专利名称：一种与脑血管狭窄有关的ⅰ型神经纤维瘤nf1基因突变核苷酸序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与脑血管狭窄有关放入核苷酸序列，具体涉及一种与脑血管狭窄有关的分离自I型神经纤维瘤NFl基因的突变核苷酸序列及其在脑血管狭窄诊断中的应用，属于疾病诊断领域。
背景技术：
脑血管狭窄是危害人类健康的常见病，可导致高致残率、高致死率的缺血性脑卒中。其发病机制不完全清楚，从而使脑血管狭窄的防治陷入“瓶颈”。目前，尽管随着脑卒中I级预防、2级预防知识的普及，动脉支架、颈动脉内膜剥脱及颅内外动脉搭桥技术的应用，部分患者的脑缺血症状得到缓解，致残率、致死率在一定程度上得到控制，但由于脑血管狭窄的发病原因、发病机制尚不完全清楚，而目前针对脑血管狭窄的防治仅仅处于疾病下游水平，其结果是治标不治本。同时近年来脑血管狭窄的发病率越来越高，发病年龄越来越趋于年轻化，而且常常找不到发病诱因，所以基因水平寻找到脑血管狭窄的发生机制，从根本上降低该病的发生率，是防治脑血管狭窄的新的突破口之一。近年来，Nfl基因与血管性疾病的关系正在成为新的研究热点，但Nfl基因突变位点多变、类型不定，突变与脑血管狭窄之间的关系尚不明确。NFl是一种常见的常染色体显性遗传病，病因明确，即由17号染色体上的Nfl基因突变所致。在自然人群中的发病率约为1/3500，20°/Γ60%有家族史，发病无明显的性别差异。临床表现主要为累及全身皮肤的多发性神经纤维瘤，同时NFl还可累及多个器官系统，发生肾动脉狭窄、脑血管狭窄、视神经胶质瘤、脊柱侧凸、椎管内或颅内肿瘤等。1989年，Nfl基因被定位于人类染色体17qll.2，并于1990年克隆出该基因。Nfl基因是人类基因组中较大的基因，全长350kb，含60个外显子，其转录部分的长度约ll-13kb。NFl基因在Genbank的登录号为NM_00104 2492. 2。从功能上来看，Nfl基因是抑癌基因，其编码的由2838个氨基酸组成的蛋白质即神经纤维瘤蛋白(neurofibromin)是一种肿瘤抑制物，在机体多个组织与器官均有表达，如平滑肌细胞、血管内皮细胞及施旺细胞。神经纤维瘤蛋白的主要功能域(GAP-related domain, GRD)由第21_27a外显子编码，与GTP酶激活蛋白家族有同源性，能够激活体内的Ras-GTPase，导致结合状态的GTP水解，Ras失活，因此GRD是Ras信号转导的一种负调节因子，而Ras是机体的癌基因，如Nfl基因发生突变，神经纤维瘤蛋白的质或量发生改变，Ras活性增高，从而可产生神经纤维瘤甚至恶性周围神经鞘瘤(Malignant Peripheral nerve sheath tumor, MPNST)。Nfl基因结构复杂，突变位点多变，突变类型不定，且在Nfl全长基因存在大量假基因，因此，Nfl基因突变的筛查仍将是一个具有挑战性的工作。根据人类基因突变数据库(HGMD)显示(http:1l www. hgmd. org/),截止到2011年4月，共发现Nfl基因的1273个突变，包括错义突变、剪切突变、插入、缺失及复杂重排等，但突变缺乏明显的热点区域，大多数散发病例各自携带特异的突变位点，由于不同的NFl患者临床症状不一，所以甚至在同一个家系患者中的不同成员之间也存在不同的突变位点及突变类型。在2000年以前，很少有人关注Nfl基因与血管性疾病的关系，直到近几年，Nfl基因与脑血管病之间的可能存在的关联也多为单纯的临床病例报道，对于Nfl基因与血管之间的关系鲜有深入研究，不过人们发现NFl伴发的血管病变病程缓慢，呈进行性损害。患者早期症状隐匿，可无不适症状，随着病情发展，出现的临床症状可因病变累及血管的部位和损伤程度而不同。但目前尚未找到Nfl基因与脑血管狭窄相关的突变位点及突变类型。在1993年，Ahlgren-Beckendorf等对Nfl与血管病变的关系进行了初步的实验研究，他们检测到血管壁上有Nfl的表达，并且发现Nfl催化域的表达和替代剪切模式在血管平滑肌细胞增殖过程中不断发生着改变，提示Nfl在血管平滑肌的发育和血管病理过程当中可能发挥着一定的作用，但没有继续深入的探讨。两年后，Norton再次证实了血管内皮细胞和平滑肌细胞中有神经纤维瘤蛋白的表达，目前已认为动脉壁的内在损害是NFl患者的重要表现，其血管病理过程中可能是由于神经纤维瘤蛋白的功能改变所致。2006年，Li等人发现神经纤维瘤蛋白是初级血管平滑肌细胞RAS-诱导信号通路的一个新的负调控子，Nfl基因突变可导致神经纤维瘤蛋白的质量发生改变，对RAS-信号通路抑制作用减弱，ras活性增强，从而导致神经纤维瘤及血管病的发生。在Nfl+/-鼠模型中发现失控的RAS-信号通路可致新生血管内膜增厚而致血管狭窄的发生。从Nfl+/-小鼠及缺乏神经纤维瘤蛋白的病人中取得血管内皮细胞和平滑肌细胞，并且鉴定了一个独立的Ras效应器通路，该通路严格地受到神经纤维瘤蛋白的调控，从而限制着血管平滑肌细胞的增殖和迁移，维持着血管壁血管平滑肌的稳定。同期，对于Nf+/-杂合突变小鼠神经纤维瘤中的高度血管化及小鼠体内血管发生的增加，Li和Munchhof探讨了神经纤维瘤蛋白调控新生血管形成的生化机制和其在内皮细胞中的功能，发现不论在体内还是体外，缺乏神经纤维瘤蛋白的内皮细胞的增殖和迁移发生了改变，这个改变与神经纤维瘤蛋白源的生长因子有关。2007年，针对NFl患者高发的心血管疾病、脑血管梗塞性疾病，Xu等人获得平滑肌细胞Nfl基因敲除小鼠(NflsmKO)，这些小鼠出现了相应的血管损害，内膜血脯氨酸增多以及Ras的下游效应器-丝裂原活化的蛋白激酶异常活化。如果在NflsmKO小鼠平滑肌细胞表达NflRas调控域(GTP酶活化的相关蛋白域)，那么内膜血脯氨酸增多症状可以得到恢复。体外实验发现Ras效应器活性同样恢复正常，提示平滑肌细胞受损后，Nfl调控Ras在平滑肌细胞的增生过程中具有关 键作用。2008年，Lasater等人总结发现Nfl+/-小鼠血管内有新内膜形成，血管平滑肌细胞的过度增生，在血小板源生长因子(platelet-derived growthfactor-BB, PDGF-BB)的刺激下高度活化Ras-Erk信号转导通路，提示神经纤维瘤蛋白通过PDGF-BB-Ras-Erk信号轴控制着血管壁内环境的稳定，包括血管内皮细胞(ECs )和血管平滑肌细胞(VSMCs)。动脉受损后TOGF-BB由血管内局部的血小板或其它细胞释放。也就是说这个信号通路上的任一环节受抑制，都会有利于与Nfl基因相关的血管性疾患的恢复，提示Nfl基因是血管性疾病的一个潜在治疗靶点。Milewicz同样提出Nfl基因的突变是多种增生性血管疾病发生的重要因素。为了探讨Nfl缺失所致血管性疾病的具体内环境变化，Lasater等认为神经纤维瘤蛋白可调控每种类型细胞的功能。然后通过在小鼠的内皮细胞，血管平滑肌细胞，及骨髓衍生细胞(BMDC)细胞中敲除Nfl基因，以观察究竟那种类型的细胞对小鼠体内新的内膜形成起到了关键作用，最后证实了在BMDC中Nfl的失活对新生内膜的形成是必要的，对Nfl+/-外周血分析发现血管内在新生血管内膜处有显著的巨噬细胞的聚集，提示炎症反应的存在，这与血管炎症及血管闭塞性疾患明显相关，再次提示ΝΠ在血管病变中的重要作用。Nfl基因外显率为100%。但不同临床症状或者表现不完全外显，或者表现出一定的年龄相关性。多数研究表明，NFl突变与临床表现之间似乎无明确联系。相同的基因突变不一定产生相同的临床表现，同一家族不同成员的临床表现也可能不同。家族中携带相同NFl基因突变位点的患者临床表现也各不相同，但在一级亲属中，临床表现却非常相似。Upadhyaya等研究了来自同一家族的3例NFl患者发现其基因突变各不相同，提出不能根据家族中某一患者的突变检测来推断整个家族的发病机制。Castle等研究113例NFl患者基因突变并分析了 110例患者基因型和表现型的关系，发现错义突变患者Lisch结节的相对危险度较无义突变和框架漂移低，但未见其他有意义的联系。近年来有学者认为，严重临床表现型的出现可能与大侧翼DNA功能缺失有关，而与NFl基因本身无关。总之，Nfl基因非常复杂，其突变可导致NFl的发生，但在NFl的不同患者中，Nfl基因突变位点及突变类型“变化莫测”。而且NFl患者往往伴发多种疾病，近年来一些主要针对动物实验的高影响因子文章均提示Nfl基因与血管性疾病的发生可能存在因果关系，但对Nfl基因突变位点与脑血管疾病的关系研究却寥寥无几。临床上出现的一个合并脑血管狭窄的I型神经纤维瘤(neurofibromatosistypel, NFl)病家系为此关系的确定提供了契机。本发明就以此合并脑血管狭窄的NFl家系为切入点，对该家系及单纯脑血管狭窄病例的Nfl基因进行全基因筛查，探寻与脑血管狭窄有关的突变位点、类型及可能的热点区域，并通对多例脑血管病人Nfl基因热点区域的再筛查，有望找到与脑血管狭窄有关的Nfl基因突变位点及类型，为脑血管狭窄发病机制的探索找到新的突破口，发现新的治疗靶点。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种与脑血管狭窄有关的I型神经纤维瘤NFl基因突变核苷酸序列，它包含一核苷酸序列`，该核苷酸序列选自下组(a)编码脑血管狭窄突变蛋白多肽的核苷酸序列；(b)与(a)中所述核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中所述编码脑血管狭窄突变蛋白多肽的核苷酸序列与NFl中包含的相应核苷酸序列相比在以下位置发生了突变c. 541C>T(即位于SEQ ID NO 1所示序列的第924位碱基的碱基由C突变为Τ，产生无义突变)，自NFl基因编码区第I位碱基(即SEQ ID NO 1所示序列的第384位碱基)起算，所述突变导致患者发生脑血管狭窄。在本发明中，优选的，所述的核苷酸序列，其含有选自下组的核苷酸序列(1)编码具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(2) SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；(3) SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。本发明的目的之二是提供一种与脑血管狭窄有关的多肽，它包括具有SEQ IDNO 2所示氨基酸序列的多肽，或其含有氨基酸序列SEQ ID NO :2的保守性变异多肽或其活性片段或其活性衍生物。在本发明中，优选的，所述的多肽，其选自下组(a)具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的仍能够导致脑血管狭窄的多肽。
含有以上任一项所述的核苷酸序列的表达载体以及被所述的载体转化或转导的含有所述载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。本发明的目的之三是提供了本发明所述的核苷酸序列及多肽的用途，该用途包括本发明所述的核苷酸序列在制备脑血管狭窄诊断试剂中的应用，及/或在制备I型神经纤维瘤合并脑血管狭窄诊断试剂中的应用。及本发明所述的多肽在制备脑血管狭窄诊断试剂中的应用，及/或在制备I型神经纤维瘤合并脑血管狭窄诊断试剂中的应用。及本发明所述的核苷酸序列在构建I型神经纤维瘤合并脑血管狭窄动物模型中的应用。及本发明所述的多肽在构建I型神经纤维瘤合并脑血管狭窄动物模型中的应用。本发明的目的之四是提供一种用于脑血管狭窄诊断的试剂盒，它包括(1)以含有c. 541C>T突变位点的NFl基因片段作为靶序列设计的特异性扩增人NFl基因的引物对，突变位点自NFl基因编码区第I位碱基起算；(2)用于检测扩增产物与正常NFl基因相比是否存在变化所需的试剂。在本发明中，所述的含有c. 541C>T突变位点的NFl基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本发明中优选的，所述的试剂盒中包含的引物对如下所示
5’ GAAGGAAGTTAGAAGTTTGTGACA3’ (SEQ ID NO 6)与5’CAATCGTATCCTTACCAGCCAT3’ (SEQ ID NO :7)。进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备脑血管狭窄诊断试剂中的应用，及/或在制备I型神经纤维瘤合并脑血管狭窄诊断试剂中的应用。本发明的目的之五是提供一种诊断脑血管狭窄疾病的方法，它包括以下步骤检测血细胞或血管平滑肌细胞样品中脑血管狭窄转录本与正常转录本相比是否有变化，有变化就表示存在脑血管狭窄风险；或者检测受检细胞样品中NFl基因编码蛋白的活性与正常NFl基因编码蛋白的活性相比是否有变化，有变化就表示存在脑血管狭窄风险；或者检测基因组样品中NFl基因组序列与正常NFl基因组序列相比是否有变化，有变化就表示存在脑血管狭窄风险。在一优选例中，所述的变化包括NF1基因外显子5 (碱基863-969，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示)中的核苷酸的缺失、插入和置换突变。更佳地，所述的变化选自下组SEQ ID NO :1中编码区第541位核苷酸(自SEQ ID NO :1所示序列第384位碱基(即起始密码子ATG中的“A”)起算，即SEQ ID NO :1所示序列的第924位碱基，下同)由C突变为T，产生无义突变。本发明的目的之六是提供一种转基因非人哺乳动物(动物模型)，其基因组中对应于人NFl基因外显子5的核苷酸序列发生了改变，从而具有患脑血管狭窄的风险。在一优选例中，所述的动物是小鼠，其基因组中NFl基因的外显子5中包含的核苷酸 541 由 C 突变为 T (c. 541C>T)。本发明的其它方面由于本文的技术的公开并结合现有技术，对本领域的技术人员而目是显而易见的。
图1为合并脑血管狭窄的I型神经纤维瘤病家系图谱；图2为先证者IV -7的皮肤改变和DSA检测结果；A :皮肤牛奶咖啡斑和神经纤维瘤；B DSA,箭头所指处为血管狭窄的部位；图3为NFl患者IV -3的皮肤咖啡斑和DSA检测结果，其中，箭头所指处为血管狭窄的部位；图4为DHPLC流程图；图5为Nfl基因第5外显子突变检测的DHPLC色谱图及测序结果；其中，A图为对照野生型的DHPLC峰型图，其右侧为相应测序图出图为家系合并脑血管狭窄的NFl患者Nfl基因的第5外显子相应检测图(箭头所指部位出现了肩峰)及测序图(测序图中箭头所指部位出现无义突变c. 541C-T)；C图为单纯脑血管狭窄患者的DNA的第5外显子相应检测图(箭头所指部位出现了肩峰)及测序图(测序图中箭头所指部位同样出现无义突变c. 541C-T)；图6为Nfl基因的外显子5的突变与其功能区域的关系(GRD区和CSRD区)。
具体实施例下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏 离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1合并脑血管狭窄的I型神经纤维瘤病家系分析I对象和方法1.1 对象先证者(IV 4，图1)，男，24岁，8年前因突发血压升高及头部较大神经纤维瘤手术就诊，体检发现血压180/100mmHg，近期再次因无特殊诱因而出现剧烈头痛、恶心呕吐伴视物模糊入院，测血压210/135mmHg。诊断为肾血管性高血压、神经纤维瘤入院。入院后超声结果发现肾动脉狭窄，左侧MCA狭窄。另外，该患者智力正常，有肾内多处动脉瘤(AN)、前交通动脉(ACOA)瘤。其他系统检查无异常。胸背腹及大腿内侧出现直径约f 2厘米圆形或椭圆形淡褐色斑多处，边界清晰，有皮肤纤维瘤。该家系共涉及5代34人，与NFl疾病有遗传关联的为21人(图1)。其中4人已死亡(3男I女，均为NFl患者，3人死于脑卒中)，其余人中，患者7人，男4人女3人。该病在本家族连续5代相传，5代中患病总人数11人。皆在幼年出现多个淡褐色斑或片状褐色牛奶咖啡斑,腋窝牛奶咖啡斑，随年龄增大症状加重,并且随着年龄的增加,血管性疾病的发生率增加。1. 2血管监测方法包括经颅多普勒CTCD)、颈部动脉超声检查及数字减影血管造影技术(DigitalSubtraction Angiography, DSA)。2 结果
2.1合并脑血管狭窄的NFl家系中脑血管病人的发病比例该家系中4人已死亡(3男I女，均为NFl患者，3人死于脑卒中)，其余患者7人，合并血管性疾病的有5人(其中一人未来院体检)。除去无该家系遗传因素的婚配者,该病在5代中患病总人数11人，占图1总人数的52. 38% (11/21)。10人(体检的6例患者+死亡的4例)中患血管性疾病的确定人数(血管狭窄+血管走形异常)为8人，不确定者I人(未体检)，血管性疾病患者占NFl发病人数的比例>80%。2. 2家系神经纤维瘤病患者皮肤改变、血管超声和DSA结果2. 2.1先证病例(IV-4)男，24岁，胸背腹可见多处圆形或椭圆形淡褐色斑多处，边界清晰，头部原有较大神经纤维瘤(已手术切除)。入院后超声结果发现肾动脉狭窄，左侧MCA狭窄。DSA结果显示见图2。其祖父、父亲和姑奶奶均患有神经纤维瘤并死于脑卒中。2. 2.1其他病例II1-4 :男，39岁，皮肤多处大小不一的神经纤维瘤，血管超声发现双侧椎动脉走行变异。II1-7 :男，45岁，除皮肤多处大小不一的神经纤维瘤外，腹部有一特大的神经纤维瘤，但血管超声未见异常。IV -2 :女， 31岁，皮肤多发咖啡斑，血管超声可见双侧ICA终末段-MCA重度狭窄；双侧大脑后动脉(PCA)重度狭窄；双侧大脑前动脉(ACA)、基底动脉(BA)中度狭窄；脾大；左侧颈内动脉(ICA)远端节段性狭窄；左侧椎动脉(VA)走行变异。DSA可见颅内血管狭窄处(图3)IV-5 :女，15岁，皮肤多发咖啡斑及前臂处可见大片牛奶咖啡斑。血管超声可见腹腔动脉起始部狭窄(50-69%);双侧VA走行变异。V -2 :男，6岁，可见皮肤咖啡斑和腋窝雀斑及咖啡斑。血管超声可见双侧ICA、VA走行弯曲。实施例2DHPLC筛查合并脑血管狭窄的I型神经纤维瘤病家系的Nfl基因突变及单纯脑血管狭窄患者的Nfl基因突变I对象与方法1.1Nfl全基因突变筛查的研究对象Nfl全基因筛查包括家系收集到的血样13例参见图1中合并血管疾病的6例病人(II1-4 JI1-7、IV -2、IV _4、IV -5、V -2 ;检测号1_6号)和家系中无神经纤维瘤病表现的7 例(II1-2 JI1-5 JI1-6、IV -UIV -3、IV -7,1V -8 ;检测号13-18)及 5 例无其他危险因素或基础疾病的单纯脑血管狭窄患者(检测号8-12号)。表118例Nfl全基因突变筛查的对象
权利要求
1.一种与脑血管狭窄有关的I型神经纤维瘤NFl基因突变核苷酸序列，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码脑血管狭窄突变蛋白多肽的核苷酸序列；(b)与(a)中所述核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中所述编码脑血管狭窄突变蛋白多肽的核苷酸序列与NFl中包含的相应核苷酸序列相比在以下位置发生了突变c. 5410T,自NFl基因编码区第I位碱基起算，所述突变导致患者发生脑血管狭窄。
2.如权利要求1所述的核苷酸序列，其含有选自下组的核苷酸序列(I)编码具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(2) SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；(3) SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。
3.一种与脑血管狭窄有关的多肽，它包括具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽， 或其含有氨基酸序列SEQ ID NO :2的保守性变异多肽或其活性片段或其活性衍生物。
4.如权利要求3所述的多肽，其选自下组(a)具有SEQID NO :2所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的仍能够导致脑血管狭窄的多肽。
5.—种表达载体,其特征在于含有权利要求1或2所述的核苷酸序列。
6.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求5所述的载体。
7.权利要求1或2所述的核苷酸序列在制备脑血管狭窄诊断试剂中的应用，及/或在制备I型神经纤维瘤合并脑血管狭窄诊断试剂中的应用。
8.权利要求3或4所述的多肽在制备脑血管狭窄诊断试剂中的应用，及/或在制备I 型神经纤维瘤合并脑血管狭窄诊断试剂中的应用。
9.权利要求1或2所述的核苷酸序列在构建I型神经纤维瘤合并脑血管狭窄动物模型中的应用。
10.权利要求3或4所述的多肽在构建I型神经纤维瘤合并脑血管狭窄动物模型中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种与脑血管狭窄有关的Ⅰ型神经纤维瘤NF1基因突变核苷酸序列及其应用，本发明的一种与脑血管狭窄有关的核苷酸序列，其与NF1中包含的相应核苷酸序列相比在以下位置发生了突变c.541C>T，自NF1基因编码区第1位碱基起算，所述突变导致患者发生脑血管狭窄。研究发现，该无义突变存在于所有合并脑血管狭窄的NF1家系患者，但不存在于NF1家系中正常的人群中。该突变点可为类似临床症状脑血管狭窄动物模型的建立提供了依据，并进一步为散发的NF1患者潜在的脑血管狭窄进行超早期诊断及预防。
文档编号C12N15/63GK103045605SQ201210576929
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者凌锋, 梁建涛, 霍丽蓉, 鲍遇海 申请人:首都医科大学宣武医院