专利名称：白桦GA20ox1基因BpGA20ox1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及的是白桦GA20OX1基因BpGA20oxl及其应用。
背景技术：
赤霉素(Gibberellins,简称GAs)是高等植物整个生命周期中极为重要的生长调节剂，可影响植物整个生命周期中的生长和发育过程，主要包括促进种子发芽、嫩芽和茎的伸长、叶片扩展、毛状体发育、花和果实发育等过程，而且在树木木材形成过程中也具有重要作用。GA20氧化酶(GA20ox)是具有生物活性GAs生物合成调控酶，属于可溶性的双加氧酶，它能在GAs生物合成的最后阶段催化从GA12到GA9及GA53到GA20 —系列的氧化反应，经连续氧化失去CO2的过程，最后形成具有生物活性的GA4和GAl。合成GA20ox功能缺失的突变体具有半矮化的表型，而过量表达GA20氧化酶则能导致赤霉素的过量合成和植株生长速度的明显加快。因此，GA20-氧化酶是GAs合成过程中关键的限速酶。随着分子生物学的不断发展，对GA20氧化酶基因的研究是了解赤霉素的作用机理的重要基础之一。编码GA20ox的基因在许多植物中已经被克隆并进行深入的表达分析，例如拟南芥、土豆(Solanum tuberosum)、7jC稻(Oryza sativa)、南瓜(Cucurbita moschata)、向日葵(Helianthus annuus)、玉米、苹果(Malus x domestica)、棉花(Gossypium hirsutum)等。如Carrera等人通过遗传修饰GA20ox基因水平来改变土豆体内的GA含量，研究证实，与对照相比，在转基因土豆中，GA20OX基因正义转化可使其植株高度增加、节间增长以及块茎休眠时间缩短，而反义转化植株则相反，植物整体的生长和发育模式受到了抑制。白桦(Betula platyphylla)为我国东北与内蒙古地区的先锋树种，是非常优良的短周期阔用材树种。目前，对白桦内源激素相关基因的分子机理研究尚无报道。因此，本项研究将通过克隆与分析白桦GA20oxl基因，对其系统分析和研究，为培育出生长速度快、纸浆性状得到显著改善的转GA20oxl基因纸浆用材新品种奠定基础，这对于通过分子育种手段加速纸浆材林木新品种具有较大意义。
发明内容
为了加速白桦(Betulaplatyphylla)木材分子育种的进程，本研究对对白桦GA20氧化酶基因克隆和功能研究。本发明的技术方案如下白桦GA20oxl基因BpGA20oxl，其核苷酸序列如SEQ ID NO 14所示。所述的白桦GA20oxl基因BpGA20oxl应用，可以应用于纸浆用材林木新品种的育种。本发明首先克隆并获得白桦GA20oxl基因。利用已知的与白桦亲缘关系较近的几个物种的GA20OX基因序列，根据保守区设计兼并引物克隆出了白桦GA20氧化酶基因片段，之后利用RACE技术获得一条1586bp的cDNA序列。经序列比对分析，其与欧洲GA20oxl蛋白的同源性高达99%，将该基因命名为BpGA20oxl基因，该基因全长编码序列为1164bp，共编码387个氨基酸，BpGA20oxl蛋白的分子量为44. 3kDa，理论等电点为6. 5，是20G_FeII_Oxy基因家族的成员。然后，本发明利用荧光实时定量PCR研究了 BpGA20oXl在顶端分生组织、嫩叶、成熟叶、叶柄、、未成熟木质部、成熟木质部、节间和韧皮部的表达情况，结果发现，BpGA20oxl在成熟木质部中表达丰度最高，在幼嫩叶片中的表达量较高，在未成熟木质部、韧皮部、顶端分生组织和成熟叶中则表达丰度中等，而在叶柄中有少量表达，在节间组织中表达丰度相对最低。本发明还构建了正义植物表达载体pR0K2-GA20oxl，并通过农杆菌介导法将其转入烟草，对转化植株的PCR检测初步证明外源基因已经整合到烟草基因组中。对转BpGA20oxl基因烟草植株及未转基因烟草植株的综纤维素含量和Klason木质素含量测定和分析表明，过表达BpGA20oxl基因的烟草综纤 维素含量和纤维长度比对照组均有不同程度的提高，而Klason木质素含量并无明显变化。这表明通过基因技术，可培育出生长速度快、纸浆性状得到显著改善的转BpGA20oxl基因的纸浆用材林木新品种，这对于通过分子育种手段加速纸浆材林木新品种培育进程意义重大。
图1为白桦茎木质部总RNA的电泳检测。图2为BpGA20oxl基因片段PCR扩增产物的电泳检测。图3为BpGA20oxl基因片段转化子PCR鉴定电泳检测，M为DNA MarkerDL2000 ；Γ8为随机挑取的单菌落PCR产物。图4为5 ’ RACE扩增产物电泳检测。图5为5 ’ RACE扩增产物转化子电泳检测。图6为3 ’ RACE扩增产物电泳检测。图7为3 ’ RACE扩增产物转化子电泳检测，M为DNA Marker DL2000 ; I 7为随机挑取的单菌落PCR产物。图8为白桦BpGA20oxl蛋白的保守区预测。图9为不同物种的GA20oxl基因编码氨基酸的系统进化树分析。图10为带酶切位点的BpGA20oxl基因电泳检测。图11为BpGA20oxl基因与pR0K2双酶切电泳检测，M为DNA Marker DL2000 ；1为pR0K2质粒；2为酶切后pR0K2质粒；3为BpGA20oxl基因；4为酶切后BpGA20oxl基因。图12为pR0K2_GA20ox重组质粒PCR产物电泳检测。图13为pR0K2-GA20ox重组质粒酶切产物电泳检测，M为DNA Marker DL2000 ；1为酶切后BpGA20oXl基因；2和3为酶切后重组质粒。图14为重组质粒(pR0K2_GA20oxl)农杆菌转化鉴定电泳检测。图15为非转基因烟草和转基因烟草生长不同时期的对比，M为DNAMarkerDL2000 ；Γ8为随机挑取的转化子PCR产物。图16为部分转BpGA20oxl基因烟草PCR鉴定，M为DNAMarker DL2000 ；P为阳性对照；W为水对照；ck为非转基因植株；其余为转基因烟草株系。
图17为部分转BpGA20oxl烟草的综纤维素含量。图18为部分转BpGA20oxl烟草的木质素含量。图19为部分转BpGA20oxl烟草的纤维素长度，ck为野生型烟草；其余为转基因烟草。图20为定量PCR弓丨物电泳检测。图21为实时定量RT-PCR分析BpGA20oxl基因在白桦不同组织中的表达，I为叶柄；2为顶端分生组织；3为嫩叶；4为成熟叶；5为未成熟木质部；6为成熟木质部；7为韧皮部；8为节间。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例一、基因克隆I材料与方法1.1.1 材料东北林业大学试验林场15年生白桦，白桦地上茎20cm以上截取40cm茎段，剥皮后，有刀片轻轻刮去木质部最外的一层透明状形成层后，再用刀片刮木质部组织直至有较重摩擦感时停止，收集材料后液氮将其冷冻，置于-80°C冰箱。1.1.2菌种与载体DH5 α大肠杆菌(Escherichia coli)感受态(购自天为时代)、pMD18_T载体(购自大连宝生物公司)。1.1. 3试剂和药品质粒提取试剂盒(天根)、琼脂糖(Sigma)、牛肉膏(Sigma)、蛋白胨(Sigma);实时定量 RT-PCR 试剂盒、RACE cDNAAmplif ication 试剂盒、LA Taq 酶、DNA 分子量标准 DL2000 均购自TaKaRa公司；DNA消化酶、胶回收试剂盒购自Promega公司。其它试剂为国产或进口分析纯。1.1. 4主要仪器设备PCR 仪(GeneAmpPCRsystem9700);核酸测定仪(Eppendof );凝胶成像系统(UVP)；高速台式冷冻离心机(Heraeus );微量台式高速离心机(HITAICH) ；-70 V超低温冰箱(Harris) ;_20°C低温冰箱(海尔)；超净工作台(AIR TECH);高压灭菌锅(SANYO);超纯水仪(Millipore);微量移液器(Eppendof ) ；AFlOO 制冰机(Scotsman);突光定量 PCR 仪(MJResearch);电子天平(Sartorius) ；HH-B11型电热恒温培养箱(上海文进医疗器械厂生产)；HZQ-XlOO型空气振荡培养箱(哈尔滨市东明医疗仪器厂)。1. 2试验方法1. 2.1白桦木质部总RNA提取(I)向 1. 5mT, Eppendorf 管中加入 O. 6mL2XSDS,O.1mLβ-mercaptoethanol,
O.35mL的Tris饱和酚，O. 35mL氯仿；(2)取-80°C保存备用的白桦木质部组织于液氮中充分研磨，迅速加入到提取液中，振汤混勾;(3) 12000r/min4°C离心 15min ；
(4)取上清，加入O. 35mL的Tris饱和酚和O. 35mL氯仿，振荡混匀，12000r/min4°C离心IOmin ；(5)取上清,加入O. 7mL的氯仿,振荡混勻，12000r/min4°C离心IOmin ；(6)取上清，加入1/2体积的无水乙醇和1/2体积8M/L LiCl，冰上放置lOmin，沉淀 RNA ；(7) 12000r/min4°C离心lOmin，弃上清，用70%无水乙醇洗沉淀，气干后沉淀溶于
50μ L DEPC 水中；
(8 ) 6管合并成I管，加等体积Tri s酚/氯仿，振荡混匀，12000r/min4 °C离心3min ；(9)取上清,加入等体积的氯仿,振荡混勻，12000r/min4°C离心5min ；(10)取上清，加入3倍体积的无水乙醇，终浓度为O. 3mol/L的NaAc，_70°C放置15min ；(11) 12000r/min4°C离心15min,气干后沉淀溶于适量DEPC水中；(12)加入 DNase I 去除 DNA ；(13)取少量RNA采用O. 8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，用紫外分光光度计进行纯度检测及定量。1. 2. 2cDNA 第一链的合成反转录体系
5PrimeScript !V1reaction Buffer 2.0 liL Random 6 rnersO ^ uL
Oligo (dT) Primer0.5 μ
PrimeScript Ιλ1 RT Enzyme Mix I 0 ^ uLTotal RNA1.0 gg
无菌水至10 \iL·反应程序37°C 15min，85°C 5s。产物稀释10倍，作为后续PCR模板。1. 2. 3BpGA20oxl基因片段的克隆1. 2. 3.1 引物设计根据GenBank 中登录的板栗(Castanea mollissima),苹果(Malus domestica),欧洲山杨(Populus tremula)银白杨(Populus alba)夹竹桃(Nerium oleander)、欧洲山毛榉(Fagus sylvatica)等物种的GA20ox基因序列，依照基因的同源性设计简并引物GA20F1 TC (CT) AA (AG) (CT) T (TG) CCATGGAAAGGA20R1 ACTTG (AG)TCTTG(AG)TGAAG(GT) AT1. 2. 3. 2RT-PCR 反应反应体系IOxPCR buffer5.0^
dNTPs (2.5 mmol/L)4.0 μ
Mg2+ (25mmoi/L)3.0 (iL
正义引物(10 μηιοΙ/L )2.0μ
反义引物(10 μηιοΙ/L)2.0 μ
cDNA 模板2.0 μ
Taq DNA 聚合酶1.5μΙ^
去离子水补足至50叫反应条件94°C预变性4min ;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；最后72°C延伸7min。PCR产物在1. 0%的琼脂糖凝胶上电泳检测。1. 2. 3. 3PCR产物与克隆载体pMD18_T连接将PCR产物进行胶回收(Promega胶回收试剂盒)，然后连接到pMD18_T上。连接体系
Solution5.0 μL
pMD18-T 载钵1.0 iiL
目的片段2.0 μ
去离子水补足至 10 nL反应条件16 °C，过夜。1.2. 3.4重组质粒转化大肠杆菌(I)在已融化的大肠杆菌感受态细胞(50 μ I/管)中加入5μ I目的片段，吸打混匀，冰置30min ；(2)将感受态细胞放入42°C水浴中热激90s，后快速置于冰上2 3min ；(3)在上述感受态细胞中加入500 μ LLB液体培养基，37°C振床培养Ih ；(4)将IOOmL LB固体培养基熔化，分别加入ImL氨卞青霉素(100mg/mL)、ImLIPTG (23mg/mL)和2mL X-gal (20mg/mL)混匀，倒入培养皿，使之冷却；(5)取IOOyL已转化的感受态细胞加到已有培养基的培养皿中，用涂布棒涂匀，倒置培养皿，37°C培养12 16h ；1. 2. 3. 5 菌落检测挑取白色单菌落置于三角瓶中，37°C振床培养6h ;菌液PCR检测转化子，反应体系及条件同本实施例1. 2. 3. 2 ;之后菌液送至北京华大六合生物公司测序。1. 2. 4扩增产物的5’端和3’端RACE1. 2. 4.1RACE 引物 根据本节1. 2. 3中扩增片段的测序结果分别合成5’和3’端的特异性引物OuterGSP和Inner GSP，5’和3’RACE通用引物由5’和3’ RACE试剂盒(TaKaRa)提供。详见表
I 表IRACE扩增引物序列
权利要求
1.白桦GA20oxl基因BpGA20oxl，其核苷酸序列如SEQID NO :14所示。
2.根据权利要求1所述的白桦GA20oxl基因BpGA20oxl应用，其特征在于，应用于纸浆用材林木新品种的育种。
全文摘要
本发明公开了白桦GA20ox1基因BpGA20ox1，其核苷酸序列如SEQ ID NO14所示。过表达BpGA20ox1基因的烟草综纤维素含量和纤维长度比对照组均有不同程度的提高，而Klason木质素含量并无明显变化。可培育出生长速度快、纸浆性状得到显著改善的转BpGA20ox1基因的纸浆用材林木新品种，这对于通过分子育种手段加速纸浆材林木新品种培育进程意义重大。
文档编号C12N15/53GK103014031SQ20131001736
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月17日 优先权日2013年1月17日
发明者魏志刚, 张凯旋, 杨传平 申请人:东北林业大学