专利名称：一种杂交和牛的培育方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种杂交和牛的培育方法。
背景技术：
日本和牛是日本神户通过几个世纪与外界隔绝，长期培育的肉牛品种。日本和牛是世界上公认的优秀肉牛品种，利用该品种所生产的牛肉品质也是独一无二的，其特点为:质地柔软、细嫩多汁，具有浓厚的牛肉风味，牛肉外观表现出具有极强的大理石花纹，呈多星状像雪花一样均匀有致的分布在牛肉中，鲜嫩可口，富含铁和不饱和脂肪酸，可显著改善精力和耐力，并可延缓机体衰老。称得上是牛肉产品中的极品。日本政府已经将日本和牛被视为国宝级的牛，日本政府于上世纪九十年代颁布禁令“禁止和牛及其遗传物质的出口”，其中包括日本和牛活牛、精液、胚胎，使日本和牛作为世界最好遗传肉牛品系在日本以外国家的发展得到限制。追溯北美地区创建纯系日本和牛历史知道，1976年由于当时日本政府与美国政府双边协议规定，日本政府以农业技术交流与科学发展研究为目的同意4头日本和牛的公牛进口到美国；到在上世纪90年代又分别两次引进了 200多头公牛和母牛。由于日本政府采取严禁日本和牛遗传物质出口，由于在上世纪日本和牛的这两次引进，让美国和加拿大抓住机遇，繁衍出纯日本和牛品系，成为除日本外，真正拥有日本和牛品系的国家。美国和加拿大政府和相关组 织非常重视日本和牛的发展，制定出周密的日本和牛追踪和评定方法。目前这些纯系和牛的后代分布在美加为数不多的地区和农场，有着完整的系谱并可进行DNA亲子鉴定的跟踪。如今在北美日本和牛的基因相似纯度达到99.9%以上，已经真正拥有除日本以外，拥有日本和牛品系的国家。然而，日本和牛虽然是世界上公认最好的肉牛之一，但是由于其体型小，出肉率低，后期育肥成本高等因素。除日本以外，日本和牛始终被排挤在主流世界肉牛行业之外。为了利用美国和加拿大的日本和牛资源，并且可以解决小型日本和牛的产肉量低和饲养成本高问题，又能确保日本和牛最显著的富含大理石花纹肉质特性。通过分析美国加拿大盛产的各种牛品种，其中包括安格斯、海福特、夏洛莱、利木赞、西门塔尔和荷斯坦的肉质各项指标发现，虽然荷斯坦牛肉质等级低，但却富含大理石花纹，是仅次日本和牛的牛品系。荷斯坦奶牛在美国和加拿大种群非常丰富，由于其产奶量高、牛奶品质高等特点，是世界行业公认具有世界最佳产奶基因种群。体外受精技术的开发与研究始于六十年代，在七十年代就有研究成果，在八十年代初体外胚胎研究从理论上、方法上得以充分的完善和迅速发展，成为动物胚胎工程及细胞工程领域内的一个基本和重要的研究分支。1982年美国科学家(Bracket等人)率先培育出世界第一胎体外受精牛犊，使家畜体外受精技术的研究取得了重大突破。日本科学家花田章等人(1985年)从屠宰母牛卵巢的卵母细胞，经人工成熟培养，体外受精及细胞培养成胚胎后移植于受体牛，在日本国家畜牧研究所成功地产下试管牛犊，真正开创体外胚胎生产技术运用的先河。
以胚胎移植进行畜牧产品品种改良，是1964年世界首例牛非手术胚胎移植在日本国家畜牧研究所获得成功和1974年英国科学家发明了胚胎冷冻方法之后，胚胎移植作为种畜品种改良和优良遗传传代手段才开始盛行于发达国家。关于胚胎玻璃化冷冻技术，1986年SchefTen等首先报道了利用25%甘油+25%1，2 —丙二醇玻璃化超快速冷冻牛桑堪胚一囊胚期胚胎。解冻后一步法脱除冷冻保护剂，获得了 53%的移植妊娠率，降低了玻璃化溶液的毒性。利用玻璃化方法冷冻体外胚胎具有操作简单、成本低、胚胎解冻后孵化率高等优点，而缺点是要求操作者具有能够掌握该方法的技巧本领。
发明内容
本发明的目的在于提供一种杂交和牛的培育方法。本发明是以加拿大荷斯坦奶牛为母系，利用加拿大屠宰场荷斯坦奶牛卵巢资源而抽取得到卵母细胞，以具有99.9%日本和牛遗传性状的种公牛为父系，获取父系精液，通过体外胚胎培养方法培育出具有日本和牛与荷斯坦奶牛遗传特性的杂交后代肉牛品系。本发明的日本和牛精液购自加拿大BC省本那比市精精遗传公司(Jingjing Genetic Inc.；Burnaby, BC, Canada)。本发明提供的杂交和牛的培育方法包括杂交和牛胚胎的体外培养和胚胎移植入受体牛子宫内繁育两个步骤。其中，杂交和牛胚胎体外培养方法包括如下步骤:
I)以具有99.9%日本和牛遗传性状的公牛为父系，荷斯坦奶牛为母系，分别提取父系的精液和母系的卵母细胞；2)在卵母细胞成熟液中培育卵母细胞；3)将成熟的卵母细胞在体外受精培养液中进行受精；4)将受精卵在胚胎培养液中培养。本发明杂交和牛胚胎体外培养方法还包括步骤5)体外胚胎的玻璃化冷冻。该培养方法中步骤2)优选将清洗干净的卵母细胞以100枚/管移入装有2mL卵母细胞成熟液的锥形管中进行培养。该培养方法中所述步骤2)的卵母细胞成熟液的配制方法为:a)配制培养母液:氯化钠5_7g，氯化钾0.4-0.6g，磷酸二氢钾0.1-0.3g，氯化镁
0.08-0.14g,乳酸钠 0.4-0.6mL,葡萄糖 0.1-0.5g,碳酸氢钠 l_4g,丙酮酸钠 0.01-0.06g,氯化钙0.1-0.5g，谷氨酰胺0.05-0.25g，加蒸馏水至IOOOmL,调节pH值为6.8，灭菌过滤得到
培养母液；b)卵母细胞成熟液:培养母液中分别加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸20_40mL，促卵泡素0.1-0.3mL，小牛血清白蛋白5-15g，酚红0.01-0.02g，青霉素40-60IU，链霉素40-60IU，混匀后再加培养母液至IOOOmL,调节pH值为7.2。该培养方法中所述步骤2)的培养条件为5%C02，38.5_39°C，培养22_24h。该培养方法中所述步骤3)的体外受精包括:a)将精子数量约2000万个的精液放入加有3mL体外受精培养液的离心管中，用离心机1500g转速离心，用400mL体外受精培养液稀释离心得到的精子；若为冷冻精液，操作方法为从液氮中取出一支冷冻精液细管(0.22cc，其中精子数量约2000万个)在30°C水浴中解冻10秒后，用消毒剪刀剪开后，将细管中的精液放入加有3mL体外受精培养液的离心管中，用离心机1500g转速离心，用400mL体外受精培养液稀释离心得到的精子；b)将成熟的卵母细胞以100枚/孔移入含体外受精培养液的受精盘中，加入稀释后的精子液，使每孔精子密度为1-2 X IO6个/mL。该培养方法中所述步骤3)的体外受精培养液的配制方法为:a)配制培养母液:氯化钠5_7g，氯化钾0.4-0.6g，磷酸二氢钾0.1-0.3g，氯化镁0.08-0.14g,乳酸钠 0.4-0.6mL,葡萄糖 0.1-0.5g,碳酸氢钠 l_4g,丙酮酸钠 0.01-0.06g,氯化钙0.1-0.5g，谷氨酰胺0.05-0.25g，加蒸馏水至IOOOmL,调节pH值为6.8，灭菌过滤得到培养母液；b)体外受精培养液:培养母液中加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸40_60mL，肝素0.4-0.8mL，果糖0.8-1.5g，乳酸5_15mL，小牛血清白蛋白5_8g，酚红0.01-0.02g，青霉素40-60IU，链霉素40-60IU，混匀后再加培养母液至IOOOmL,调节pH值为7.2。该培养方法中所述步骤3)的培养条件为5%C02，38.5_39°C，培养20_22h。该培养方法中所述步骤4)的胚胎培养液的配制方法为:a)配制培养母液:氯化钠5_7g，氯化钾0.4-0.6g，磷酸二氢钾0.1-0.3g，氯化镁0.08-0.14g,乳酸钠 0.4-0.6mL,葡萄糖 0.1-0.5g,碳酸氢钠 l_4g,丙酮酸钠 0.01-0.06g,氯化钙0.1-0.5g，谷氨酰胺0.05-0.25g，加蒸馏水至IOOOmL,调节pH值为6.8，灭菌过滤得到
培养母液；b)胚胎培养液:培养母液中分别加入非必需氨基酸10_15g,必需氨基酸15_25g,胎牛血清白蛋白50-70g，肌醇0.2-0.4g，青霉素40-60IU，链霉素40-60IU，混匀后再加培养母液至IOOOmL,调节pH值为7.2。该培养方法中所述步骤4的培养条件为5%C02，38.5-39.2 V，从卵母细胞受精到囊胚胚胎形成的培养时间为168-200h (受精后的第7和8天)。上述步骤5)所述的胚胎平衡液配方为:a)胚胎平衡液:小牛血清白蛋白10_12g，乙二醇180_220mL，青霉素60-80IU，链霉素60-80IU，加磷酸盐缓冲液调至IOOOmL ；b)胚胎玻璃化液:小牛血清白蛋白10-12g，乙二醇300-400mL，聚蔗糖200_250g，蔗糖0.2-0.3mol/L，青霉素60-80IU，链霉素60-80IU，加磷酸盐缓冲液调至IOOOmL ；c)胚胎玻璃化冷冻液:按照体积比60%胚胎平衡液+40%胚胎玻璃化液，混匀配置rfu 。该步骤5)的胚胎玻璃化冷冻方法具体为，取四孔盘，在每一孔中加入不等量的胚胎平衡液和胚胎玻璃化液，配置成有不同渗透性的溶液，39°C预热lOmin，将囊胚胚胎分别放入各孔溶液中进行平衡，平衡时间1-2分钟，取玻璃管(直径0.5mm),利用其虹吸将胚胎吸入管内，每支玻璃管中的装载胚胎数量不超过10枚，玻璃管内冷冻液的高度应控制在2-3mm，然后将由胚胎一端的玻璃管在液氮表面熏约3秒钟，待玻管内冷冻液冻住后再将整个玻璃管投入液氮中保存直至 使用。本发明还提供了一种杂交和牛的培育方法，采取子宫双侧内壁胚胎移植法，将上述杂交和牛胚胎体外培养方法培养得到杂交和牛胚胎移植入受体牛子宫内，繁育得到的新生牛即为杂父和牛。上述杂交和牛的培育方法还包括胚胎移植前解冻玻璃化冷冻胚胎，解冻方法为:分别将胚胎玻璃化解冻液和胚胎解冻平衡液在39°C预热lOmin，取出玻璃化冷冻胚胎保存玻管，在空气中停留3秒后将冻有体外胚胎的一端浸入玻璃化解冻液中，使管内液体连同胚胎一起排出到解冻液中；将胚胎移入新的胚胎玻璃化解冻液中平衡5min，再移入胚胎解冻平衡液中平衡5min取出，移入已经平衡好的胚胎培养液中直至使用；其中胚胎玻璃化解冻液配方为:小牛血清白蛋白8-10g，乙二醇300_350mL，聚蔗糖150-200g，蔗糖0.4-0.5mol/L,青霉素60-80IU，链霉素60-80IU，加磷酸盐缓冲液调至10OOmT,； 胚胎解冻平衡液配方为:小牛血清白蛋白8_12g，乙二醇180_220mL，蔗糖
0.07-0.lmol/L，青霉素60-80IU，链霉素60-80IU，加磷酸盐缓冲液调至lOOOmL。本发明的一个实施例中选用中国黄牛杂交牛作为受体牛，采取受体牛子宫双侧内壁胚胎移植方法，培育出杂交和牛新品系。要求作为受体牛的中国黄牛杂交牛是健康无生殖疾病、营养均衡、体况适中，18-24月龄，体重450kg以上的母牛。受体牛的发情为诱导同步发情方法，其具体方案为:第0天放阴道栓+2毫升R551 (雌二醇:促黄体生成素=1:1，体积比)，第5天打PG 0.4毫克，第7天取栓，第8天打I毫升R550 (雌二醇:孕酮=1:2，体积比)；在阴道栓同步发情方案实施后的第9天应采取不间断的受体牛发情观察。受体牛胚胎移植时间是受体牛发情特征明显，如有爬跨；牛卵巢上的黄体达到
`1.5厘米以上，尚未排卵。胚胎解冻方法为:取一四孔培养盘，加入胚胎培养液，放在5%C02，38.8-39.2°C培养箱中备用。取6厘米直径的培养盘，分别加入胚胎玻璃化解冻液和胚胎解冻平衡液(表10和表11)，39°C预热lOmin。将胚胎玻璃化解冻液盘放在实体显微镜下对好焦，从液氮罐中取出一支玻璃化冷冻胚胎的保存管，用拇指和食指夹住玻管，约在空气中停留3秒后，将冻有体外胚胎的一端浸入玻璃化解冻液盘中，当看到微玻管内结晶解冻，玻管内液面上升时立刻用食指封住玻管的上口，使管内液体连同胚胎一起排出到解冻液中。立刻将胚胎移入新的胚胎玻璃化解冻液中平衡5分钟后取出，再移入胚胎解冻平衡液盘中平衡5分钟取出，移入已经平衡好的胚胎培养液盘中直至使用。受体牛子宫双侧内壁胚胎移植方法是，将解冻好的玻璃化冷冻胚胎放入胚胎移植枪中，将胚胎放入确定已经发情的受体牛子宫双侧内壁，最终培育出杂交和牛新品系。本发明对体外胚胎实施玻璃化冷冻方法，本发明中，“玻璃化”的概念是指水或溶液快速降温达到或低于-100°c -110°c的温度范围时，形成一种高黏度的介于液态和固态之间、非晶体的、透明的玻璃态。玻璃化冷冻法是根据物理学原理，将高浓度的低温保护剂在超低温环境下凝固，形成无规则的玻璃化固体，这种固态物质能保持液态时的正常分子与离子分布，因而在细胞内发生玻璃化起到保护作用。这种方法不仅大大简化了冷冻过程，而且减少了由于细胞冰晶形成所引起的一系列物理及化学损伤。细胞内分子运动完全停止，从而能够达到长久保存的目的。本发明方法培育的杂交和牛品系的牛肉富含大理石花纹且质地柔软、鲜嫩可口，大大提高荷斯坦奶牛的肉质标准，从原来的C级牛肉上升至B4级水平，增加了荷斯坦杂交牛的肉用生产效益。在本发明提供的培育方法中，卵母细胞成熟锥形管培养技术及其培养液，使卵母细胞的成熟率达99%以上；本发明提供的体外受精培养液能大幅度提高成熟卵母细胞的体外受精，使规模化体外受精的卵母细胞卵裂率高达86%以上；使用发明的受精卵体外培养方法和胚胎培养液，通过提高受精卵细胞分裂和胚胎发展各阶段的活力和健康性，使A和B级胚胎的规模化出胚率提高至36%以上；本发明提供的体外爱德和牛胚胎的玻璃化冷冻技术，比常规冷冻方法使体外胚胎的存活及孵化率提高20%，孵化率达到96%以上。本发明已经达到具备产业化实际运用之意义。本发明中采取对受体牛的选择和发情要求，以及受体牛子宫双侧内壁体外胚胎移植，使体外胚胎的怀孕率达到54%，而产犊率达到48%，其中双胎率占产犊率的25%。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中所用生化试剂均为市售。实施例1卵母细胞的获取与成熟培养从加拿大屠宰场收集加拿大荷斯坦奶牛卵巢，经实验室处理后抽取得到的卵母细胞。其操作规程如下:(a)采集及装运卵巢的器械必须预先清洗干净；(b)预先准备经高压无菌后的生理盐水，使 用前加入1%抗菌素，并保温在28°C的水浴箱中直至使用；(c)采集没有明显病变和没经粪便污染的母牛卵巢，卵巢放入预先装好的生理盐水的保温瓶中；Cd)从卵巢采集离体至被利用的时间不超过10小时。卵母细胞的抽取操作程序是:(a)将卵巢转换到广口保温瓶中，倒入约30°C加有1%抗菌素生理盐水至浸没卵巢，清洗好卵巢后用；(b)10mL注射器套上18G注射针头，吸取少量601液(配方见表I，本实施例采用的具体配方为:氯化钠6g，氯化钾0.5g，磷酸二氢钾
0.2g,氯化镁0.1g,乳酸钠0.5mL,葡萄糖0.3g,碳酸氢钠2g,丙酮酸钠0.03g,氯化I丐0.3g,谷氨酰胺0.15g，加蒸馏水至IOOOmL,调节pH值为6.8，灭菌过滤得到)润滑针，然后在距离卵泡约3mm位置插入针头，逐个抽取卵巢表面直径2飞毫米的卵泡中的卵丘卵母细胞复合体(COCs) ; (c)将抽出的卵泡液注射到60_培养皿中，用显微镜镜检挑取卵母细胞。在抽取卵母细胞前2小时将卵母细胞成熟液(本发明中简称为602液，配方见表2，本实施例中采用的具体配方为:在800mL的培养母液中分别加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸30mL，促卵泡素0.2mL，小牛血清白蛋白10g，酚红0.0lg，青霉素50IU，链霉素50IU，混匀后再加培养母液至IOOOmL,调节pH值为7.2)，放入CO2培养箱中预热平衡。检卵前在卵母细胞成熟母液中加入1%抗菌素，混匀后取2毫升上述卵母细胞成熟液放入15毫升锥形管中，然后放回CO2培养箱待用。将在显微镜下找到的符合要求的100个卵母细胞为一组，放入加有602成熟液的60mm培养皿中清洗，然后将清洗过的100个卵母细胞移入装有2毫升上述602成熟液的15毫升锥形管中，放入5%C02培养箱进行成熟培养。培养条件为38.5°C、5%二氧化碳的空气、培养时间为23小时。602卵母细胞成熟液的配置是在601培养母液(配方见表I)基础上进行配制，经无菌过滤后放在4°C中保存，备用。本发明利用锥形管使卵母细胞自然紧密集聚，因为卵丘细胞的紧密有助于卵母细胞的体外成熟和体外受精。而在促进卵母细胞成熟的602成熟液中成分使卵母细胞处在更为接近动物体内环境条件，促性腺激素有利于改变卵丘细胞的代谢机能，并阻断由卵丘细胞通过胞间连接向卵子分泌减数分裂抑制因子的途径，从而使卵母细胞恢复成熟分裂过程，大大提高卵母细胞的成熟率。本实例培养结果显示，采用本发明的方法可使其卵母细胞成熟率到达98%，这一结果比普通方法的卵母细胞成熟率高出10%。表I培养母液(601)的配方(pH6.8)
权利要求
1.一种杂交和牛胚胎体外培养方法，包括如下步骤: 1)以具有99.9%日本和牛遗传性状的公牛为父系，荷斯坦奶牛为母系，分别提取父系的精液和母系的卵母细胞； 2)在卵母细胞成熟液中培育卵母细胞； 3)将成熟的卵母细胞在体外受精培养液中进行受精； 4)将受精卵在胚胎培养液中培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤5)体外胚胎的玻璃化冷冻。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)是将清洗干净的卵母细胞以100枚/管移入装有2mL卵母细胞成熟液的锥形管中进行培养。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的卵母细胞成熟液的配制方法为: a)配制培养母液:氯化钠5-7g，氯化钾0.4-0.6g，磷酸二氢钾0.1-0.3g，氯化镁0.08-0.14g,乳酸钠 0.4-0.6mL,葡萄糖 0.1-0.5g,碳酸氢钠 l_4g,丙酮酸钠 0.01-0.06g,氯化钙0.1-0.5g，谷氨酰胺0.05-0.25g，加蒸馏水至IOOOmL,调节pH值为6.8，灭菌过滤得到培养母液； b)卵母细胞成熟液:培养母液中分别加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸20-40mL，促卵泡素0.1-0.3mL，小牛血清白蛋白5-15g，酚红0.01-0.02g，青霉素40-60IU，链霉素40-60IU，混匀后再加培养母液至IOOOmL,调节pH值为7.2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的培养条件为5%C02，38.5-39 °C，培养 22-24h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)的体外受精包括: a)将精子数量约2000万个的精液放入加有3mL体外受精培养液的离心管中，用离心机1500g转速离心，用400mL体外受精培养液稀释离心得到的精子； b)将成熟的卵母细胞以100枚/孔移入含体外受精培养液的受精盘中，加入稀释后的精子液，使每孔精子密度为1-2 X IO6个/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)的体外受精培养液的配制方法为: a)配制培养母液:氯化钠5-7g，氯化钾0.4-0.6g，磷酸二氢钾0.1-0.3g，氯化镁0.08-0.14g,乳酸钠 0.4-0.6mL,葡萄糖 0.1-0.5g,碳酸氢钠 l_4g,丙酮酸钠 0.01-0.06g,氯化钙0.1-0.5g，谷氨酰胺0.05-0.25g，加蒸馏水至IOOOmL,调节pH值为6.8，灭菌过滤得到培养母液； b)体外受精培养液:培养母液中分别加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸40-60mL，肝素0.4-0.8mL，果糖0.8-1.5g，乳酸5_15mL，小牛血清白蛋白5_8g，酚红0.01-0.02g，青霉素40-60IU，链霉素40-60IU，混匀后再加培养母液至IOOOmL,调节pH值为7.2。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)的培养条件为5%C02，38.5-39 °C，培养 20-22h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)的胚胎培养液的配制方法为: a)配制培养母液:氯化钠5-7g，氯化钾0.4-0.6g，磷酸二氢钾0.1-0.3g，氯化镁.0.08-0.14g,乳酸钠 0.4-0.6mL,葡萄糖 0.1-0.5g,碳酸氢钠 l_4g,丙酮酸钠 0.01-0.06g,氯化钙0.1-0.5g，谷氨酰胺0.05-0.25g，加蒸馏水至IOOOmL,调节pH值为6.8，灭菌过滤得到培养母液； b)胚胎培养液:培养母液中分别加入非必需氨基酸10-15g，必需氨基酸15-25g，胎牛血清白蛋白50-70g，肌醇0.2-0.4g，青霉素40-60IU，链霉素40-60IU，混匀后再加培养母液至lOOOmL，调节pH值为7.2。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)的培养条件为5%C02，38.8-39.2°C，从卵母细胞受精到囊胚胚胎形成培养时间为168-200h。
11.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤5)的胚胎玻璃化冷冻方法为: a)胚胎平衡液:小牛血清白蛋白10-12g，乙二醇180-220mL，青霉素60-80IU，链霉素60-80IU，加磷酸盐缓冲液调至IOOOmL ； b)胚胎玻璃化液:小牛血清白蛋白10-12g，乙二醇300-400mL，聚蔗糖200_250g，蔗糖0.2-0.3mol/L，青霉素60-80IU，链霉素60-80IU，加磷酸盐缓冲液调至IOOOmL ； c)胚胎玻璃化冷冻液:按照体积比60%胚胎平衡液+40%胚胎玻璃化液，混匀配置而成。
12.—种杂交和牛的培育方法,其特征在于,应用权利要求1-11任一所述的方法体外培养杂交和牛胚胎后，采取子宫双侧内壁胚胎移植法将胚胎移植入受体牛子宫内，繁育得到的新生牛即为杂交和牛。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，还包括胚胎移植前解冻玻璃化冷冻胚胎，解冻方法为:分别将胚胎玻璃化解冻液和胚胎解冻平衡液在39°C预热lOmin，取出玻璃化冷冻胚胎保存玻管，在空气中停留3秒后将冻有体外胚胎的一端浸入玻璃化解冻液中，使管内液体连同胚胎一起排出到解冻液中；将胚胎移入新的胚胎玻璃化解冻液中平衡5min，再移入胚胎解冻平衡液中平衡5min取出，移入已经平衡好的胚胎培养液中直至使用； 所述胚胎玻璃化解冻液配方为:小牛血清白蛋白8-10g，乙二醇300-350mL，聚蔗糖150-200g,蔗糖0.4-0.5mol/L,青霉素60-80IU，链霉素60-80IU，加磷酸缓冲液调至.10OOmT,； 所述胚胎解冻平衡液配方为:小牛血清白蛋白8-12g，乙二醇180-220mL，蔗糖.0.07-0.lmol/L，青霉素60-80IU，链霉素60-80IU，加磷酸缓冲液调至IOOOmL ； 所述胚胎培养液IL配方为:培养母液中分别加入非必需氨基酸10-15g，必需氨基酸.15-25g，胎牛血清白蛋白50-70g，肌醇 0.2 -0.4g，青霉素40-60IU，链霉素40-60IU，混匀后再加培养母液至IOOOmL,调节pH值为7.2。
全文摘要
本发明提供了一种杂交和牛的培育方法，包括杂交和牛胚胎体外培养和胚胎移植入受体牛子宫内繁育，其中胚胎体外培养方法包括如下步骤(1)以具有99.9%日本和牛遗传性状的公牛为父系，荷斯坦奶牛为母系，分别提取父系的精液和母系的卵母细胞；(2)在卵母细胞成熟液中培育卵母细胞；(3)将成熟的卵母细胞在体外受精培养液中进行体外受精；(4)将受精卵在胚胎培养液中培养；(5)体外胚胎的玻璃化冷冻。将体外培养的胚胎移植入受体牛子宫内，采用子宫双侧内壁胚胎移植法，最终培育出具有日本和牛和加拿大荷斯坦奶牛性状的杂交子一代和牛新品系，其具有肉用价值高、生产性能好的特点。
文档编号C12N5/073GK103184189SQ20121036965
公开日2013年7月3日 申请日期2012年9月28日 优先权日2011年12月29日
发明者祝加贝 申请人:北京富通华生物科技有限公司