非b亚型gag蛋白在慢病毒包装中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及慢病毒包装载体，所述慢病毒包装载体包含非B亚型gag-pol序列，尤其是D亚型gag-pol序列。本发明还涉及用于制备和使用这些载体的方法。本发明还涉及包含HIV-1非B亚型Gag和/或Pol蛋白的慢病毒载体颗粒。
【专利说明】非B亚型GAG蛋白在慢病毒包装中的应用
【背景技术】
[0001]重组疫苗已随重组DNA技术的进步而发展，重组DNA技术能够修饰病毒基因组以产生修饰的病毒。通过这种方式，已能够将遗传序列引入非致病性病毒，从而它们编码需要在干扰后于靶细胞内得以表达的免疫原性蛋白质，以在其宿主内发展特定免疫应答。
[0002]此类疫苗构成了疫苗技术中的重大进步(Kutzler等，Nat RevGenet, 9 (10): 776-788，2008)。具体而言，它们具有优于传统疫苗的优势:避免活(减毒的)病毒和消除灭活疫苗制造的相关风险。
[0003]采用经修饰的逆转录病毒(逆转录病毒载体)的基因递送在上世纪80年代早期由Mann等描述(Cell，33 (I): 153-9，1983)。最常用的致瘤性逆转录病毒基于莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MLV)。其基因组简单，从该基因组产生多聚蛋白质Gag、Pol和Env,并以反式形式供病毒复制所需(Breckpot等,2007, Gene Ther, 14(11):847-62; He等，2007，Expert Rev vaccines, 6(6):913-24)。一般需要的顺式序列是长末端重复序列(LTR)及其如下周边序列:整合所需的反向重复序列(IR或att位点)、包装序列Ψ、转运RNA结合位点(引物结合位点，PBS)，和逆转录涉及的一些其它序列(LTR内的重复R，以及多嘌呤序列(PPT)，正链起始所必需)。为了生成复制缺陷型逆转录病毒载体，通常使gag、pol和env基因全部缺失，并且用表达盒替代。
[0004]源自慢病毒基因组的逆转录病毒载体(即，慢病毒载体)已涌现为用于基因治疗和免疫治疗目的的有希望的工具，因为它们显示优于其它病毒系统的若干优势。具体而言，慢病毒载体本身无毒，并且不像其它逆转录病毒，慢病毒能够转导非分裂细胞，尤其是树突细胞(He等,2007，Exper t Rev vaccines, 6 (6): 913-24),这允许通过内源性通路的抗原递呈。慢病毒代表逆转录病毒科(Retroviridae)的一个慢病毒(slow virus)属,其包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性脑炎病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。慢病毒可以无限地持续存在于其宿主内，并且在一生的感染期间以不同速度连续复制。所述病毒在其宿主内的持续复制取决于其避开宿主防御的能力。
[0005]重组慢病毒载体的设计基于所述慢病毒的顺式与反式作用序列的分离。非分裂细胞中的有效整合与复制需要所述慢病毒基因组中存在两种顺式作用序列:中心多嘌呤序列(CPPT)和中心终止序列(CTS)。它们导致形成三链DNA结构，称为中心DNA “瓣(flap)”，该结构使基因进入非分裂细胞(包括树突细胞(DC))核内的效率最大化(Zennou等，2000，Cell, 101 (2) 173-85; Arhel 等，2007，EMBO J, 26(12): 3025-37)。
[0006]已经基于由包装构建体为反式包装载体提供B亚型Gag、Pol、Tat和Rev蛋白而生成了 HIV-1 慢病毒载体(Naldini 等,PNAS15:11382-8 (1996) ; Zufferey 等,Nature B1technologyl5:871-875，1997) ;Dull 等,Journal of Virology (1997))。这些研究米用 B 亚型Gag和Pol蛋白进行。而HIV-1包装构建体中非B亚型gag和pol序列的作用还未经评估。
[0007]除B亚型外存在HIV-1的多种不同亚型。HIV-1的一些亚型，例如C、E和A亚型，似乎在转送上比HIV-1B亚型(美国和欧洲的主要亚型)更为有效。Essex等，Adv VirusRes.1999;53:71-88。在发达西方国家，发现HIV-1优势亚型是进化枝B，这与存在于非洲和亚洲(绝大多数HIV感染人类的居住地)的那些亚型和重组子相差甚远。Spira等，J.Antimicrobial Chemotherapy (2003) 51, 229-240。因此,在北美和欧洲所见的B亚型逆转录病毒与全球范围人类传染的那些病毒亚型之间可能存在严重差异(出处同上)。亚型差异可影响HIV传播模式。同性传播和静脉内药物滥用是在欧洲和美国观察到的进化枝B株系的主要传播模式(出处同上)。相反，进化枝A、C、D和E在非洲和亚洲占优势，在这些地方异性传播为主(出处同上)。此外，一些研究提出艾滋病(AIDS)的进展视感染性亚型而有不同(出处同上)。因此，似乎HIV-1B亚型与其它HIV-1亚型差异很大。
[0008]HIV种系分类法一般基于源自相同分离物的多个亚基因组区域(gag、pol和env)的核苷酸序列，或基于全长基因组序列分析。对于HIV-1的接近全长序列的种系分析揭示，HIV-1B亚型在遗传上与HIV D亚型最紧密相关(图1)。对于HIV-1Gag和Pol蛋白序列的种系分析也显示，HIV-1B亚型在遗传上与HIV D亚型最紧密相关(图2)。
[0009]不过，HlV-1-NDK(—种D亚型病毒)对⑶4+淋巴细胞的细胞致病性显著高于HIV-1-BRU原形(一种B亚型病毒)。这可能归因于D亚型病毒的增强的致融性(fusogenicity)和感染性。De Mareuil 等,J.Virol.66:6797 (1992)。重组病毒的表型分析表明，来自HIV-1-NDK基质(MA)蛋白N末端部分的75个氨基酸与HIV-1-NDK的包膜糖蛋白一同造成了 HIV-1-NDK在⑶4+淋巴细胞中增强的致融性以及HIV-1-NDK在一些⑶4-细胞系中增强的感染性(出处同上)。
[0010]本领域需要慢病毒包装构建体来生成更高效价的经包装慢病毒载体，以减少注射体积，提高剂量，降低疫苗接种的成本，并且增加能在一批次中治疗的患者的数量。本发明满足了这一需要。
[0011]发明概述
[0012]用D亚型HIV-1的gag-pol基因替代慢病毒包装质粒(构建体ρ8.74)中的HIV-1B亚型的gag-pol基因，以生成构建体pThV-GP-N。所述构建体用于慢病毒载体的生成。相较于构建体P8.74，使用pThV-GP-N质粒获得约2倍高的效价。因此，相对于B亚型病毒的Gag-Pol, D亚型病毒的Gag-Pol提高了慢病毒载体颗粒的效价。本发明涉及包含D亚型gag-pol序列,尤其是来自HIV-1NDK的D亚型gag-pol序列的慢病毒包装载体。在一个优选实施方式中，所述慢病毒包装载体包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。在一个优选实施方式中，所述慢病毒包装载体编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
[0013]SEQ ID NOl的核苷酸序列是:
[0014]
【权利要求】
1.一种复制缺陷型慢病毒包装载体，所述载体缺乏Ψ位点且编码Hiv-1GagMA蛋白； 其中，所述HIV-1Gag MA蛋白具有如下特点: a)第12位的氨基酸不是谷氨酸， b)第15位的氨基酸不是精氨酸， c)不同时在第46位具有缬氨酸且在第61位具有亮氨酸；和 其中，相较于编码HIV-1BRU的HIV-1Gag MA蛋白的慢病毒包装载体，所述编码HIV-1GagMA蛋白的慢病毒包装载体产生的经包装慢病毒载体的效价至少增加至1.5倍。
2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述第12位的氨基酸是赖氨酸。
3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述第12位的氨基酸是精氨酸。
4.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述第15位的氨基酸是苏氨酸。
5.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述第15位的氨基酸是丙氨酸。
6.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述第46位的氨基酸是亮氨酸。
7.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述第61位的氨基酸是异亮氨酸。
8.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述第61位的氨基酸是甲硫氨酸。
9.如权利要求2所述的载体，其特征在于，所述第15位的氨基酸是苏氨酸。
10.权利要求书10缺失
11.如权利要求2所述的载体，其特征在于，所述第46位的氨基酸是亮氨酸。
12.如权利要求2所述的载体，其特征在于，所述第61位的氨基酸是异亮氨酸。
13.如权利要求9所述的载体，其特征在于，所述第46位的氨基酸是亮氨酸。
14.如权利要求9所述的载体，其特征在于，所述第61位的氨基酸是异亮氨酸。
15.如权利要求13所述的载体，其特征在于，所述第61位的氨基酸是异亮氨酸。
16.如权利要求15所述的载体，其特征在于，所述HIV-1GagMA蛋白是HIV-1NDK的HIV-1GagMA 蛋白。
17.如权利要求16所述的载体，其特征在于，所述载体编码序列SEQID N0:4的氨基酸序列。
18.一种用于产生包装载体的方法，所述方法包括:将来自非B亚型HIV-1病毒的Gag和/或Pol序列插入质粒中受非HIV启动子控制，以产生所述包装载体。
19.一种用于产生慢病毒载体的方法，所述方法包括向细胞给予编码非B亚型HIV-1Gag或Pol蛋白的包装载体和慢病毒载体。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法还包括选择包装载体，所述包装载体包装的慢病毒载体的效价高于编码B亚型HIV-1Gag或Pol蛋白的相同包装载体。
【文档编号】C12N15/867GK104039968SQ201280046712
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年9月25日 优先权日:2011年9月26日
【发明者】T-L·特兰, P·沙纽, C·伯奇 申请人:赛拉福柯蒂斯公司, 巴斯德研究院