专利名称：一种小麦类燕麦b类蛋白基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个小麦类燕麦b类蛋白基因及表达载体，尤其涉及以该小麦基因构建的表达载体通过基因枪法转化到小麦中获得了转基因植株，对转基因植株分析显示该基因表达的蛋白主要对小麦面粉的强度有很明显的影响，属于分子生物学和基因工程领域。
背景技术：
小麦是世界上第一大粮食作物，各国政府和学者都非常重视小麦的加工品质改良。小麦加工品质主要是指杆粒磨粉品质和食品制作品质。食品制作品质是指小麦面粉与食品制作工艺相适应的性质，主要与麦皮的颜色、蛋白质含量、面筋的数量与质量等相关。而面筋强度是决定小麦的烘烤品质和蒸煮品质的重要因素。根据面筋强度，小麦可分为强 筋、中筋和弱筋小麦。一般认为，强筋小麦适宜烘烤面包，中筋小麦适于制作面条或馒头，而弱筋小麦适合做糕点。面筋强度是籽粒储藏蛋白赋予麦粉的独特性质，与籽粒储藏蛋白的数量和质量有关。小麦品种因含有不同数目与含量的HMW-GS而表现出面筋强度和加工品质的差异，即小麦HMW-GS的数量效应。然而，小麦HMW-GS主要是从质量上影响小麦加工品质，即小麦品种加工品质的优劣与其所含有的HMW-GS组成密切相关。利用品种、重组自交系、近等基因系比较和转基因功能鉴定的方法，已研究了多个HMW-GS的品质效应；对于多种面筋弹性、面筋强度和面包体积指标，三个位点贡献大小的顺序为Glu-Dl > Glu-Al > Glu-Bl，公认1Ax1、1Dx5和lDx5+lDylO等是强筋优质亚基。随着分子生物学的发展，分离优异HMW-GS新基因、应用转基因技术进行分子育种，已成为提高小麦面筋强度的重要手段之一。我国政府和学者对此都十分重视。由于HMW-GS亚基本身数目不多且存在基因沉默现象，所以发掘更多优质品质相关的基因是进行小麦加工品质改良的一条新的途径。国内外学者，一直在从不同角度，发掘新的品质基因；尤其是小麦类燕麦b类基因的发现，为深入研究品质形成的机理提供了契机。小麦类燕麦b类基因是只在小麦胚乳中特异性表达，在利用基因工程技术将小麦类燕麦b类基因转化到小麦中时，我们选择pLRPT载体为真核表达载体，该载体已经被国内外科学家成功用于小麦种子储藏蛋白的遗传转化的研究中(例如Patacchini. C. , Masci,S.，D’ Ovidio, R.，Lafiandra, D. ,2003. Heterologous expression and purificationof native and mutated low molecular mass glutenin subunits from durum wheat.Journal of Chromatography B，786，215-220. Tosi，P.，D，0vidio，R.，Napier，J. A.，Bekes，F. , Shewry, P.R.,2004.Expression of epitope-tagged LMW glutenin subunits in thestarchy endosperm of transgenic wheat and their incorporation into gluteninpolymers. Theoretical and Applied Genetics 108. 468-476. He，G. Y.，Jones，H. D.，D’ Ovidio，R.，Masci, S.，Chen, M. J.，West, J.，Butow, B.，Anderson，0. D.，Lazzeri, P.，Fido，R.，Shewry, P. R. ,2005. Expression of an extended HMW subunit in transgenicwheat and the effect on dough mixing properties. Journal of Cereal Science 42，225-231.等)。该载体含有胚乳特异性表达启动子1Dx5和花椰菜花叶病毒终止子CaMV35S，启动子和终止子之间含有多克隆位点。目的基因插入到1Dx5启动子和CaMV 35S终止子之间，能够在小麦胚乳中特异性表达。小麦是世界第一大粮食作物，利用基因工程技术改良小麦品质具有重大的应用前景，新的小麦储藏蛋白类燕麦b类蛋白基因功能的研究，不仅可以评价类燕麦b类蛋白基因的育种的利用价值，并且可以加深对小麦加工品质形成机理的认识，并且为小麦品质改良的研究提供更加优良的候选基因。
发明内容
本发明的任务是提供一种小麦类燕麦b类蛋白基因，该基因可用于增强小麦面粉的强度。 本发明的又一个任务是提供含有小麦类燕麦b类蛋白基因的表达载体，和含有该表达载体的工程菌，以及转化有该表达载体的单子叶植物。本发明提供的表达载体可用于制备转基因植物和植物育种。本发明的另一个任务是提供获得高强度小麦品种的转基因植物的方法。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种小麦类燕麦b类蛋白基因，具有序列表中SEQ ID No. I所示的核苷酸序列或具有与序列表中序列I所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。本发明还提供了含有上述小麦类燕麦b类蛋白基因的表达载体，和含有该表达载体的工程菌，以及转化有该表达载体的单子叶植物，所述工程菌可为大肠杆菌DH5a，所述的单子叶植物为小麦，所述的小麦具体可为郑麦9023。本发明提供的表达载体可用于制备转基因植物和植物育种。本发明提供的获得高强度小麦品种的转基因植物的方法，包括以下步骤步骤a :将权利要求2或3所述的表达载体转化植物细胞或组织，如将表达载体导入植物幼穗的盾片；步骤b :从步骤a的获得的转基因阳性植株的后代中筛选出稳定转化的植物种植获得的转基因植株，利用PCR和SDS-PAGE的方法筛选出稳定表达，并且不再出现基因分离的阳性植株后代。上述步骤a所述的将权利要求2或3所述的表达载体转化植物细胞或组织的具体方法是(I):选取开花后12 17天的幼嫩种子，经70%乙醇消毒30s和0. I % HgCl2杀菌消毒后，在超净工作台上解剖幼胚剥离盾片组织；(2):利用基因枪转化法将权力要权利要求2的重组载体转化到盾片组织中；(3):利用PCR的方法通过扩增CaMV 35S终止子序列来获得转基因阳性的植株。本发明利用PCR方法从普通小麦品种郑麦9023 (Triticum aestivum L. cvZhengmai 9023)中克隆出4种不同序列的类燕麦b类蛋白基因，分别编号为HM027635、HM027636、HM027637和HM027638，并分别进行转基因验证其功能，通过与对照组相比，发现转化了其中一个类燕麦b类蛋白基因(编号为HM027638)的转基因植株的面粉强度明显增强了，由此初步证明了类燕麦b类蛋白基因与小麦的品质有关。
本发明的一方面涉及一个对小麦面粉强度有影响的蛋白质序列，所述蛋白序列由SEQ ID No. I所示的核苷酸序列编码，即类燕麦b类蛋白基因。本发明的类燕麦b类蛋白基因来源于普通小麦郑麦9023 (Triticum aestivum L. cv Zhengmai 9023),基因长度为855bp，开放阅读框从核苷酸第19-284位，含有18个半胱氨酸残基。本发明的另一方面涉及重组表达载体，其特征在于所述表达载体含有本发明所述的核苷酸序列，所述重组表达载体可以通过基因枪转化法将上述核苷酸序列插入表达载体而得到。本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何载体，适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，例如pBI121，pAHC25，pGEM，pLRPT等。本发明的一个实施方案中，所述的表达载体优选pLRPT-avel表达载体。本发明的还一方面涉及一种单子叶植物愈伤组织，其特征在于能够经过再分化能形成再生植物，所述愈伤组织可以作为基因枪转化重组表达载体的外植体。本发明的还一方面涉及一种转基因植物，本发明的核苷酸序列所编码的蛋白质能 在所述转基因植物中能够稳定表达。本发明的还一方面涉及一种改善小麦面粉强度的方法，所述方法包括通过基因枪转化法将本发明重组表达载体转化入植物，使本发明的核苷酸序列所编码的蛋白能够在转基因植株的种子中稳定表达。所述方法包括用本发明的核苷酸序列转化到单子叶植物的愈伤组织的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物愈伤组织的转化含有本发明的核苷酸序列的表达载体。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物愈伤组织的转化过程中利用前述的表达载体。在本发明的一个具体实施方案中，所述单子叶植物的愈伤组织为郑麦9023愈伤组织。本发明的还一方面涉及一种改善小麦面粉强度的转基因植株获得的方法，该方法是利用基因枪法将本发明的重组真核表达载体利用基因枪法转化入植物愈伤组织，利用组织培养的方法使所述愈伤组织经分化再生成植株。在本发明中，所述植物优选是单子叶植物，本申请实施例具体涉及的单子叶植物为郑麦9023。在本发明中，所述的小麦面粉品质改善是指对照和转基因植物在相同的环境生长收获的种子磨成的面粉，用Mixograph检测，转基因植株的面粉的强度和耐揉性得到显著性的增强。该类基因的克隆扩大了小麦品质研究的基因资源，并且为小麦品质改良的研究提供更加优良的候选基因，具有非常重要的经济效益。
图I显示的是从小麦中分离出类燕麦b类蛋白基因的流程图。图2显示的是PCR扩增类燕麦b类蛋白基因序列凝胶电泳图。泳道1-9为扩增类燕麦b类蛋白基因；泳道10为Markerlll。有图中可以看出，扩增的条带比较亮，目标条带大小为855bp。图3显示的是在NCBI上蛋白质序列预测网站http://www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/gorf/,预测的类基因所表达的蛋白质序列。用口标志的氨基酸残基为半胱氨酸残基。1-18个氨基酸序列为信号肽，成熟的蛋白由266个氨基酸组成，含有18个半胱氨酸残基。
图4 显不的是在二硫键预测网站 http://www. ics. uci. edu/ baldig/scratch/explanation, html上预测的二硫键位置。数字表示半胱氨酸残基在成熟蛋白上的位置，S_S表示分子内二硫键，*表示分子间二硫键。由图可知，该类蛋白所含的18个半胱氨酸残基中，14个半胱氨酸残基参与形成分子内二硫键，4个半胱氨酸残基参与形成分子间二硫键。图5显示是类燕麦b类蛋白氨基酸序列比对，☆表示半胱氨酸残基；Sig :信号肽；N-ter :N-末端；C_ter :C_末端；-:一致的残基；a. j :牡山羊草；a. t :钩刺山羊草；h. V :大麦；o. s :水稻；t. a :普通小麦;t.m 一粒小麦；t. t :圆锥小麦。图6显示的是表达载体pLRPT-avel菌落PCR电泳图。泳道I为Marker III ;泳道2为阳性对照；泳道3-16为检测样品。扩增出条带为阳性菌落，未扩增出条带为阴性菌落。
图7显示的是转基因小麦的组织培养过程，其中A :轰击平板中的盾片B :诱导愈伤C :愈伤组织D、E :开始分化的愈伤组织F :分化一周的培养物G、H :分化四周的培养物I、J、K :瓶中的再生苗L、M、N、O、P、Q :土培中的再生苗R :再生植株的穗。图8显示的是转基因小麦的PCR检测图，其中I :Marker I 2 :质粒阳性扩增3 :H20对照4 5 :空白基因组阴性对照，泳道6、7、8、IO、13、15、18、19为转基因阳性植株，其余为转基因阴性植株。图9显示的是转基因和非转基因植株种子的总蛋白SDS-PAGE检测图，其中M为蛋白质Marker，I为郑麦9023的总蛋白，2和3为转基因植株M3的总蛋白。箭头I所指的方向为目的蛋白增加的地方，由图可知，和野生型郑麦9023相比转基因植株M3中目的蛋白明显的增加。图10显示的是郑麦9023对照和转基因小麦的Mixograph图。A图为郑麦9023对照的Mixograph检测记录图，B图为转基因植株M3的Mixograph检测记录图。由图可知，转基因植株面粉强度明显增强。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例I.小麦类燕麦b类蛋白基因的分离小麦类燕麦b类蛋白基因的分离流程如图I所示，具体步骤如下(I)RNA的提取采用土培法通过浇灌营养液在室内种植郑麦9023，白天28°C晚上20°C，每天光照12小时，空气湿度70%。郑麦9023幼苗长出4_6片叶子时，剪取适量叶片，按照TIANGEN公司RNA提取试剂盒说明说提取郑麦9023的总RNA。(2)第一条链的合成取2yg总RNA，加入5X反应缓冲液4微升(yL)，10毫摩(mM)脱氧核糖核酸(dNTP)2yL，核糖核酸酶抑制剂(40-200 μ g/μ L) O. 5 μ L，引物OligodT (I μ g/ μ L) I μ L，反转录酶(IOU/ μ L) 2 μ L，42°C反应 60 分钟，85°C放置 10 分钟终止反应，稀释至200 μ L。(3)基因的分离根据类燕麦b类蛋白基因两端的保守序列，设计引物，前人研究表明类燕麦b类蛋白基因的5'区序列非常的保守，编码的氨基酸序列与储藏蛋白的信号肽序列高度一致，3'区序列同样也较为保守。所以可以根据Genbank中已经报道的类燕麦b类蛋白基因序列设计引物。用引物设计软件primer premier 5. O设计了引物。引物1:5' -ATGAAGGTCTTCATCCTGGCTC-3'引物2:5' -CTAGCACGCACCACCAGTGTAG-3'。为了保证实验的准确性，基因的克 隆与载体构建均采用高保真的PfuDNApolymerase,反应体系如下2· 5 μ LlOXTaq buffer, I μ LMgCl2,1 μ LdNTP Mixture, I μ L引物 I, I μ L引物 2，0· 25 μ L Taq polymerase,O. 5 μ L cDNA，补充无菌双蒸水至 25 μ L。PCR反应程序先95°C预变性5min，然后94°C lmin，54°C lmin，72°C Imin，35个循环后，于72 °C继续延伸反应lOmin。如图2所示，经PCR获得了 855bp的类燕麦b类蛋白基因序列。(3)基因测序取8 μ LPCR产物与pMD18_T载体进行连接，操作步骤按Takara公司产品PMD18-T Vector system说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌TOP 10菌株，在表面涂5_溴_4_氯_3_ Π引哚-β -D-半乳糖苷和X-gal的含氨节青霉素(50 μ g/ml)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜，测序工作在北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行。(4)蛋白序列预测根据测序的序列在NCBI上蛋白质序列预测网站http://www.ncbi. nlm. nih. gov/projects/gorf/上预测该类基因所表达的蛋白质序列，预测的蛋白序列如图3所示。将预测的蛋白质序列在二硫键预测网站http://www. ics. uci. edu/ baldig/scratch/explanation, html上预测该类蛋白的二硫键位置，该类蛋白的二硫键预测结果如图4所示，该类蛋白含有18个半胱氨酸残基，预测其中14个半胱氨酸残基形成7对分子内二硫键，4个半胱氨酸残基形成4个分子间二硫键。(5)蛋白序列同源性比较把测序的结果利用NCBI进行BLAST比对分析，结果表明，克隆序列与大麦(Hordeum vulgare)类燕麦b类蛋白基因家族成员相似性最高,介于99. 4% -99. 6%;与山羊草(Aegilops triuncialis、Ae. juvenalis)类燕麦b类蛋白基因相似性介于96. 3% -96. 7%;与一粒小麦(T. monococcum)、普通小麦(Triticum aestivum)的类燕麦b类蛋白基因家族成员相似性介于93. 9%-95. 8%;与水稻(Oryza sativa)的类燕麦b类基因家族成员相似性接近于93%。而与小麦其它类型的储藏蛋白，如低分子量谷蛋白(low molecular weight glutenin, LMW—GS)、高分子量谷蛋白(high molecular weightglutenin, HMW-GS)及醇溶蛋白(α-、β-、、-、ω -gliadin)的相似性均在40%以下。同源性分析结果如图5所示。实施例2.真核表达载体的构建根据分离出的类燕麦b蛋白基因序列，设计并合成引物3和引物4来分离类燕麦b类蛋白基因序列，为后期载体构建的便利，分别在引物5’端加上限制性内切酶Sac I位点和Bam H I位点(下划线表示酶切位点)引物3:5' -CGCTGTCGAC ATGAAGGTCTTCATCCTGGCTC-3'引物4:5' -TCGAGGATCC CTAGCACGCACCACCAGTGTA-3'反应体系如下2·5 μ LlO X Taq buffer, IuL MgCl2,1 μ L dNTP Mixture, I μ L 引物 I, I μ L 引物2,0. 25 μ L Taq polymerase, 0. 5 μ L cDNA,补充无菌双蒸水至 25 μ L15PCR反应程序先95°C预变性5min，然后94°C lmin，54°C lmin，72°C lmin，35个循环后，于72°C继续延伸反应lOmin。PCR产物经DNA胶回收试剂盒(TIANGEN公司)回收，用Sac I和BamH I限制性内切酶分别酶切PCR产物和pLRPT载体，然后纯化后，将PCR产物和pLRPT载体在16°C下连接过夜，重组的载体含有类燕麦b类蛋白基因序列，命名为pLRPT-avel，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，在含有氨苄青霉素(终浓度50 μ g/ml)的LB固体培养基上过夜培养。挑选LB平板上的单菌落，进行PCR验证，引物序列为引物3和4。PCR结果见图6所示，所挑选的14个菌落中有12个为阳性克隆菌，含有目标类燕麦b类蛋白基因片段，选取阳性克隆送去北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序验证，测序结果正确的用于实施例3。实施例3.将重组表达载体pLRPT-avel通过基因枪法转化到小麦中(I)基因枪转化采用基因枪转化技术，将重组真核表达载体pLRPT-avel转入小麦未成熟种子的盾片中，转化方法参照Cong等[Cong L, Wang C, Chen L, Liu H, Yang G,He G(2009)Expression of phytoene synthasel and carotene desaturase crtl genesresult in an increase in the total carotenoids content in transgenic elite wheat (Triticum aestivum L.). J Agric Food Chem 57 :8652-8660]。剥取小麦未成熟种子，经70%乙醇和O. I % HgCl2杀菌消毒后，在超净工作台上从未成熟种子中剥离盾片组织，置于含诱导培养基MSSP2平皿的中央位置，每皿约放50个盾片待基因枪轰击。用质粒抽提试剂盒(天根生化科技公司)抽提高纯度的pLRPT-avel质粒，经金粉包裹后，利用基因枪轰击小麦盾片。(2)植株再生小麦盾片经轰击后在诱导培养基上分散培养，避光培养3-4周后获得愈伤组织。接着转入分化培养基中光照培养3-4周，获得再生小苗植株。然后将再生小麦转入生根培养基中促使其生根。最后将生根良好的小麦植株转入土中，在温室中进行培养至成熟，小麦基因枪轰击后的组织培养如图7所示。实施例4.对实施例3中获得的再生植株小麦进行分子检测对实施例3中获得的转基因小麦进行分子检测，以便筛选出阳性转基因小麦，检测方法主要有PCR检测。PCR检测根据pLRPT-ave I载体设计检测引物5和6，引物5 :5，-CGCTGAAATCACCAGTCT-3 ’引物6 :5，-TCCTTCCTTCCGTCCACT-3 ’以Ttl代小麦植株的基因组DNA为模板，进行PCR检测，扩增片段为417bp。反应体系如下2. 5μ L IOXTaq buffer, I μ L MgCl2,1 μ L dNTP Mixture, I μ L 引物 1，I μ L 引物2,0. 25 μ L Taq polymerase, 0. 5 μ L cDNA,补充无菌双蒸水至25 μ L。PCR反应程序先95°C预变性5min，然后94°C lmin, 64. 1°C lmin, 72°C lmin，35个循环后，于72°C继续延伸反应lOmin。结果如图8所示，240株再生植株中有20株为阳性转基因材料。实施例5.对实施例4中获得的转基因小麦进行蛋白表达情况的检测将实施例4中获得的转基因阳性材料结的种子切去半粒，磨成粉，用蛋白提取液提取种子的总蛋白(按照25 μ L/mg的比例添加蛋白提取液)，通过不连续的SDS-PAGE检测目的蛋白在转基因株系中的表达情况，如图9所示，转基因植株M3中的目的蛋白稳定表达，并且和对照植株相比，表达量明显增加。实施例6.利用Mixograph检测技术对实施例5中鉴定的转基因小麦进行功能分析揉混仪(Mixograph)是一种国际上普遍使用的小麦粉品质检测仪器，它通过测试小麦粉面团搅拌过程中的流变学特性进而评价小麦品质，具有测析速度快，面粉使用剂量小以及同烘焙实验相关性好等优点。本发明将获得的转基因植株的种子(编号为M3)和对照植株的种子分别磨成面粉，用IOg-Mixograph进行检测，每个样三次重复，转基因植株和对照的Mixograph结果如图10所示。与小麦品质密切相关的Mixograph图记录的参数主要包括有 MT(min)，PR (arbitrary units, AU)，BffPR(AU)，RBD (% )，MBff(AU)和 MRff(AU)相关，各参数的数据如表I所示表I. Mixograph检测的参数表·PlowMTuiIiH)PR i.VPiRW) Λ.>HWI'R Al*!MRWtA!') MBWιΑΓ
M3345J ±ti,~8bJ4J4+0JTI 2 .44±0J5b 18JS±0J<Sb 31 3±1.2 li
MjS3 土4(. Ι οο' !1344i> 4 <->； ^ ·'. 4Sb , — ± rb ■)! 土 3
aienpnai 9023 > 4 + < 40 14；.=Γ 2 = (-43.) 1862 + lJla
LSD0.05NS2 0'IJ81825.9 7.44LSD :在P = 0· 05水平上的最小显著差异参数MT和PR与面粉Strength (弹性或强度)呈正相关，表I中的数据显示转基因株系(M3)这2个参数都是增加的，转基因植株的PR与对照相比，达到了显著性增加，转基因植株的MT和对照相比，虽然没有达到显著性增加，但是也增加了，由此可知和野生型植株相比转基因株系面粉的弹性或强度显著性增加，并且达到了显著性水平。参数RBD和面粉的稳定性呈负相关，由表I可知转基因植株的RBD显著性减少，和对照相比，转基因小麦面粉的耐揉性相对提高了。参数BWPR，MRW和MBW与面粉的extensibility (延展性)呈正相关，由表I可知转基因小麦的BWPR，MRff和MBW相对野生型都增加了，转基因小麦面粉的extensibility (延展性)增加。由上述对Mixograph检测记录的参数分析可知,本发明的类燕麦b类蛋白的基因对小麦品质是有影响的，特别是对小麦面粉的强度影响最显著。郑麦9023转基因株系中，由于类燕麦b类蛋白的超表达，使面粉的弹性和耐揉性明显增加，使面粉的品质得到了改
盡
口 οSEQUENCE LISTING〈110〉华中科技大学〈120〉一个小麦类燕麦b类蛋白基因的克隆及其用途〈130〉<160>11<170>PatentIn version 3. 3〈210〉I<211>855<212>DNA
〈213〉小麦(Triticum aestivum L.)〈220〉<221>gene〈222〉(I) ·· (855)〈400〉Iatgaaggtct tcatcctggc tctcctcgcc ctcacagcaa ccaccgccat tgcccagttg 60gaaaccacat gtagccaggg ctttggacaa tcccaacaac aacaacaacc tggtcaacga 120cagttgctgg agcagatgaa gccgtgtgtg gcattcctgc aacaaaagtg tagcccactg 180agaatgccat tcctccggac acaagtcgag caacttagca gctgccagat cgtgcaatac 240caatgctgcc agcagttggc gcagatccca gagcgaaccc ggtgccatgc catccacatc 300gtggtagagg ctatcattca acaacaatcc caacaacaat ggcaggggcc ccaacagcaa 360gcactacatt agagcatgag gatgttgctt gagaacctat cattgatgtg caacatctac 420gccccggtac aatgccagca gcaacgacaa ctggggcaac aacaacaaca acagttgcag 480gagcagttga caccgtgcac gacattcctg caacagcagt gtagcccagt gacagtgcca 540ttcccccaga taccgatgga tcagcctacc agctgccaaa atgtgcagca ccaatgttgc 600cgacagctat cacagatccc agagcaattc cgttgccaag ccatccacaa cgtggcggag 660gctatcaggc aacaacaacc ccaacaacaa tggcagggta tgtaccagcc ccagcagcca 720gcacaacttg agagcattag gatgtcgctt caggccctgc ggtcgatgcg tagcatctac 780atttggctga cgcaagtccg ttgttgaaaa acggagccca aaacaactca cggaagagag 840ggtggtgcgt gctag855<210>2<211>22<212>DNA〈213〉人工序列<400>2atgaaggtct tcatcctggc tc22<210>3<211>22<212>DNA〈213〉人工序列<400>3Ctagcacgca ccaccagtgt ag22<210>4<211>32<212>DNA〈213〉人工序列<400>4cgctgtcgac atgaaggtct tcatcctggc tc32<210>权利要求
1.一种增强小麦面粉强度的小麦类燕麦b类蛋白的基因,具有序列表中SEQ ID No. I所述的核苷酸序列或具有与序列表中序列I所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.—种表达载体,其特征在于,它含有权利要求I所述的基因。
3.—种表达载体,其特征在于,它由权利要求I所述基因与载体pLRPT-avel构成。
4.ー种含有权利要求2或3所述表达载体的工程菌，所述工程菌为大肠杆菌DH5a.
5.一种转化有权利要求2或3所述表达载体的单子叶植物，所述的单子叶植物为小麦。
6.根据权利要求5所述的单子叶植物，其特征在于，所述的小麦为郑麦9023。
7.权利要求2或3所述的表达载体在制备转基因植物或植物育种中的应用。
8.—种转基因植物，其特征在干，该转基因植物转化有权利要求2或3所述的表达载体。
9.权利要求I所述基因用于增强小麦面粉的強度。
10.一种获得高強度小麦品种的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤 步骤a :将权利要求2或3所述的表达载体转化植物细胞或组织； 步骤b :从步骤a的获得的转基因阳性植株的后代中筛选出稳定转化的植物种植获得的转基因植株，利用PCR和SDS-PAGE的方法筛选出稳定表达，并且不再出现基因分离的阳性植株后代。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在干，步骤a所述的将权利要求2或3所述的表达载体转化植物细胞或组织的具体方法是(I):选取开花后12 17天的幼嫩种子，经70%こ醇消毒30s和0. I %HgC12杀菌消毒后，在超净工作台上解剖幼胚剥离盾片组织；(2):利用基因枪转化法将权カ要权カ要求2的重组载体转化到盾片组织中；(3):利用PCR的方法通过扩增CaMV 35S終止子序列来获得转基因阳性的植株。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在干，步骤a具体是将权利要求2或3所述的表达载体导入植物幼穗的盾片。
13.一种转化有权利要求2或3所述的表达载体的单子叶植物愈伤组织，所述单子叶植物愈伤组织为郑麦9023愈伤组织。
全文摘要
本发明提供了一种小麦类燕麦b类蛋白基因及其用途，以及转化有类燕麦b类蛋白基因的转基因植物。该小麦类燕麦b类蛋白基因具有改善小麦面粉强度的作用。经实验证明，该类蛋白在转基因植株中的表达量明显增强，小麦面粉的强度得到很大提高。该类基因的克隆扩大了小麦品质研究的基因资源，并且为小麦品质改良提供更加优良的候选基因。
文档编号C12N15/29GK102952811SQ20121040061
公开日2013年3月6日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者何光源, 杨广笑, 马凤云, 汪越胜, 李淼, 李婷婷, 刘威 申请人:华中科技大学