专利名称：一种双链rna的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种双链RNA的制备方法，具体是利用大肠杆菌发酵制备双链RNA样品，该双链样品可用作甲壳动物的RNA干扰。
背景技术：
RNA干扰(RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的序列特异性基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是研究多种生物基因功能的有效手段。RNAi技术作为新兴的基因阻抑方法，在功能基因组学、微生物学、基因表达 调控机理研究等领域得到了广泛应用。目前，主要利用小干扰RNA(SiRNA)进行基因干扰，已在拟南芥、秀丽新小杆线虫、黑腹果蝇、斑马鱼和小鼠等生物中应用。现阶段，体外制备siRNA的方法各有优缺点化学合成方法能制备高质量的siRNA，但价格高，定制周期长；体外转录方法合成siRNA，成本相对较低，但实验的规模和量受到限制。甲壳动物的免疫系统是开放式循环系统，不存在免疫球蛋白，缺乏抗体介导的免疫反应，其免疫机制以非特异性免疫为主。因此，体外人工合成的长链双链RNA可以进入动物体内，沉默目的基因，下调相应蛋白表达水平，快速而经济地开展某个基因功能缺失的表型研究。利用大肠杆菌发酵制备双链RNA样品，可在短时间内高效快捷的生产大量长链双链RNA，既缩短了化学合成所需的制备周期，降低了高额的费用，又突破了体外转录的规模限制。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种双链RNA的制备方法，该方法适于甲壳动物RNA干扰时使用。本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案步骤如下
步骤(I).基因克隆利用PCR扩增的方法克隆目的基因分子。根据目的基因分子的cDNA序列设计带有酶切位点的正向引物和反向引物。以目的基因分子的cDNA序列为模板，进行PCR扩增，克隆目的基因分子，得到PCR产物。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析。采用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，得到纯化后的PCR产物。步骤⑵.载体构建利用pET-T7质粒构建含有目的基因片段的表达载体。纯化后的PCR产物和pET-T7质粒分别用限制性内切酶进行双酶切，得到目的基因的酶切产物和PET-T7质粒的酶切产物。目的基因的酶切产物和PET-T7质粒的酶切产物用凝胶回收试剂盒纯化，得到纯化后目的基因的酶切产物和纯化后PET-T7质粒的酶切产物。利用DNA连接试剂盒连接纯化后目的基因的酶切产物和纯化后PET-T7质粒的酶切产物。将连接后的产物转入感受态细胞疋coli DH5a中，涂板，30 37°C培养12 24小时。挑选阳性单菌落进行PCR检测，琼脂糖凝胶电泳分析。选取含有目的基因片段的阳性单菌落，测序分析插入基因片段序列的正确性，得到含有正确基因片段插入的单菌落。步骤(3).载体转化
挑取经鉴定含有正确基因片段插入的单菌落，接种于LB液体培养基中，30 37°C条件下培养12 24小时，离心得到沉淀。利用小量质粒抽提试剂盒抽提沉淀菌体中的PET-T7表达载体，凝胶电泳检测抽提产物。将含有基因片段插入的PET-T7表达载体转化到表达型菌株疋coli HT115中，涂板培养，挑选阳性菌落进行PCR检测，凝胶电泳分析，选取含有目的载体的阳性菌落，保存待用。此处的含有目的载体的阳性菌落为携带PET-T7载体的
B.coli HTl 15 单菌落。 步骤⑷.双链RNA的诱导表达
将携带PET-T7载体的疋coli HTl 15单菌落接种于LB液体培养基中，30 37°C条件下培养12 24小时。以1:20 1:50的比例扩大培养至OD600=O. 4 I. O。在LB液体培养基中加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷IPTG溶液，加至IPTG在LB液体培养基中的终浓度为O. 2 I. 0mmol/L,30 37°C诱导培养2 8小时。离心收集细菌沉淀，磷酸缓冲液漂洗，得到漂洗后的细菌沉淀，保存待用。所述的LB液体培养基为含有10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、10g/l氯化钠和50 μ g/ml氨苄青霉素的水溶液，pH为7. 4 ;
所述的酵母提取物采用常规现有产品，可经市场购买取得；
所述的磷酸缓冲液为含有8g/l氯化钠NaCl、0. 2g/l氯化钾KC1、1. 38g/l磷酸氢二钠Na2HP04、0. 24g/l 磷酸二氢钾 KH2PO4 的水溶液，pH 为 7. 4。步骤(5).双链RNA的纯化
总RNA抽提取漂洗后的细菌沉淀，利用Trizol试剂盒提取漂洗后的细菌沉淀中的总
RNA ；
变性将提取的总RNA溶解于核糖核酸酶A (RNase A)缓冲液中，80 90°C变性5 15分钟，得到变性溶液；
复性将变性溶液置于水浴中冷却至常温，使得变性溶液复性，得到复性后的溶液；酶切在复性后的溶液中加入RNase A进行酶切，加至RNase A在复性后的溶液中的终浓度为10 50 μ g/ml，在35 37°C条件下反应10 60分钟，去除单链RNA，得到酶切后产物，电泳检测酶切效果；
纯化在酶切后产物中加入与酶切产物等量体积的酚氯仿溶液，充分混匀，离心取上清液。在上清液中加入2 3倍上清液体积的无水乙醇，充分混匀，静置，沉淀双链RNA，离心收集沉淀物；用70 75 %乙醇充分洗涤，离心收集沉淀，自然干燥；
溶解加入灭菌水溶解沉淀，所得溶液即为纯化后的双链RNA样品。凝胶电泳检测双链RNA样品，分光广度计法测定核酸样品浓度，-30 -20°C保存待用。所述的核糖核酸酶A缓冲液为含300 mmol/L的醋酸钠NaAc、10 mmol/L的三轻甲基氨基甲烷盐酸Tris-HCl的水溶液，pH为8. O。所述的酚氯仿溶液为pH 4. O 6. O的酸性饱和酚与氯仿按体积比O. 8:1 I. 2:1混合而成的混合液。
本发明所具有的有益效果
本发明利用大肠杆菌发酵制备双链RNA样品，可在短时间内高效快捷的生产大量双链RNA样品，既能缩短制备周期，又降低高额费用，而且突破了体外转录时的规模限制。该发明适用范围广泛，可以合成不同长短片段的双链RNA。同时，该发明制备方法简单，实施步骤快捷，操作重复性强，样品合成量不受限制。
具体实施例方式下面对本发明做进一步的分析。绿色荧光蛋白GFP是一种常用的生物学标记物。RNA干扰实验时，GFP基因的干扰通常被用作对照实验组数据。本实施例中将以绿色荧光蛋白基因为例，详细阐述双链RNA的合成和制备方法。
实施例I
步骤(I).基因克隆利用PCR扩增的方法克隆GFP基因分子。 根据基因库中已报道的GFP基因的cDNA序列设计带有酶切位点的正向引物GFP-F和反向引物GFP-R。以GFP基因分子的cDNA为模板，进行PCR扩增，克隆目的基因分子，得到PCR产物。PCR反应体系为
10XPCR buffer2. 5 μ I
25mM Mg2+I. 5μ I
5mM dNTPsI μ I
10 μ M GFP-PFI μ I
10 μ M GFP-PRI μ I
GFP cDNAI μ I
Taq DNA 聚合酶O. 25 μ I
加水至终体积为25 μ I。PCR扩增反应条件为先94°C变性5分钟，然后进行30个扩增循环，最后72°C延伸10分钟；其中扩增循环为94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸I分钟。PCR产物用I. O %琼脂糖凝胶电泳分析。采用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，得到纯化后的GFP基因的PCR产物。步骤(2).载体构建利用PET-T7质粒构建含有GFP基因片段的表达载体。本实施例中以限制性内切酶ZhI和&0RI为例，详细阐述PET-T7载体的构建过程。纯化后的PCR产物和pET-T7质粒均用限制性内切油a I和feoRI进行双酶切，得到GFP基因的酶切产物和pET-T7质粒的酶切产物。双酶切反应体系如下
PET-T7质粒双酶切反应体系
PET-T7 质粒I μ g
IOXM bufferI μ I
XbalI μ I
^cRII μ I加水至终体积20 μ 1，37°C反应8小时，得到pET-T7质粒的酶切产物。PCR产物双酶切反应体系
PCR产物I μ g
IOXM bufferI μ I
XbalI μ I
EcoRlI μ I
加水至终体积20μ 1，37°C反应8小时，得到GFP基因的酶切产物。GFP基因的酶切产物和PET-T7质粒的酶切产物用凝胶回收试剂盒纯化，得到纯化 后GFP基因的酶切产物和纯化后PET-T7质粒的酶切产物。利用DNA连接试剂盒连接纯化后GFP基因的酶切产物和纯化后pET_T7质粒的酶切产物，16°C条件下连接4小时。将连接后的产物转入感受态细胞疋coli DH5a中，涂板，30°C培养24小时。从平板上挑选阳性单菌落进行PCR检测，引物为GFP-PF和GFP-PR，PCR反应模板为含有单菌落的菌液，PCR扩增反应条件同上所述，用1.0 %琼脂糖凝胶电泳分析。选取含有GFP基因片段的阳性单菌落，测序分析插入基因片段序列的正确性，得到含有正确GFP基因片段插入的单菌落。步骤(3).载体转化
挑取经鉴定含有正确GFP基因插入序列的单菌落，接种于Iml LB液体培养基中，30°C培养24小时，5000转/分钟，离心5分钟，得到沉淀。利用小量质粒抽提试剂盒抽提沉淀菌体中的PET-T7表达载体，I %琼脂糖凝胶电泳检测抽提产物。将含有GFP基因片段插入的pET-T7表达载体转化到表达型菌株疋HT115中，涂板培养，挑选阳性菌落进行PCR检测，反应条件同上所述。PCR产物用1.0 %琼脂糖凝胶电泳分析。选取含有目的载体的阳性菌落，保存待用。此处的含有目的载体的阳性菌落为携带GFP基因片段的pET-T7载体的疋coliHT115单菌落。步骤⑷.双链RNA的诱导表达
将携带GFP基因片段的pET-T7载体的疋coli HT115单菌落接种于LB液体培养基中，30°C条件下培养24小时。将携带GFP基因片段的pET-T7载体的疋HTl 15单菌落转接到新鲜的LB液体培养基中扩大培养，原先的LB液体培养基与新鲜的LB液体培养基的体积比为I :20，在同样条件下培养使细菌生长至0D_=0. 4。在LB液体培养基中加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷IPTG溶液，加至IPTG在LB液体培养基中的终浓度为O. 2mmol/L,30°C诱导培养8小时。5000转/分钟，离心5分钟，收集细菌沉淀。磷酸缓冲液漂洗2次，得到漂洗后的细菌沉淀，保存待用。步骤(5).双链RNA的纯化
总RNA抽提取漂洗后的细菌沉淀，利用Trizol试剂盒提取漂洗后的细菌沉淀中的总
RNA ；
变性将提取的总RNA溶解于核糖核酸酶A (RNase A)缓冲液中，80°C变性15分钟，得到变性溶液；
复性将变性溶液置于水浴中冷却至常温，使得变性溶液复性，得到复性后的溶液；酶切在复性后的溶液中加入RNase A进行酶切，加至RNase A在复性后的溶液中的终浓度为10 μ g/ml,35°C反应60分钟，去除单链RNA，得到酶切后产物，用I. O %琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果；
纯化在酶切后产物中加入与酶切后产物等量体积的酚氯仿溶液，充分混匀，10000转/分钟，4°C，20分钟，离心取上清液。在上清液中加入2倍上清液体积的无水乙醇，充分混匀，静置，沉淀双链RNA，10000转/分钟，4°C，30分钟，离心收集沉淀物；用70 %乙醇充分洗涤，10000转/分钟，4°C，20分钟，离心收集沉淀，自然干燥；
溶解加入灭菌水溶解沉淀，所得溶液即为纯化后的双链RNA样品。利用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测双链RNA样品，分光广度计法测定核酸样品浓度，-30°C保存待用。上述的LB液体培养基为含10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化钠和50 μ g/ml氨苄青霉素的水溶液，pH为7. 4 ;磷酸缓冲液为含8g/l氯化钠NaCl，O. 2g/l氯化钾KCl，I. 38g/l磷酸氢二钠Na2HPO4,O. 24g/l磷酸二氢钾KH2PO4的水溶液，pH为7. 4 ;
核糖核酸酶A缓冲液为含300mmol/L的醋酸钠NaAc，IOmmoI/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸Tris-HCl的水溶液，pH为8. O ;
酚氯仿溶液为PH 4. O的酸性饱和酚与氯仿按体积比O. 8 :1混合而成的混合液。实施例2
步骤(I).基因克隆利用PCR扩增的方法克隆GFP基因分子。根据基因库中已报道的GFP基因的cDNA序列设计带有酶切位点的正向引物GFP-F和反向引物GFP-R。以GFP基因分子的cDNA为模板，进行PCR扩增，克隆目的基因分子，得到PCR产物。PCR反应体系为
10XPCR buffer2. 5 μ I
25mM Mg2+I. 5μ I
5mM dNTPsI μ I
10 μ M GFP-PFI μ I
10 μ M GFP-PRI μ I
GFP cDNAI μ I
Taq DNA 聚合酶O. 25 μ I
加水至终体积为25 μ I。PCR扩增反应条件为先94°C变性5分钟，然后进行38个扩增循环，最后72°C延伸10分钟；其中扩增循环为94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸2分钟。PCR产物用I. 5 %琼脂糖凝胶电泳分析。采用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，得到纯化后的GFP基因的PCR产物。步骤(2).载体构建利用PET-T7质粒构建含有GFP基因片段的表达载体。本实施例中以限制性内切酶ZhI和&0RI为例，详细阐述PET-T7载体的构建过程。纯化后的PCR产物和pET-T7质粒均用限制性内切油a I和feoRI进行双酶切，得到GFP基因的酶切产物和pET-T7质粒的酶切产物。双酶切反应体系如下PET-T7质粒双酶切反应体系
PET-T7 质粒I μ g
IOXM bufferI μ I
XbalI μ I
EcoRlI μ I
加水至终体积20 μ 1，37°C反应16小时，得到pET-T7质粒的酶切产物。PCR产物双酶切反应体系 PCR产物I μ g
IOXM bufferI μ I
XbalI μ I
EcoRlI μ I
加水至终体积20μ 1，37°C反应16小时，得到GFP基因的酶切产物。GFP基因的酶切产物和PET-T7质粒的酶切产物用凝胶回收试剂盒纯化，得到纯化后GFP基因的酶切产物和纯化后PET-T7质粒的酶切产物。利用DNA连接试剂盒连接纯化后GFP基因的酶切产物和纯化后pET_T7质粒的酶切产物，16°C条件下连接12小时。将连接后的产物转入感受态细胞疋coli DH5a中，涂板，37°C培养12小时。从平板上挑选阳性单菌落进行PCR检测，引物为GFP-PF和GFP-PR，PCR反应模板为含有单菌落的菌液，反应条件同上所述，用1.5 %琼脂糖凝胶电泳分析。选取含有GFP基因片段的阳性单菌落，测序分析插入基因片段序列的正确性，得到含有正确GFP基因片段插入的单菌落。步骤(3).载体转化。挑取经鉴定含有正确GFP基因插入序列的单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37°C培养12小时，5000转/分钟，离心10分钟，得到沉淀。利用小量质粒抽提试剂盒抽提沉淀菌体中的PET-T7表达载体，I %琼脂糖凝胶电泳检测抽提产物。将含有GFP基因片段插入的pET-T7表达载体转化到表达型菌株疋HT115中，涂板培养，挑选阳性菌落进行PCR检测，反应条件同上所述。PCR产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳分析。选取含有目的载体的阳性菌落，保存待用。此处的含有目的载体的阳性菌落为携带GFP基因片段的pET-T7载体的疋coliHT115单菌落。步骤⑷.双链RNA的诱导表达
将携带GFP基因片段的pET-T7载体的疋coli HT115单菌落接种于LB液体培养基中，37°C条件下培养12小时。将携带GFP基因片段的pET-T7载体的疋HTl 15单菌落转接到新鲜的LB液体培养基中扩大培养，原先的LB液体培养基与新鲜的LB液体培养基的体积比为I :50，在同样条件下培养使细菌生长至0D_=1. O。在LB液体培养基中加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷IPTG溶液，加至IPTG在LB液体培养基中的终浓度为I. Ommol/L,37°C诱导培养2小时。5000转/分钟，10分钟离心，收集细菌沉淀。磷酸缓冲液漂洗2次，得到漂洗后的细菌沉淀，保存待用。步骤(5).双链RNA的纯化总RNA抽提取漂洗后的细菌沉淀，利用Trizol试剂盒提取漂洗后的细菌沉淀中的总
RNA ；
变性将提取的总RNA溶解于核糖核酸酶A (RNase A)缓冲液中，90°C变性5分钟，得到变性溶液；
复性将变性溶液置于水浴中冷却至常温，使得变性溶液复性，得到复性后的溶液；酶切在复性后的溶液中加入RNase A进行酶切，加至RNase A在复性后的溶液中的终浓度为50 μ g/ml,37°C反应10分钟，去除单链RNA，得到酶切后产物，用I. 5 %琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果；
纯化在酶切后产物中加入与酶切后产物等量体积的酚氯仿溶液，充分混匀，11000转/分钟，4°C，13分钟，离心取上清液。在上清液中加入3倍上清液体积的无水乙醇，充分混匀，静置，沉淀双链RNA，11000转/分钟，4°C，25分钟，离心收集沉淀物；用75 %乙醇充分洗涤，11000转/分钟，4°C，13分钟，离心收集沉淀，自然干燥；
溶解加入灭菌水溶解沉淀，所得溶液即为纯化后的双链RNA样品。利用I. 2 %琼脂糖凝胶电泳检测双链RNA样品，分光广度计法测定核酸样品浓度，-20°C保存待用。上述的LB液体培养基为含10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化钠和50 μ g/ml氨苄青霉素的水溶液，pH为7. 4 ;
磷酸缓冲液为含8g/l氯化钠NaCl，O. 2g/l氯化钾KCl，I. 38g/l磷酸氢二钠Na2HPO4,
O.24g/l磷酸二氢钾KH2PO4的水溶液，pH为7. 4 ;
核糖核酸酶A缓冲液为含300mmol/L的醋酸钠NaAc，IOmmoI/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸Tris-HCl的水溶液，pH为8. O ;
酚氯仿溶液为PH 6. O的酸性饱和酚与氯仿按体积比I. 2 :1混合而成的混合液。实施例3
步骤(I).基因克隆利用PCR扩增的方法克隆GFP基因分子。根据基因库中已报道的GFP基因的cDNA序列设计带有酶切位点的正向引物GFP-F和反向引物GFP-R。以GFP基因分子的cDNA为模板，进行PCR扩增，克隆目的基因分子，得到PCR产物。PCR反应体系为
10XPCR buffer2. 5 μ I
25mM Mg2+I. 5μ I
5mM dNTPsI μ I
10 μ M GFP-PFI μ I
10 μ M GFP-PRI μ I
GFP cDNAI μ I
Taq DNA 聚合酶O. 25 μ I
加水至终体积为25 μ I。PCR扩增反应条件为先94°C变性5分钟，然后进行35个扩增循环，最后72°C延伸10分钟；其中扩增循环为94°C变性30秒，52°C退火30秒，72°C延伸I. 5分钟。PCR产物用I. 2 %琼脂糖凝胶电泳分析。采用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，得到纯化后的GFP基因的PCR产物。
步骤(2).载体构建利用PET-T7质粒构建含有GFP基因片段的表达载体。本实施例中以限制性内切酶ZhI和&0RI为例，详细阐述PET-T7载体的构建过程。纯化后的PCR产物和pET-T7质粒均用限制性内切油a I和feoRI进行双酶切，得到GFP基因的酶切产物和pET-T7质粒的酶切产物。双酶切反应体系如下
PET-T7质粒双酶切反应体系
PET-T7 质粒I μ g IOXM bufferI μ I
XbalI μ I
EcoRlI μ I
加水至终体积20 μ 1，37°C反应12小时，得到pET-T7质粒的酶切产物。PCR产物双酶切反应体系
PCR产物I μ g
IOXM bufferI μ I
XbalI μ I
EcoRlI μ I
加水至终体积20μ 1，37°C反应12小时，得到GFP基因的酶切产物。GFP基因的酶切产物和PET-T7质粒的酶切产物用凝胶回收试剂盒纯化，得到纯化后GFP基因的酶切产物和纯化后PET-T7质粒的酶切产物。利用DNA连接试剂盒连接纯化后GFP基因的酶切产物和纯化后pET_T7质粒的酶切产物，16°C条件下连接8小时。将连接后的产物转入感受态细胞疋coli DH5a中，涂板，35°C培养18小时。从平板上挑选阳性单菌落进行PCR检测，引物为GFP-PF和GFP_PR，PCR反应模板为含有单菌落的菌液，反应条件同上所述，用I. 2 %琼脂糖凝胶电泳分析。选取含有GFP基因片段的阳性单菌落，测序分析插入基因片段序列的正确性，得到含有正确GFP基因片段插入的单菌落。步骤(3).载体转化。挑取经鉴定含有正确GFP基因插入序列的单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，35°C培养18小时，5000转/分钟，离心8分钟，得到沉淀。利用小量质粒抽提试剂盒抽提沉淀菌体中的PET-T7表达载体，I %琼脂凝胶电泳检测抽提产物。将含有GFP基因片段插入的pET-T7表达载体转化到表达型菌株疋HT115中，涂板培养，挑选阳性菌落进行PCR检测，反应条件同上所述。PCR产物用1.2 %琼脂糖凝胶电泳分析。选取含有目的载体的阳性菌落，保存待用。此处的含有目的载体的阳性菌落为携带GFP基因片段的pET-T7载体的疋coliHT115单菌落。步骤⑷.双链RNA的诱导表达
将携带GFP基因片段的pET-T7载体的疋coli HT115单菌落接种于LB液体培养基中，35°C条件下培养15小时。将携带GFP基因片段的pET-T7载体的疋HTl 15单菌落转接到新鲜的LB液体培养基中扩大培养，原先的LB液体培养基与新鲜的LB液体培养基的体积比为I :30，在同样条件下培养使细菌生长至0D_=0. 7。在LB液体培养基中加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷IPTG溶液，加至IPTG在LB液体培养基中的终浓度为O. 6mmol/L,35°C诱导培养5小时。5000转/分钟，8分钟离心，收集细菌沉淀。磷酸缓冲液漂洗2次，得到漂洗后的细菌沉淀，保存待用。步骤(5).双链RNA的纯化
总RNA抽提取漂洗后的细菌沉淀，利用Trizol试剂盒提取漂洗后的细菌沉淀中的总
RNA ；
变性将提取的总RNA溶解于核糖核酸酶A (RNase A)缓冲液中，85°C变性10分钟，得到变性溶液；
复性将变性溶液置于水浴中冷却至常温，使得变性溶液复性，得到复性后的溶液；酶切在复性后的溶液中加入RNase A进行酶切，加至RNase A在复性后的溶液中的终 浓度为30 μ g/ml,36°C反应30分钟，去除单链RNA，得到酶切后产物，用I. 2 %琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果；
纯化在酶切后产物中加入与酶切后产物等量体积的酚氯仿溶液，充分混匀，12000转/分钟，4°C，10分钟，离心取上清液。在上清液中加入2. 5倍上清液体积的无水乙醇，充分混匀，静置，沉淀双链RNA，12000转/分钟，4°C，15分钟，离心收集沉淀物；用73 %乙醇充分洗涤，12000转/分钟，4°C，10分钟，离心收集沉淀，自然干燥；
溶解加入灭菌水溶解沉淀，所得溶液即为纯化后的双链RNA样品。利用I. 2 %琼脂糖凝胶电泳检测双链RNA样品，分光广度计法测定核酸样品浓度，-25°C保存待用。上述的LB液体培养基为含10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化钠和50 μ g/ml氨苄青霉素的水溶液，pH为7. 4 ;
磷酸缓冲液为含8g/l氯化钠NaCl，O. 2g/l氯化钾KCl，I. 38g/l磷酸氢二钠Na2HPO4,
O.24g/l磷酸二氢钾KH2PO4的水溶液，pH为7. 4 ;
核糖核酸酶A缓冲液为含300mmol/L的醋酸钠NaAc，IOmmoI/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸Tris-HCl的水溶液，pH为8. O ;
酚氯仿溶液为PH 5. O的酸性饱和酚与氯仿按体积比I :1混合而成的混合液。
权利要求
1.一种双链RNA的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤 步骤(I).基因克隆利用PCR扩增的方法克隆目的基因分子； 根据目的基因分子的cDNA序列设计带有酶切位点的正向引物和反向引物；以目的基因分子的cDNA序列为模板，进行PCR扩增，克隆目的基因分子，得到PCR产物；PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析；采用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，得到纯化后的PCR产物； 步骤(2).载体构建利用PET-T7质粒构建含有目的基因片段的表达载体； 纯化后的PCR产物和pET-T7质粒分别用限制性内切酶进行双酶切，得到目的基因的酶切产物和PET-T7质粒的酶切产物；目的基因的酶切产物和PET-T7质粒的酶切产物用凝胶回收试剂盒纯化，得到纯化后目的基因的酶切产物和纯化后PET-T7质粒的酶切产物；利用DNA连接试剂盒连接纯化后目的基因的酶切产物和纯化后PET-T7质粒的酶切产物；将连接后的产物转入感受态细胞疋coli DH5 α中，涂板，30 37°C培养12 24小时；挑选阳性单菌落进行PCR检测，琼脂糖凝胶电泳分析；选取含有目的基因片段的阳性单菌落，测序分析插入基因片段序列的正确性，得到含有正确基因片段插入的单菌落； 步骤(3).载体转化 挑取经鉴定含有正确基因片段插入的单菌落，接种于LB液体培养基中，30 37°C条件下培养12 24小时，离心得到沉淀；利用小量质粒抽提试剂盒抽提沉淀菌体中的PET-T7表达载体，凝胶电泳检测抽提产物；将含有基因片段插入的PET-T7表达载体转化到表达型菌株疋coli HT115中，涂板培养，挑选阳性菌落进行PCR检测，凝胶电泳分析，选取含有目的载体的阳性菌落，保存待用；此处的含有目的载体的阳性菌落为携带PET-T7载体的B.coli HTl 15 单菌落； 步骤⑷.双链RNA的诱导表达 将携带PET-T7载体的疋coli HTl 15单菌落接种于LB液体培养基中，30 37°C条件下培养12 24小时；以1:20 1:50的比例扩大培养至OD6tltl=O. 4 I. O ;在LB液体培养基中加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷IPTG溶液，加至IPTG在LB液体培养基中的终浓度为O. 2 I. 0mmol/L,30 37°C诱导培养2 8小时；离心收集细菌沉淀，磷酸缓冲液漂洗，得到漂洗后的细菌沉淀，保存待用； 步骤(5).双链RNA的纯化 总RNA抽提取漂洗后的细菌沉淀，利用Trizol试剂盒提取漂洗后的细菌沉淀中的总RNA ； 变性将提取的总RNA溶解于核糖核酸酶A缓冲液中，80 90°C变性5 15分钟，得到变性溶液； 复性将变性溶液置于水浴中冷却至常温，使得变性溶液复性，得到复性后的溶液；酶切在复性后的溶液中加入核糖核酸酶A进行酶切，加至核糖核酸酶A在复性后的溶液中的终浓度为10 50 μ g/ml，在35 37°C条件下反应10 60分钟，去除单链RNA，得到酶切后产物，电泳检测酶切效果； 纯化在酶切后产物中加入与酶切产物等量体积的酚氯仿溶液，充分混匀，离心取上清液；在上清液中加入2 3倍上清液体积的无水乙醇，充分混匀，静置，沉淀双链RNA，离心收集沉淀物；用70 75 %乙醇充分洗涤，离心收集沉淀，自然干燥； 溶解加入灭菌水溶解沉淀，所得溶液即为纯化后的双链RNA样品；凝胶电泳检测双链RNA样品，分光广度计法测定核酸样品浓度，-30 -20°C保存待用。
2.如权利要求书I所述的一种双链RNA的制备方法，其特征在于步骤(3)和步骤(4)所述的1^液体培养基为含1(^/1胰蛋白胨，58/1酵母提取物，1(^/1氯化钠和5(^8/1111氨节青霉素的水溶液，pH为7. 4。
3.如权利要求书I所述的一种双链RNA的制备方法，其特征在于步骤(4)所述的磷酸缓冲液为含8g/l氯化钠NaCl，O. 2g/l氯化钾KCl，I. 38g/l磷酸氢二钠Na2HPO4,0. 24g/l磷酸二氢钾KH2PO4的水溶液，pH为7. 4。
4.如权利要求书I所述的一种双链RNA的制备方法，其特征在于步骤(5)所述的核糖核酸酶A缓冲液为含300 mmol/L的醋酸钠NaAc, 10 mmol/L的三轻甲基氨基甲烧盐酸Tris-HCl的水溶液，pH为8. O。
5.如权利要求书I所述的一种双链RNA的制备方法，其特征在于步骤(5)所述的酚氯仿溶液为pH 4. O 6. O的酸性饱和酹与氯仿按体积比O. 8:1 I. 2:1混合而成的混合液。
全文摘要
本发明公开了一种双链RNA的制备方法。现有体外制备siRNA的方法价格高，定制周期长，实验规模受限制。本发明方法首先利用PCR扩增的方法克隆目的基因分子；利用pET-T7质粒构建含有目的基因片段的表达载体；将含有基因片段插入的pET-T7表达载体转化到表达型菌株E.coliHT115中，选取含有目的载体的阳性菌落；接种于LB液体培养基中，加入IPTG诱导培养；抽提总RNA，溶解于RNaseA缓冲液变性，冷却复性，加入RNaseA酶切，去除单链RNA，纯化双链RNA，溶解沉淀，所得溶液即为纯化后的双链RNA样品。本发明制备方法简单，实施步骤快捷，操作重复性强，样品合成量不受限制。
文档编号C12N15/113GK102876677SQ20121036829
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者马文明, 俞炎琴, 庄浩瀚, 钱叶青, 杨劲树, 杨帆, 杨卫军 申请人:浙江大学舟山海洋研究中心