植物中dha和其它lc-pufa的生成的制作方法

植物中dha和其它lc-pufa的生成的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶系统和一种或多种容许和/或改善PUFA在宿主生物体中生成的辅助蛋白质遗传修饰的重组宿主生物体。本发明还涉及生成和使用此类生物体的方法以及从此类生物体获得的产物。
【专利说明】植物中DHA和其它LC-PUFA的生成
[0001]发明背景发明领域
[0002]本发明一般涉及用多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶系统和一种或多种容许和/或改善PUFA在宿主生物体中生成的辅助蛋白质遗传修饰的重组宿主生物体(例如植物)。本发明还涉及生成和使用此类生物体(例如以获得PUFA)的方法以及从此类生物体获得的产物(例如油和种子)。
【背景技术】
[0003]认为多不饱和脂肪酸(PUFA)可用于营养应用，药物应用，工业应用，及其它目的。然而，目前从天然来源(例如鱼油)及从化学合成供应PUFA对于长期商业需要是不充分的。
[0004]源自植物(例如含油种子作物)的植物油相对便宜，而且没有与鱼油有关的污染问题。然而，存在于商业开发的植物和植物油中的PUFA通常不包含较为饱和的或较长链的PUFA,而是通常仅包含脂肪酸,诸如亚油酸(在δ 9和12位置中具有2个双键的18个碳，即 18:2 δ 9，12)和亚麻酸(18:3 δ 9，12，15)。
[0005]已经描述了在 植物中生成较为不饱和的或较长链的PUFA，其通过修饰由植物内源生成的脂肪酸进行。例如，用编码脂肪酸延长酶(elongase)和/或去饱和酶的各种单独基因遗传修饰植物已经描述为导致叶或种子的生成，所述叶或种子含有显著水平的较长链且较为不饱和的PUFA，诸如二十碳五烯酸(EPA)，而且还含有显著水平的混合的较短链且较小程度不饱和的 PUFA (Qi 等，Nature Biotech.22:739(2004) ；W004/071467 ；Abbadi 等，Plant Celll6:1(2004) ;Napier 和 Sayanova, Proceedings of the Nutrition Society64:387-393(2005) ;Robert 等，Functional Plant Biology32:473-479(2005);美国申请公开文本 N0.2004/0172682，美国申请 N0.61/345，537，2010 年 5 月 17 曰提交)。
[0006]壳斗科(Fabaceae)(或豆科(Leguminosae))是一种较大的且经济上重要的有花植物科，其通常称为豆科作物(legume)科，豌豆(pea)科，扁豆(bean)科或豆(pulse)科。大豆属(Glycine)是壳斗科中的属，并且包括例如Glycine albicans,Glycine aphyonota, Glycine arenari, Glycine argyrea, Glycine canescens,渗湖大? (Glycine clandestine), Glycine curvata, Glycine cyrtoloba, Glycine falcate,Glycine gracei, Glycine hirticaulis, Glycine hirticaulis subsp.leptosa, Glycinelactovirens, Glycine latifolia, Glycine latrobeana, Glycine microphylla, Glycinemontis—douglas, Glycine peratosa, Glycine pescadrensis, Glycine pindanica, Gycinepullenii, Glycine rubiginosa, Glycine stenophita, Glycine syndetika,烟豆(Glycinetabacina),短绒野大豆(Glycine tomentella),劳豆(Glycine soja),和大豆(Glycinemax)(大豆)。科壳斗科还包括花生,扁豆(菜豆(Phaseolus vulgaris)),蚕豆(broad bean)(蚕豆(Viciafaba))或豌豆(豌豆(Pisum sativum))。[0007]大部分大豆油为生产用于人消费的植物油形式。工业应用中使用大豆油的市场也在不断增加。
[0008]发明概述
[0009]本领域中需要相对便宜的方法来高效且有效生成植物、植物种子或植物油中大量(例如商业量)的较长链或较为不饱和的PUFA，以及植物、植物种子或植物油中此类PUFA中富含的大量脂质(例如三酰甘油(TAG)和磷脂(PL))。通过提供用多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶和一种或多种如本文中描述的辅助蛋白遗传修饰的重组宿主生物体来提供并改善宿主生物体(例如植物)中PUFA生成的系统是本领域中办法的一种有意义的备选。
[0010]本发明涉及经遗传修饰的植物(例如壳斗科或大豆属的植物，诸如大豆)、其后代、种子、细胞、组织、或部分，其包含:(i)编码生成至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)的多不饱和脂肪酸合酶(例如藻PUFA合酶)的核酸序列；和(ii)编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)的核酸序列，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)将磷酸泛酰巯基乙胺基辅因子转移至PUFA合酶系统(例如藻PUFA合酶系统)ACP域。
[0011]在本发明的一些实施方案中，PUFA合酶包含与氨基酸序列SEQ IDNO:1为80%至99%相同的氨基酸序列或者包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，编码PUFA合酶的核酸序列包含与核酸序列SEQ ID NO:6为80%至99%相同的核酸序列或者包含核酸序列SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，PUFA合酶包含与氨基酸序列SEQ ID NO:2为80%至99%相同的氨基酸序列或者包含氨基酸序列SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，编码PUFA合酶的核酸序列包含与核酸序列SEQ ID NO:7为80%至99%相同的核酸序列或者包含核酸序列SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，PUFA合酶包含与氨基酸序列SEQ ID NO:3为80%至99%相同的氨基酸序列或者包含氨基酸序列SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，编码PUFA合酶的核酸序列包含与核 酸序列SEQ ID NO:8为80%至99%相同的核酸序列或者包含核酸序列SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，PUFA合酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:1，2，或3或其任何组合。在一些实施方案中，编码PUFA合酶的核酸序列包含核酸序列SEQ ID NO:6，7或8或其任何组合。
[0012]在一些实施方案中，PPT酶包含与SEQ ID NO:5为80%至99%相同的氨基酸序列或者包含氨基酸序列SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，编码PPT酶的核酸序列与核酸序列SEQ ID NO: 10是80%至99%相同的或者包含核酸序列SEQ ID NO:10。
[0013]在一些实施方案中，(i)和(ii)的核酸序列包含在单一重组表达载体中。在一些实施方案中，(i)和(ii)的核酸序列包含在不同重组表达载体中。在一些实施方案中，(i)和/或(ii)的核酸序列与种子特异性启动子可操作连接。在一些实施方案中，(i)和/或
(ii)的核酸序列与选自下组的启动子可操作连接:PvDlec2, PvPhaseolin, LfKCS3, FAEI,BoACP和BnaNapinC。在一些实施方案中，(i)和/或(ii)的核酸序列与叶特异性启动子可操作连接。在一些实施方案中，(i)和/或(ii)的核酸序列与泛素或CsVMV启动子可操作连接。
[0014]在一些实施方案中，经遗传修饰的植物、其后代、种子、细胞、组织、或部分进一步包含(iii)编码酰基-CoA合成酶(ACoAS)的核酸序列，所述酰基-CoA合成酶(ACoAS)催化长链PUFA游离脂肪酸(PFFA)转化成酰基-CoA。在一些实施方案中，ACoAS包含与SEQID NO:4为80%至99%相同的氨基酸序列或者包含氨基酸序列SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，编码ACoAS的核酸序列包含与核酸序列SEQ ID NO:9为80%至99%相同的核酸序列或者包含核酸序列SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，编码ACoAS的核酸序列包含核酸序列SEQ ID NO:34。在一些实施方案中，(i)，(ii)和/或(iii)的核酸序列包含在单一重组表达载体中。在一些实施方案中，(i)，(?)和(iii)的核酸序列包含在不同重组表达载体中。在一些实施方案中，(i)和(ii)的核酸序列包含在单一重组表达载体中，且(iii)的核酸序列包含在不同重组表达载体中。在一些实施方案中，(i)和(iii)的核酸序列包含在单一重组表达载体中，且(ii)的核酸序列包含在不同重组表达载体中。在一些实施方案中，(ii)和(iii)的核酸序列包含在单一重组表达载体中，且(i)的核酸序列包含在不同重组表达载体中。在一些实施方案中，(i)，(ii)和/或(iii)的核酸序列与种子特异性启动子可操作连接。在一些实施方案中，(i)，(ii)和/或(iii)的核酸序列与选自下组的启动子可操作连接:PvDlec2，LfKCS3，FAEl，BoACP 和 BnaNapinC。在一些实施方案中，(i)，(ii)和/或(iii)的核酸序列与叶特异性启动子可操作连接。在一些实施方案中，(i)，(ii)和/或(iii)的核酸序列与泛素或CsVMV启动子可操作连接。
[0015]在一些实施方案中，经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分进一步包含编码乙酰CoA羧化酶(ACCase)的核酸序列和/或编码2型二酰基甘油酰基转移酶(DGAT2)的核酸序列。
[0016]在一些实施方案中，经遗传修饰的植物，其后代、细胞、组织、种子或部分包含下列至少一项:pDAB7361，pDAB7362, pDAB7363, pDAB7368, pDAB7369, pDAB7370, pDAB100518,PDAB101476, pDAB101477, pDAB9166, pDAB9167, pDAB7379, pDAB7380, pDAB9323,pDAB9330,PDAB9337,pDAB9338,pDAB9344,pDAB9396,pDAB101412, pDAB7733, pDAB7734, pDAB101493,PDAB109507, pDAB109508, pDAB109509, pDAB9151, pDAB108207, pDAB108208, pDAB108209,PDAB9159, pDAB9147,pDAB108224 和 pDAB108225。 [0017]在一些实施方案中，经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织、种子或部分或自经遗传修饰的植物、其后代、种子、细胞、组织、或部分获得的油(例如种子油)包含可检测量的DHA (二十二碳六烯酸(C22:6，n-3))，DPA (n_6) ( 二十二碳五烯酸(C22:5，n_6))和 / 或EPA( 二十碳五烯酸(C20:5，n-3))。在一些实施方案中，经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织、种子或部分或自经遗传修饰的植物、其后代、种子、细胞、组织、或部分获得的油(例如种子油)包含按总脂肪酸重量计0.01%至15% DHA，按总脂肪酸重量计0.05%至10%DHA，或按总脂肪酸重量计0.05%至5% DHA。在一些实施方案中，经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织、种子或部分或自经遗传修饰的植物、其后代、种子、细胞、组织、或部分获得的油(例如种子油)包含按总脂肪酸重量计0.01%至10%EPA，按总脂肪酸重量计0.05%至5% EPA，或按总脂肪酸重量计0.05%至1%EPA。在一些实施方案中，经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织、种子或部分或自经遗传修饰的植物、其后代、种子、细胞、组织、或部分获得的油(例如种子油)包含按总脂肪酸重量计0.01%至10%0?4(11-6)，按总脂肪酸重量计0.01%至5% DPA (n-6)，或按总脂肪酸重量计0.01%至1% DPA(n_6)。在一些实施方案中，经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织、种子或部分或自经遗传修饰的植物、其后代、种子、细胞、组织、或部分获得的油(例如种子油)包含按总脂肪酸重量计1:1至1: 30或1:1至1: 3的EPA: DHA比率。一些实施方案中，经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织、种子或部分或自经遗传修饰的植物、其后代、种子、细胞、组织、或部分获得的油(例如种子油)包含按总脂肪酸重量计1:1至1: 10或1:1至1: 3的DPA (n-6): DHA比率。在-些实施方案中，自经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织、种子或部分获得的油(例如种子油)包含按油重量计70%至99%甘油三酯。
[0018]在一些实施方案中，可检测量的DHA，DPA (n-6)和/或EPA也存在于自经遗传修饰的植物、其后代、组织、种子、或部分获得的谷物和/或粗粉中。
[0019]本发明涉及自本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分获得的油(例如种子油)或种子。本发明涉及食物产品，其包含自本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分获得的油(例如种子油)。本发明还涉及功能性食物，其包含自本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分获得的油(例如种子油)或种子。本发明涉及药用产品，其包含自本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分获得的油(例如种子油)或种子。
[0020]本发明涉及生成包含至少一种LC-PUFA的油的方法，其包括从本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分或从本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分的种子回收油。本发明还涉及生成包含至少一种LC-PUFA的油的方法，其包括种植本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分。本发明还涉及生成种子油中的至少一种LC-PUFA的方法，其包括从本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分的种子回收油。
[0021]本发明涉及生成种子油中的至少一种LC-PUFA的方法，其包括种植本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分。本发明还涉及对个体提供含有至少一种PUFA的补充物或治疗性产品的方法，其包括对个体提供本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分，本文中描述的油，本文中描述的种子，本文中描述的食物产品，本文中描述的功能性食物，或本文中描述的药用产品。在一些实施方案中，此类实施方案中含有的PUFA是DHA，DPA (n-6)和/或EPA。
[0022]本发明涉及生成本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分的方法，其包括用(i)编码生成至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)的PUFA合酶(例如藻PUFA合酶)的核酸序列；和(ii)编码将磷酸泛酰巯基乙胺基辅因子转移至PUFA合酶(例如藻PUFA合酶)ACP域的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)的核酸序列转化植物或植物细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括用(iii)编码酰基-CoA合成酶(ACoAS)的核酸序列转化植物或植物细胞，所述酰基-CoA合成酶(ACoAS)催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基-CoA。
[0023]附图简述
[0024]通过以下详细描述、图、和所附序列描述(其形成本申请的一部分)可以更全面了解本发明的各个实施方案。
[0025]图1描绘了编码PUFA OrfA的9个重复域中每个的重新设计的DNA序列的ClustalW (Vector NTI 中的比对)。
[0026]图2是pDAB7362的质粒图。[0027]图3是pDAB7361的质粒图。
[0028]图4是pDAB7363的质粒图。[0029]图5是pDAB7365的质粒图。
[0030]图6是pDAB7368的质粒图。
[0031 ]图7是pDAB7369的质粒图。
[0032]图8是pDAB7370的质粒图。
[0033]图9是pDAB100518的质粒图。
[0034]图10 是 pDAB101476 的质粒图。
[0035]图11 是 pDAB101477 的质粒图。
[0036]图12显示了来自源自用pDAB7362转化的两个大豆事件的Tl植物的单一 T2大豆种子的DHA和LC-PUFA含量。
[0037]图13显示了 T2大豆种子蛋白质提取物中PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，和PUFA合酶嵌合OrfC的Western印迹检测。
[0038]图14是pDAB9166的质粒图。
[0039]图15是pDAB9167的质粒图。
[0040]图16是pDAB7379的质粒图。
[0041]图17是pDAB7380的质粒图。
[0042]图18是pDAB9323的质粒图。
[0043]图19是pDAB9330的质粒图。
[0044]图20是pDAB9337的质粒图。
[0045]图21是pDAB9338的质粒图。
[0046]图22是pDAB9344的质粒图。
[0047]图23是pDAB9396的质粒图。
[0048]图24 是 pDAB101412 的质粒图。
[0049]图25是pDAB7733的质粒图。
[0050]图26是pDAB7734的质粒图。
[0051]图27 是 pDAB101493 的质粒图。
[0052]图28 是 pDAB109507 的质粒图。
[0053]图29 是 pDAB109508 的质粒图。
[0054]图30 是 pDAB109509 的质粒图。
[0055]图31是pDAB9151的质粒图。
[0056]图32 是 pDAB108207 的质粒图。
[0057]图33 是 pDAB108208 的质粒图。
[0058]图34 是 pDAB108209 的质粒图。
[0059]图35是pDAB9159的质粒图。
[0060]图36是pDAB9147的质粒图。
[0061]图37 是 pDAB108224 的质粒图。
[0062]图38 是 pDAB108225 的质粒图。
[0063]图 39 显示了来自用 pDAB101493，pDAB7362，pDAB7369，pDAB101412 或pDAB7380 转化的个体转基因拟南芥事件的T2种子的DHA和LC-PUFA含量。
[0064]发明详述[0065]如本文中使用的，术语“多不饱和脂肪酸”或“PUFA”指具有至少16个碳，至少18个碳，至少20个碳，或22或更多个碳的碳链长度，且具有至少3或更多个双键，4或更多个双键，5或更多个双键，或6或更多个双键的脂肪酸，其中所有双键为顺式构型。
[0066]如本文中使用的，术语“长链多不饱和脂肪酸”或“LC-PUFA”指含有3或更多个双键的20和更多个碳链长度，或具有至少3或更多个双键，4或更多个双键，5或更多个双键，或6或更多个双键的22或更多个碳的脂肪酸。omega-6系列的LC-PUFA包括但不限于二-高-λ -亚麻酸(d1-homo-gamma-亚麻酸,C20:3n_6),花生四烯酸(C20:4n_6),肾上腺酸(又称作二十二碳四烯酸或DTA) (C22:4n-6)，和二十二碳五烯酸(C22:5n_6)。omega-3系列的LC-PUFA包括但不限于二十碳三烯酸(C20: 3n-3)，二十碳四烯酸(C20:4n_3)，二十碳五烯酸(C20:5n-3)，二十二碳五烯酸(C22:5n_3)，和二十二碳六烯酸(C22:6n_3)。LC-PUFA还包括具有大于22个碳和4或更多个双键的脂肪酸，包括但不限于C28:8 (n-3)。
[0067]如本文中使用的，术语“PUFA合酶”指生成多不饱和脂肪酸(PUFA)且特别是长链PUFA(LC-PUFA)的酶以及复合物中此类酶的任何域。术语PUFA合酶包括但不限于用于生成PUFA的PUFA PKS系统或PKS样系统。一些特定的PUFA合酶在本文中通过别的符号指定，例如，“SzPUFA”合酶或“hSzThPUFA”合酶，如本申请中定义的。术语“PUFA合酶系统”包括PUFA合酶和在异源生物体中表达时可以影响PUFA合酶功能的任何辅助酶(例如PPT酶或ACS)。
[0068]如本文中使用的，术语“磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶”和“PPT酶”指通过将辅因子(例如4-磷酸泛酰巯基乙胺)从辅酶A (CoA)转移至PUFA合酶中存在的一个或多个ACP域而活化PUFA合酶的酶。能活化本文中描述的PUFA合酶的一个或多个ACP域的PPT酶的一个例子是念珠藻(Nostoc sp.)PCC7120(以前称作鱼腥藻(Anabaena sp.)PCC7120)的Het I蛋白，本文中称为“N oHetI ”。
[0069]如本文中使用的，术语“酰基-Cok合成酶”、“ACoAS”和“ACS”指催化将长链多不饱和游离脂肪酸(FFA)转化成酰基-CoA的酶。一些特定的酰基-CoA合成酶在本文中以别的符号指定，例如“SzACS-2”，如本申请中定义的。
[0070]如本文中使用的，术语“植物”包括其任何后代、细胞、组织、种子、种子油、或部分。
[0071]“保健食品(nutraceutical) ”意指从提供生理学益处或提供保护免于疾病的植物分离，纯化，浓缩，或生成的产品，包括补充有此类产品的加工食物，以及从已经遗传工程化改造为含有增强的此类生理学活性组分水平的作物生成的食物。
[0072]“功能性食物”意指如下的食物，该食物(a)与作为日常饮食一部分消耗的常规食物外观相似或者可以是该常规食物，且(b)基于通常存在于未修饰食物中的组分的比例修改，具有增强的营养价值和/或特定的饮食益处。
[0073]术语“多核苷酸”和“核酸”意图涵盖单数个核酸及复数个核酸，核酸分子或其片段、变体、或衍生物，或构建体，例如信使RNA (mRNA)或质粒DNA (pDNA)。多核苷酸或核酸可以含有全长cDNA序列的核苷酸序列，或其片段，包括非翻译5’和3’序列和编码序列。多核苷酸或核酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成，其可以是未修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸或核酸可以由单链和双链DNA，作为单链和双链区的混合物的DNA，单链和双链RNA，和作为单链和双链区的混合物的RNA，包含可以为单链或更通常为双链或单链和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子组成。这些术语还涵盖多核苷酸或核酸的化学、酶法、或代谢修饰的形式。
[0074]多核苷酸或核酸序列可以称为“分离的”，其中它已经从其天然环境中取出。例如，出于本发明的目的，认为载体中含有的编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽或多肽片段的异源多核苷酸或核酸是分离的。分离的多核苷酸或核酸的其它例子包括异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸或核酸。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包含合成生成的此类分子。DNA聚合物形式的分离的多核苷酸或核酸可以由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段组成。
[0075]术语“基因”指能够以特定蛋白质表达的核酸或其片段，任选地包括编码序列之前(5，非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列。 [0076]如本文中使用的，术语“编码区”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调节序列”指位于编码序列上游(5，非编码序列)，之内，或下游(3’非编码序列)，且影响关联编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应器结合位点、和茎-环结构。
[0077]如本文中使用的，术语“多肽”意图涵盖单数个“多肽”及复数个“多肽”及其片段，且指通过酰胺键(又称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”指任何一条或多条具有两个或更多个氨基酸的链，而不是指特定长度的产物。如此，肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白质、氨基酸链、或用于指一条或多条具有两个或更多个氨基酸的链的任何其它术语包括在“多肽”的定义内，且术语“多肽”可以替换这些中任一项术语使用，或者与这些中任一项术语可互换使用。多肽可以源自天然生物学来源或者通过重组技术生成，但是不一定从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式生成，包括通过化学合成。“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意图指不在其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，分离的多肽可以从其天然或自然环境中取出。出于本发明的目的，认为在宿主细胞中表达的重组生成的多肽和蛋白质是分离的，已经通过任何合适的技术分离，分级，或部分或实质性纯化的天然或重组多肽亦然。
[0078]如本文中使用的，“天然的”指如自然存在的具有其自身调节序列(若存在的话)的多核苷酸、基因或多肽形式。
[0079]如本文中使用的，“内源”指在生物体中或在生物体的基因组中在其天然位置中的多核苷酸、基因或多肽的天然形式。“内源多核苷酸”包括在生物体的基因组中其天然位置中的天然多核苷酸。“内源基因”包括生物体的基因组中其天然位置中的天然基因。“内源多肽”包括生物体中其天然位置中的天然多肽。
[0080]如本文中使用的，“异源”指通常不存在于宿主生物体中，但是引入宿主生物体中的多核苷酸，基因或多肽。“异源多核苷酸”包括以与相应的天然多核苷酸不同的形式再引入来源生物体中的天然编码区，或其部分。“异源基因”包括以与相应的天然基因不同的形式再引入来源生物体中的天然编码区，或其部分。例如，异源基因可以包括作为再引入天然宿主中的嵌合基因的一部分的天然编码区，所述嵌合基因包含非天然调节区。“异源多肽”包括以与相应的天然多肽不同的形式再引入来源生物体中的天然多肽。
[0081]如本文中使用的，术语“修饰”指导致由多核苷酸编码的多肽的活性降低、基本上消除或消除的本文公开的多核苷酸中的变化，以及导致多肽的活性降低、基本上消除或消除的本文公开的多肽中的变化。此类变化可以通过本领域中公知的方法做出，包括但不限于缺失、突变(例如自发诱变，随机诱变，由增变基因引起的诱变，或转座子诱变)，取代，插入，下调，改变细胞位置，改变多核苷酸或多肽的状态(例如甲基化，磷酸化或泛素化)，除去辅因子，引入反义RNA/DNA，引入干扰RNA/DNA，化学修饰，共价修饰，用UV或X射线照射，同源重组，有丝分裂重组，启动子置换方法，和/或其组合。测定哪些核苷酸或氨基酸残基可以修饰的指导可以如下找到，即比较特定多核苷酸或多肽的序列与同源多核苷酸或多肽(例如酵母或细胞的)序列，并使高同源性的区域(保守区)或共有序列中做出的修饰的数目最大化/最小化。
[0082]如本文中使用的，术语“衍生物”指本发明中公开的序列的修饰。此类修饰的例示会是保持，略微改变，或提高含油种子作物物种中本文中公开的编码序列的功能的一个或多个碱基的取代、插入和/或缺失，所述碱基涉及本文中公开的编码序列的核酸序列。例如，本领域技术人员可以使用用于预测和优化序列结构的计算机建模技术容易地确定此类衍生物。如此，术语“衍生物”还包括与本文中公开的编码序列具有实质性序列同源性，使得它们能够具有公开的功能性以用于生成本发明的LC-PUFA的核酸序列。
[0083]如本文中使用的，术语“变体”指通过使用例如重组DNA技术，诸如诱变创建的氨基酸插入、缺失、突变和取代而与本发明的明确叙述的多肽有差别的多肽。测定哪些氨基酸残基可以在不消除感兴趣的活性的情况下替换、添加或删除的指导可以如下找到，即比较特定多肽的序列与同源多肽的序列，并且使高同源性区域(保守区)中进行的氨基酸序列变化数目最小化或通过用共有序列替换氨基酸。
[0084]或者，可以通过利用遗传密码中的“冗余”合成或选择编码这些相同或相似的多肽的重组多核苷酸变体。可以将各种密码子取代，诸如生成各种限制性位点的沉默变化引入以优化对表达用的质粒或病毒载体的克隆。多核苷酸序列的突变可以在多肽或添加至多肽以修饰多肽的任何部分的 性质的其它肽的域中得到反映。
[0085]氨基酸“取代”可以是将一种氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换的结果，即保守氨基酸替换，或者它们可以是将一种氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的氨基酸替换的结果，即非保守氨基酸替换。“保守的”氨基酸取代可以基于涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两亲性性质的相似性进行。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、和组氨酸；且带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。或者，“非保守”氨基酸取代可以通过选择这些中任一种氨基酸的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两亲性性质的差异进行。“插入”或“缺失”可以在重组蛋白在结构上或功能上容许的变异范围内。容许的变异可以通过对多肽分子中的氨基酸系统性进行插入、缺失或取代经实验确定，其使用重组DNA技术并对所得的重组变体测定活性进行。
[0086]术语“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。一般地，编码序列位于启动子序列的3’。启动子完全源自天然基因，或者由源自自然存在的不同启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应当理解，不同启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中，或者在发育的不同阶段，或者响应不同环境或生理学条件表达。引起基因在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。进一步认可由于在大多数情况中，调节序列的精确边界尚未完全限定，不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。
[0087]术语“可操作连接的”指单一核酸片段上核酸序列的关联，使得一种核酸序列的功能受到另一种影响。例如，在启动子能够影响编码序列表达时(例如编码序列在启动子的转录控制下)，启动子与所述编码序列可操作连接。编码序列可以以有义或反义取向与调节序列可操作连接。
[0088]如本文中使用的，术语“表达”指源自本发明的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达还可以指mRNA翻译成多肽。
[0089]如本文中使用的，术语“过表达”指高于相同或相关基因的内源表达的表达。异源基因在其表达闻于相当的内源基因的表达时是过表达的。
[0090]如本文中使用的，术语“转化”指将核酸或片段转移至宿主生物体中，导致遗传稳定的遗传力。含有经转化的核酸片段的宿主生物体称为“转基因”或“重组”或“经转化的”生物体。
[0091]如本文中使用的，术语“质粒”和“载体”指经常携带不作为细胞中心代谢一部分的基因，且通常为环状双链DNA分子形式的染色体外元件。此类元件可以是源自任何来源的单链或双链DNA或RNA的自主复制序列，基因组整合序列，噬菌体或核苷酸序列(线性或环状)，其中许多核苷酸 序列已经连接或重组成独特的构造，其能够与合适的3’非翻译序列一起将启动子片段和选定基因产物的DNA序列导入细胞中。
[0092]如本文中使用的，术语“密码子简并”指在不影响编码多肽的氨基酸序列的情况中容许核苷酸序列变异的遗传密码性质。熟练技术人员完全知道特定宿主细胞在使用核苷酸密码子以规定给定氨基酸中展现的“密码子偏爱”。因此，在合成基因以在宿主细胞中实现改善的表达时，期望设计基因，使得其密码子选择频率接近宿主细胞的优选密码子选择的频率。
[0093]术语“经密码子优化的”在其提及用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区时指改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以在不改变由DNA编码的多肽的情况中反映宿主生物体的典型密码子选择。此类优化包括用更通常用于所述生物体基因的一种或多种密码子替换至少一种，超过一种，或大量的密码子。
[0094]包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列的偏差容许编码基因的序列的变异。由于每个密码子由三个核苷酸组成，且构成DNA的核苷酸限于4种特定的碱基，存在有64种可能的核苷酸组合，其中61种编码氨基酸(剩余3种密码子编码结束翻译的信号)。显示哪些密码子编码哪些氨基酸的“遗传密码”在本文中以表1再现。因此，许多氨基酸以超过一种密码子指定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由6种编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。此简并性容许DNA碱基组成在较宽的范围里变化而不影响由DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。
[0095]表1:标准遗传密码
[0096]
【权利要求】
1.一种经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其包含: (i)包含核酸序列的核酸分子，所述核酸序列编码生成至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)的多不饱和脂肪酸合酶；和 (ii)包含编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)的序列的核酸分子。
2.权利要求1的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述PUFA合酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
3.权利要求2的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述PUFA合酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
4.权利要求1的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述编码PUFA合酶的核酸序列包含与SEQ ID NO:6的核酸序列至少80%相同的核酸序列。
5.权利要求4的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述编码PUFA合酶的核酸序列包含SEQ ID NO:6的核酸序列。
6.权利要求1至5中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述PUFA合酶包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
7.权利要求6的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述PUFA合酶包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
8.权利要求1至5 中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述编码PUFA合酶的核酸序列包含与SEQ ID NO:7的核酸序列至少80%相同的核酸序列。
9.权利要求8的经遗传修饰的大豆植物，其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述编码PUFA合酶的核酸序列包含SEQ ID NO:7的核酸序列。
10.权利要求1至9中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述PUFA合酶包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
11.权利要求10的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述PUFA合酶包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。
12.权利要求1至9中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述编码PUFA合酶的核酸序列包含与SEQ ID NO:8的核酸序列至少80%相同的核酸序列。
13.权利要求12的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述编码PUFA合酶的核酸序列包含SEQ ID NO:8的核酸序列。
14.权利要求1的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述PUFA合酶包含SEQ ID NO:1_3的氨基酸序列。
15.权利要求1的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述编码PUFA合酶的核酸序列包含SEQ ID NO:6_8的核酸序列。
16.权利要求1至15中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述PPT酶包含与SEQ ID NO:5至少80%相同的氨基酸序列。
17.权利要求16的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述PPT酶包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。
18.权利要求1至17中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述编码PPT酶的核酸序列与SEQ ID NO:10的核酸序列至少80%相同。
19.权利要求18的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述编码PPT酶的核酸序列包含SEQ ID NO:10的核酸序列。
20.权利要求1至19中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中(i)和(ii)的所述核酸序列包含在单一重组表达载体中。
21.权利要求1至20中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中(i)或(ii)的所述核酸序列与种子特异性启动子或叶特异性启动子可操作连接。
22.权利要求1至20中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中Q)或Qi)的所述核酸序列与PvDlec2、LfKCS3、FAEl、BoACP、BnaNapinC、泛素或CsVMV启动子可操作连接。
23.权利要求1至22中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其进一步包含: (iii)包含编码酰基-CoA合成酶(ACoAS)的核酸序列的核酸分子。
24.权利要求23的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述ACoAS包含与SEQ ID NO:4至少80%相同的氨基酸序列。
25.权利要求24的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述ACoAS包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
26.权利要求23的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述编码ACoAS的核酸序列包含与SEQ ID NO:9的核酸序列至少80%相同的核酸序列。
27.权利要求26的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述编码ACoAS的核酸序列包含SEQ ID NO:9的核酸序列。
28.权利要求23至27中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中(i)、(ii)和(iii)的所述核酸序列包含在单一重组表达载体中。
29.权利要求23至27中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中或(iii)的所述核酸序列与种子特异性启动子或叶特异性启动子可操作连接。
30.权利要求23至27中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中或(iii)的所述核酸序列与PvDlec2、LfKCS3、FAEl、BoACP、BnaNapinC、泛素或CsVMV启动子可操作连接。
31.权利要求1至30中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其进一步包含编码乙酰CoA羧化酶(ACC酶)的核酸序列或编码2型二酰基甘油酰基转移酶(DGAT2)的核酸序列。
32.—种经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其包含下列至少一项:pDAB7361， pDAB7362, pDAB7363, pDAB7368, pDAB7369, pDAB7370, pDAB100518,PDAB101476,pDAB101477, pDAB9166, pDAB9167, pDAB7379, pDAB7380, pDAB9323, pDAB9330,PDAB9337, pDAB9338, pDAB9344,pDAB9396, pDAB101412, pDAB7733, pDAB7734, pDAB101493,PDAB109507, pDAB109508, pDAB109509, pDAB9151, pDAB108207, pDAB108208, pDAB108209,PDAB9159, pDAB9147, pDAB108224，和 pDAB108225。
33.权利要求1至32中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述植物、其后代、细胞、组织、种子或部分包含可检测量的DHA(二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid) (C22:6, n_3)), DPA(n_6) ( 二十二碳五稀酸(docosapentaenoicacid) (C22:5, n_6)),或 EPA (二十碳五稀酸(eicosapentaenoic acid) (C20:5, n_3))。
34.权利要求33的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述植物、其后代、细胞、组织、种子或部分包含按总脂肪酸重量计的0.01%至15% DHA。
35.权利要求34的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述植物、其后代、细胞、组织、种子或部分包含按总脂肪酸重量计的0.05%至10% DHA。
36.权利要求35的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述植物、其后代、细胞、组织、种子或部分包含按总脂肪酸重量计的0.05%至5% DHA。
37.权利要求1至36中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述植物、其后代、细胞、组织、种子或部分包含按总脂肪酸重量计的0.01%至10% EPA。
38.权利要求37的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述植物、其后代、细胞、组织、种子或部分包含按总脂肪酸重量计的0.05%至5% EPA。
39.权利要求38的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述植物、其后代、细胞、组织、种子或部分包含按总脂肪酸重量计的0.05%至1% EPA。
40.权利要求1至39中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述植物、其后代、细胞、组织、种子或部分包含按总脂肪酸重量计的0.01%至10% DPA(n-6)。
41.权利要求40的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述植物、其后代、细胞、组织、种子或部分包含按总脂肪酸重量计的0.01%至5% DPA(n-6)。
42.权利要求1-34和39-47中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述植物、其后代、细胞、组织、种子或部分包含按总脂肪酸重量计的0.01%M I % DPA (n-6)。
43.权利要求1至33中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述植物、其后代、细胞、组织、种子或部分包含按总脂肪酸重量计1:1至1: 30的EPA: DHA比率。
44.权利要求43的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述植物、其后代、细胞、组织、种子或部分包含按总脂肪酸重量计1:1至1: 3的EPA: DHA比率。
45.权利要求1至33中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述植物、其后代、细胞、组织、种子或部分包含按总脂肪酸重量计1:1至1: 10的 DPA (n-6): DHA 比率。
46.权利要求45的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，其中所述植物、其后代、细胞、组织、种子或部分包含按总脂肪酸重量计1:1至1: 3的DPA (n-6): DHA 比率。
47.一种自权利要求1至46中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分获得的油。
48.一种自权利要求1至46中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、或部分获得的种子。
49.一种食物产品，其包含自权利要求1至46中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分获得的油，或自权利要求1至46中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、或部分获得的种子。
50.一种功能性食物，其包含自权利要求1至46中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分获得的油，或自权利要求1至46中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、或部分获得的种子。
51.一种药用产品，其包含自权利要求1至46中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分获得的油，或自权利要求1至46中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、或部分获得的种子。
52.一种生成包含至少一种PUFA的油的方法，其包括从权利要求1至46中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分或者从权利要求1至46中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、或部分的种子回收油。
53.一种生成包含至少一种PUFA的油的方法，其包括种植权利要求1至46中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。
54.一种在种子油中生成至少一种PUFA的方法，其包括从权利要求1至46中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、或部分的种子回收油。
55.一种在种子油中生成至少一种PUFA的方法，其包括种植权利要求1至46中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。
56.—种对个体提供含有至少一种PUFA的补充物或治疗性产品的方法，其包括对所述个体提供权利要求1至46中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分，权利要求47的油，权利要求48的种子，权利要求49的食物产品，权利要求50的功能性食物，或权利要求51的药用产品。
57.权利要求53至56中任一项的方法，其中所述PUFA是DHA。
58.权利要求53至56中任一项的方法，其中所述PUFA是EPA。
59.权利要求53至56中任一项的方法，其中所述PUFA是DPA(n_6)。
60.一种生成权利要求1至46中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、或部分的方法，其包括用⑴包含编码藻PUFA合酶的序列的核酸分子；和(ii)包含编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)的序列的核酸分子转化大豆植物或植物细胞。
61.权利要求60的方法，其进一步包括用(iii)包含编码酰基-CoA合成酶(ACoAS)的序列的核酸分子转化所述大豆植物或植物细胞。
62.一种大豆油，其包含按总脂肪酸重量计0.05%至15%DHA。
63.权利要求62的大豆油，其进一步包含按总脂肪酸重量计0.05%至5% EPA。
64.权利要求62或63的大豆油，其进一步包含按总脂肪酸重量计0.01%至5%DPA (n-6)。
65.一种大豆油，其包含按总脂肪酸重量计1:1至1: 30的EPA: DHA比率。
66.权利要求65的大豆油，其包含按总脂肪酸重量计1:1至1: 3的EPA: DHA比率。
67.一种大豆油，其包含按总脂肪酸重量计1:1至1: 10的DPA (n-6): DHA比率。
68.权利要求67的大豆油，其包含按总脂肪酸重量计1:1至1: 3的DPA(n-6): DHA比率。
69.一种组合物，其包含权利要求47和58至68中任一项的油。
70.一种生成权利要求1至42中任一项的经遗传修饰的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分的方法，其包括用表达盒转化大豆植物或植物细胞，所述表达盒包含:(i)包含编码PUFA合酶的核酸序列的核酸分子；(ii)包含编码酰基-CoA合成酶(ACoAS)的核酸序列的核酸分子；和(iii)包含编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)的序列的核酸分子。
71.一种油混合物，其包含权利要求47和58至68中任一项的油，和另外的油。
72.权利要求71的油混合物，其中所述另外的油是植物油，鱼油，微生物油或其混合物。
73.一种饲料或 粗粉(meal)组合物，其包含权利要求47和58至68中任一项的油。
【文档编号】C12N5/04GK104024403SQ201280046860
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2012年7月26日 优先权日:2011年7月26日
【发明者】T.A.瓦尔什, D.加乔特, A.O.莫罗, D.R.帕雷迪, J.梅茨, S.贝万, J.库纳 申请人:陶氏益农公司, Dsm Ip资产公司