专利名称：来源于新疆野苹果的启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于新疆野苹果的启动子及其应用。
背景技术：
启动子(Promoter)是基因组基因的一个重要组成部分，它像“开关”一样，在转录水平上基本决定其控制下的编码基因是否表达、何时表达、何处表达和表达强度。一般根据启动子作用方式和功能将其大体可以分为三大类组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子(王关林，方宏筠，2002，植物基因工程原理与技术(第二版)，北京，科学技术出版社)。但这种分类不是绝对的，在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性，例如，诱导增强性组成型启动子(肖兴国等，发明专利号200710177962. 4)。 组成型启动子(Constitutive promoter)是指能够驱使其控制下的编码基因在不同器官和/或组织大体恒定表达的一类启动子。它的特点是受其控制的编码基因的表达具有持续性，但不具有时空特异性；RNA和蛋白质表达量相对恒定，不受外界因素的诱导。例如:花椰菜花叶病毒 35S 启动子 CaMV35S (Odell et al. , Nature, 1985，313:810-812)、玉米 Ubiquitin 启动子(Holtorfet al. , Plant Mol. Biol. , 1995, 29:637-646)和水稻的Actinl 启动子(McElroy et al, 1990, Plant Cell, 2:163-171 )0诱导型启动子(Inducible promoter)是指能够响应某些特定的物理、化学和生物信号(统称为“诱导子”或“诱导因子”)而驱动其控制的编码基因大幅度地增加转录水平的一类启动子。诱导型启动子常常根据其诱导信号来分类和命名，例如真菌诱导启动子、共生细菌诱导启动子、化学诱导启动子、金属离子诱导启动子、光诱导启动子、热诱导启动子和创伤诱导启动子等。器官和/或组织特异性启动子(Organ-and/or Tissue-specific promoter),能够驱使其控制下的编码基因仅仅在生物体的某一或某些特定的器官和/或组织，或者仅仅在生长发育的某一或某些特定阶段表达的一类基因。它的特征为，受其控制或调节的基因表达具有明显的时空性，并往往表现出发育调节的特性。例如，植物上的根特异性启动子、叶片特异性启动子、花特异性启动子、气孔特异性启动子、气孔绒毡层特异性启动子、花粉特异性启动子、果实特异性启动子、种子特异性启动子、胚乳特异性启动子、棉花纤维特异性启动子和韧皮部特异性启动子等等。在自然环境中，植物生长在开放的系统中，经常会遇到冷、热、旱、涝、盐碱、大气污染等不良环境的影响。不良环境作用于植物，将会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应，表现为代谢和生长的可逆性抑制，严重时甚至引起不可逆伤害，导致整个植株死亡。在各种环境胁迫中，干旱、低温、高热和高盐等非生物胁迫对植物的影响尤为突出，表现为不同程度地对植物体内水分状况的影响，因此又成为水分胁迫，是制约植物生长和农作物产量的最主要非生物性逆境因子。植物在长期的进化中，逐渐形成了一系列应答逆境胁迫的生理、代谢以及防御系统。从植物中克隆非生物逆境诱导启动子将为提高植物对非生物胁迫的抗性奠定物质基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供植物组织特异性及非生物胁迫诱导启动子。本发明所提供的启动子，名称为MsDREB2C基因启动子，来源于新疆野苹果(Malussieversii (Ledeb. ) Roem.),是如下 a)、b)、c)或 d)的 DNA 分子a)核苷酸序列是SEQ ID No.1的第9-1325位的DNA分子；b)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；c))与a)或b)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上一致性，且具有启动子功能的DNA片段；d)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片 段。上述75%或75%以上一致性，可为80%、85%、90%、95%以上的一致性。上述严格条件可为用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC，O. 1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。其中，SEQ ID No.1由1339个核苷酸组成，第1_8位为EcoR I识别位点及保护碱基，第1326-1330位为β -葡萄糖醛酸酶基因(⑶S)编码序列中的前5个碱基，第1331-1339位为Bgl II识别位点及保护碱基。含有MsDREB2C基因启动子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。所述含有MsDREB2C基因启动子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达目的基因的DNA,该DNA不但包括启动所述目的基因的MsDREB2C基因启动子,还可包括终止所述目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。所述转录终止子包括但不限于农杆菌胭脂碱合成酶终止子(N0S终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如=Odell等人(I985)Nature 313:810 ；Rosenberg 等人(1987)Gene, 56:125；Guerineau 等人(1991)Mol. Gen.Genet, 262:141;Proudfoot(1991)Cell, 64:671;Sanfacon 等人 Genes Dev. , 5:141;Mogen等人(1990)Plant Cell, 2:1261 ;Munroe 等人(1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人(1989)Nucleic Acids Res. 17:7891 Joshi 等人(1987)Nucleic Acid Res.，15:9627)。所述的含有MsDREB2C基因启动子的重组载体具体可为在pCAMBIA1301的EcoR I和Bgl II插入MsDREB2C基因启动子得到的重组载体。所述重组微生物具体可为细菌，酵母，藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产喊菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。扩增MsDREB2C基因启动子全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。实验证明，MsDREB2C基因启动子可启动目的基因在植物的根、叶和/或种子中特异表达。所述启动目的基因在植物的根中特异表达具体可为启动目的基因在根的维管组织中特异表达，所述启动目的基因在植物的叶中特异表达具体可为启动目的基因在叶的维管组织中特异表达。实验证明，MsDREB2C基因启动子可在非生物胁迫诱导下启动目的基因在植物的叶、根和/或种子中特异表达；所述非生物胁迫为热胁迫、冷胁迫、干旱胁迫和/或ABA胁迫。MsDREB2C基因启动子可用于培育转基因植物，该转基因植物可在根、叶和/或种子中特异表达目的基因，也可在非生物胁迫诱导下增加目的基因的表达量。上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，如烟草。所述转基因植物理解为不仅包含将目的基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术 将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。本发明的MsDREB2C基因启动子为组织特异和逆境诱导型启动子。利用MsDREB2C基因启动子可以使基因在特定组织器官和诱导条件下表达，因而避免了组成型启动子过量表达带来的负作用-产生大量的异源蛋白和有毒物质，为基因工程育种提供新的途径。
图1为pCAMBIA1301_MsDREB2CP酶切验证电泳图谱。M 为 DNA Marker III，1，2，3，4 为 pCAMBIA1301_MsDREB2CP 酶切结果。图2为pCAMBIA1301-MsDREB2CP转基因植株的PCR鉴定图谱。M 为 DNAMarker III，1，2 为 pCAMBIA1301_MsDREB2CP 转基因株系。图3为pCAMBIA1301-MsDREB2CP转基因烟草的⑶S组织化学染色。根(A，B)，茎(C，D)，叶(E，F)，种子(G)，果实(H，J)，花(I)，花蕊(K)。pCAMBIA1301-MsDREB2CP转基因烟草在营养土中长至高约20厘米后用来染色分析(A，B，C，D，E，F)。当植株开花结果后，进一步⑶S染色分析(G，H，I，J，K)。比例尺=0. 2厘米(A，B);0.5厘米((，04，卩，6，!1，I，J) ;150 微米(K)。图4为pCAMBIA1301-MsDREB2CP转基因烟草在非生物胁迫下的⑶S相对活性。误差线代表3次重复的标准差。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，Prybest DNA 聚合酶、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、RNase-Free DNase1、限制性内切酶EcoR I与Bgl II，T4DNA连接酶，购自TAKARA公司。DNAMarker购自中科瑞泰北京生物技术有限公司。氨苄青霉素、硫酸卡钠酶素、利福平、潮霉素、β -葡萄糖醛酸酶、5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖苷酸，4-甲基伞形酮购自北京新经科生物技术有限公司。DNA快速提取试剂盒，离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购，离心柱型质粒小量提取试剂盒购自北京博大泰恒生物技术有限公司。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105购自北京博大泰恒生物技术有限公司。双元植物转化载体pCAMBIA1301 (购自北京博大泰恒生物技术有限公司)(载体登录号AF234297。珊西烟(Nicotiana tabacum varXanthi nc)(孙凤成雷新云.耐病毒诱导剂88-D诱导珊西烟产生PR蛋白及对TMV侵染的抗性.植物病理学报.1995年第04期)公众可从中国农业大学获得，以重复本申请实验。实施例l、MsDREB2C基因启动子的克隆及转基因载体的构建一、MsDREB2C基因启动子的克隆以新疆野苹果(Malus sieversii (Ledeb. ) Roem.)水培苗为材料,提取其叶片DNA,以DNA为模板，在5'非编码区设计特异引物扩增新疆野苹果MsDREB2C基因启动子。引物序列如下
权利要求
1.如下a)、b)、c)或d)的DNA分子a)核苷酸序列是SEQID No.1的第9-1325位的DNA分子；b)核苷酸序列是SEQID No.1的DNA分子；c))与a)或b)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上一致性，且具有启动子功能的 DNA片段；d)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。
2.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒或重组载体。
3.含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物。
4.含有权利要求1所述DNA分子的转基因细胞系。
5.扩增权利要求1所述的DNA分子全长或其任一片段的引物对。
6.权利要求1所述的DNA分子作为启动子的应用。
7.权利要求1所述的DNA分子启动目的基因在植物的根、叶和/或种子中特异表达的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述启动目的基因在植物的根中特异表达为启动目的基因在根的维管组织中特异表达，所述启动目的基因在植物的叶中特异表达为启动目的基因在叶的维管组织中特异表达。
9.权利要求1所述的DNA分子非生物胁迫诱导下启动目的基因在植物中表达的应用； 所述非生物胁迫为热胁迫、冷胁迫、干旱胁迫和/或ABA胁迫。
10.权利要求1所述的DNA分子在培育转基因植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了来源于新疆野苹果的启动子及其应用。该启动子，是如下a)、b)、c)或d)的DNA分子a)核苷酸序列是SEQ ID No.1的第9-1325位的DNA分子；b)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；c))与a)或b)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上一致性，且具有启动子功能的DNA片段；d)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。该启动子为组织特异和逆境诱导型启动子。利用MsDREB2C基因启动子可以使基因在特定组织器官和诱导条件下表达，因而避免了组成型启动子过量表达带来的负作用—产生大量的异源蛋白和有毒物质，为基因工程育种提供新的途径。
文档编号C12N1/15GK102994502SQ20121051628
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者李天红, 赵凯, 沈欣杰, 廖雄, 刘琳琳, 王琪 申请人:中国农业大学