%底物含量对应的原料(1.87Kg)，纤维素酶0.455L(20FPU/g底物)，开搅拌并投料。完成后设定SSF程序，温度40°C，pH5.0，转速IOOrpm，罐压
0.005Mpa，微通气。待搅拌均匀后取样，之后12小时补料6%及对应酶量；24小时补料6%及对应酶量；36小时补料3%及对应酶量；48小时补料3%及对应酶量；12小时和36小时时分别接入耐温酿酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679各IL总接种量为15%。然后每12小时取一次样，取样在加料之前，总底物浓度为30%。利用HPLC测定96小时时剩余葡萄糖
3.305g/L,乙醇产量为34.694g/L，酶解率为65.8%。
[0037]实施例3 300L发酵罐进行汽爆玉米秸杆物料高温同步糖化酶解发酵生产乙醇
[0038]测定含水量:称取IOg原料，85°C烘干后称取干重后测得含水量，根据含水量数据计算30%底物所对应原料总质量。(本次实验测得原料固形物含量为93.9% )
[0039]种子罐准备:30L种子罐进行空气过滤器消毒，安装pH电极和溶氧电极并加水没过电极后进行实消 ，之后排空水并配制YPD培养基进行实消。
[0040]发酵罐准备:300L发酵罐进行空气过滤器消毒，安装pH电极并加水没过电极后进行实消，之后排空水并清零。
[0041]发酵菌种准备:耐温酿酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679接种装有50mL—级种子培养基的250mL摇瓶中，该培养基的pH为5.5，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖10%，蛋白胨2 %，酵母膏I %。在40°C、200r/min的摇床培养24小时后，将培养的酵母菌转接IOml到含有250ml的二级种子培养基的1000mL三角瓶中，准备4个1000mL三角瓶，共1.0L的种子，该培养基的PH为5.5，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖10%，蛋白胨2%，酵母膏1%。在40°C、200r/min的摇床培养16小时后，接种到30L发酵罐培养16小时。
[0042]HT-SSF过程:根据含水量及补料方案计算出反应体系需加水量(本次实验反应体系150L，一次性加水106L，称取12%底物含量对应的原料(19Kg)，纤维素酶4.65L，开搅拌并投料。完成后设定SSF程序，温度40°C，pH5.0，转速lOOrpm，罐压0.005Mpa，微通气。待搅拌均匀后取样，之后12小时补料6%及对应酶量；24小时补料6%及对应酶量；36小时补料3%及对应酶量；48小时补料3%及对应酶量；12小时和36小时时接入耐温酿酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679，总接种量为15%。SSF过程中每12小时取一次样，取样在加料之前，总底物浓度为30%。利用HPLC测定96小时时剩余葡萄糖1.411g/L，乙醇产量为57.014g/L，酶解率为 73.9%。
[0043]参考文献
[0044]Fang J, Qu YB.Wide distribution of c e 11 ob i o s e_o x i d i z i ngenzymes in wood-rot fungus indicates a physiological importance inlignocellulosicsdegradation.Biotechnology Techniques,19973(11): 195-197.[0045]Wy man C E.Biomass ethanol !Technical progress, opportunities, andcommercida challenges.A nnuRev Energy Environ, 1999, 24:189-226.[0046]South C R,Hogestt D A L,Lyna L R.Modeling simultaneous saccharificationand fer-mentation of lignocellulose to ethanol in batch and continuousreactors.Enzyme and MicrobTechnol,1995,17(9):797-803.[0047]George P Philippidis，Tammy K Smith.Limiting factors in thesimultaneoussaccharifica-tion and fermentation process for conversion ofcellulosic biomass to fuel ethanol.Applied Biochemistry and Biotechnology,1995,51/52:117-123.[0048]Ballesteros I，Oliva J M，Ballesteros M，et al.0ptimization of thesimultaneoussaccharif-1cation and fermentation process using thermotolerantyeasts.Applied Biochemistry and Biotechnology，1993，39/40:201-203.[0049]Diane D Spindler, Charles E Wyman, KarelGrohmann.Evaluation ofthermotolerant yeasts in controlled simultaneous sacchrifications andfermentations of cellulose to ethanol.Biotechnology and Bioengeering，1998，34:189-195.[0050]Zacchi G，Wingren A，Galbe M.Techno-economic evaluation ofproducingethanolfrom softwood:comparison ofSSF and SHF and identification ofbottlenecks.Biotechnological Progress,2003，19:1109 ~1117.[0051]Z.Lewis Liu.Genomic adaptation of ethanologenic yeast to biomassconversion inhibit-ors.Applied` Microbiology and Biotechnology，2006，73:27-36.
【权利要求】
1.一种利用木质纤维素原料在高温高固形物含量情况下同步酶解糖化发酵(HT-SSF)生产乙醇工艺，包括如下步骤: (1)发酵所用菌种在较高温度下培养。 (2)HT-SSF过程中，初始底物浓度为12%，在48小时之内分批补加底物，且温度要维持闻于38 C。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征是菌种的生长温度是38-50°C。
3.根据权利要求1中所述的方法，其特征是菌种的生长及发酵生产的培养基包括碳源、氮源和维生素，pH4.5-6.5。
4.根据权利要求1所述，其特征是所述碳源为质量百分含量为5%-40%的葡萄糖和/或蔗糖和/或淀粉和/或糖蜜和/或生物质水解糖液。
5.根据权利要求1所述，其特征是所述氮源为质量百分含量为0.1% -5%的玉米浆和/或牛肉膏和/或酵母提取物和/或蛋白胨和/或豆柏和/或豆饼粉和/或花生柏。
6.根据权利要求1所述，其特征是SSF过程中，初始底物浓度为12%。
7.根据权利要求1所述，其特征是SSF过程中，总底物浓度为25-40%。
8.根据权利要求1所述，其特征是SSF过程中，温度控制在40-50°C。
9.根据权利要求1所述，其特征是SSF过程中，纤维素酶用量为10-40FPU/g底物。
10.根据权利要求2、6、7、8、9所述，本发明是用于高温同步酶解糖化发酵生产乙醇。
【文档编号】C12P7/10GK103667362SQ201210362282
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月21日 优先权日:2012年9月21日
【发明者】马延和, 王钦宏, 齐显尼, 汪保卫, 涂然, 彭彦峰 申请人:天津工业生物技术研究所