专利名称：甲醛降解菌及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及甲醛降解菌及其用途，属于生物技术领域。
背景技术：
甲醛作为一种重要的化工原料，广泛应用于塑料、制胶、皮革、染料等行业，是相关工业排放废水中的主要有害污染物。甲醛具有极高的化学活性，易发生加成、还原、聚合反应，它易溶于水，同时也能溶解于多种有机溶剂，由于其显著的细胞毒性、致癌和致畸性，寻求高效防治甲醛污染策略对人类健康和环境保护有着重大意义。目前，处理甲醛废水的方法主要分为物理化学处理法和生物处理法两大类。物理化学处理法普遍存在成本高、操作复杂及二次污染等问题，考虑到环境和经济因素，生物处理法有着更为广阔的前景。但是甲醛对微生物有强烈的抑制作用，高浓度的甲醛能在短时间内对活性污泥体系造成不可回复的破坏，因此筛选高耐受高效菌株已经成为甲醛生物处理的关键。目前，国内外学者已经在许多菌属发现了能够降解甲醛的微生物。黄赛花等(2007)报道(黄赛花，陈能场.一株甲醒降解真菌Aspergillus app.H4的分离鉴定.生态环境，2007，16(4): 1175-1179.)筛选得到一株真菌，它能在144h内将1.241g/L甲醛降解至0.004g/L ；Doronina 等(Doronina NV, Ezhov VA, Trotsenko YuA.Aerobic biodegradationof formaldehyde, methanol and methylamine by immobilized Methylobacteriumextorquens cells.Appl.Biochem.Microbiol.1997, 33:138-141.)分离得到一株Pseudomonas alcaligenes,能在 72h 内完全降解 2g/L 甲醒；Mirdamadi 等(MirdamadiS，Rajabi A,Khalilzadeh P,Norozian N, Akbarzadeh A,Mohseni FA.1solation ofbacteria able to metabolize high concentrations of formaldehyde.World J.Microb.Biot.2005, 21:1299-1301.)报道 Methylobacterium extorquens PSS 和 ESS 能完全降解2.96g/L 甲醒,Pseudomonas pseudoalcaligenes OSS 能在 24h 完全降解 3.7g/L 甲醒。但是，迄今为止国内外报道的甲醛降解菌仍然存在耐受浓度低，降解速度慢等缺点，限制了其实际应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种耐受浓度较高的甲醛降解菌。本发明甲醛降解菌，其为采自四川彭山贝尔化工有限公司内长期受甲醛污染的土壤中分离得到的新菌株。该菌株已于2012年10月25日在中国典型培养物保藏中心(地址:武汉市武昌珞珈山，武汉大学，邮编:430072)保藏，分类命名为耶氏副球菌(Paracoccusyeei) scuhtp-FD3，保藏号为 CCTCC N0.M 2012430。本发明甲醛降解菌为革兰氏阴性菌，菌落为乳白色，呈圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，中心凸起。本发明甲醛降解菌经16S rDNA序列测序，结果在NCBI数据库中进行同源性比对，菌株与Paracoccus yeei G1212亲缘关系最近，同源性达99%以上。菌株的16SrDNA序列如Seq ID NO l所示。
本发明甲醛降解菌具有高效降解甲醛的能力，该菌株对甲醛的耐受浓度可达12g/L，48h可将其降解87%，22h可完全降解8g/L甲醛。此菌株的甲醛耐受性和降解速率比已有文献报道的甲醛降解菌明显要高。本发明甲醛降解菌可以通过下述方法筛选得到:1、菌源采自四川彭山贝尔化工有限公司内长期受甲醛污染的土壤，采集距表层3-6cm的土壤样品11份；2、称取1Og 土样加入到20ml无菌蒸馏水中，充分打散，静置后取5ml上清液接种于45ml含0.5g/L甲醛的MSM培养基中，于30°C、150rpm培养72h ；3、取培养液5ml转接至新鲜MSM培养基中，甲醛浓度提高至lg/L，同样条件下培养72h,然后取5mL培养液转移至新鲜MSM培养基中，如此反复5次，其中甲醛浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5g/L ;将含甲醛2.5g/L的驯化液按不同比例梯度稀释，分别涂布于含甲醛Ig/L的MSM平板上，30°C培养3d。挑取边缘清晰的菌落，经BPM培养基平板反复划线纯化直到获得单菌落，并分别进行甲醛降解实验；4、确定各菌株降解能力后，以BPM培养基斜面保藏降解性能优良的菌株。5、菌株的鉴定1)、甲醛降解菌Scuhtp-FD3的菌落形态特征及生理生化特征:将已充分活化的菌株Scuhtp-FD3接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，生长48h后观察菌落为乳白色，呈圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，中心凸起。经染色镜检，该菌为革兰氏阴性菌，椭球状，无鞭毛，不运动。好氧，呼吸代谢；接触酶阳性，氧化酶阳性。2)、甲醒降解菌scuhtp_FD3的16s rDNA鉴定:16s rDNA序列的扩增米用正向引物(Seq ID N02) 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物(Seq ID N03)5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，以细菌总DNA为模板，PCR反应程序如下:95°C变性5min，95°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s，共 35 个循环；72°C 10min，4°C保存。PCR 产物测序由上海英俊生物技术有限公司完成。将得到的16S rRNA序列登录GenBank，进行Blast同源比对并构建进化树。经比对发现，菌株scuhtp_FD3的16S rRNA基因与Paracoccus yeei的16SrRNA基因序列同源性最高，为99%。结合形态、生理生化指标和16S rRNA基因序列分析，初步鉴定菌株 scuhtp_FD3 为 Paracoccus yeei。本发明还提供了含有上述本发明甲醛降解菌的甲醛降解试剂。本发明还提供了上述的本发明甲醛降解菌用于降解甲醛的用途。本发明还提供了上述甲醛降解试剂用于降解甲醛的用途。进一步的，本发明甲醛降解菌降解甲醛的最适条件为30°C、pH7.0。因此，本发明甲醛降解菌和本发明甲醛降解试剂优选在30°C，pH7.0条件下降解甲醛。另外，本发明甲醛降解菌对盐分的耐受能力较强，盐度l_10wt%条件下12h对5g/L甲醛的降解率超过90%，，优于已报道的其它同功能菌株，适用于高盐环境下的甲醛废水降解。其中，上述的盐分可以是含有甲醛的工业废水中常含有的盐分，比如:氯化钠，各种重金属盐等。因此，本发明甲醛降解菌和本发明甲醛降解试剂优选在盐浓度0-10wt%的液态环境中降解甲醛。本发明甲醛降解菌和本发明甲醛降解试剂对甲醛的耐受性高，甲醛降解速率快，本发明为含甲醛废水的处理特别是高盐甲醛废水的处理提供了一种新的途径，具有广阔的应用前景。
图1为培养温度对菌株scuhtp_FD3降解甲醛的影响；图2为初始pH值对菌株scuhtp_FD3降解甲醛的影响；图3为摇床转速对菌株scuhtp_FD3降解甲醒的影响；图4为菌株scuhtp_FD3降解不同浓度甲醛的过程；图5为盐浓度对菌株scuhtp_FD3降解甲醛的影响；图6为菌株scuhtp_FD3降解高盐甲醛实际废水的过程。
具体实施例方式本发明甲醛降解菌，其为采自四川彭山贝尔化工有限公司内长期受甲醛污染的土壤中分离得到的新菌株。该菌株已于2012年10月25日在中国典型培养物保藏中心(地址:武汉市武昌珞珈山，武汉大学，邮编:430072)保藏，分类命名为耶氏副球菌(Paracoccusyeei) scuhtp-FD3，保藏号为 CCTCC N0.M 2012430。本发明甲醛降解菌为革兰氏阴性菌，菌落为乳白色，呈圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，中心凸起。本发明甲醛降解菌经16S rDNA序列测序，结果在NCBI数据库中进行同源性比对，菌株与Paracoccus yeei G1212亲缘关系最近，同源性达99%以上。菌株的16SrDNA序列如Seq ID NOl所示。本发明甲醛降解菌具有高效降解甲醛的能力，该菌株对甲醛的耐受浓度可达12g/L，48h可将其降解87%，22h可完全降解8g/L甲醛。此菌株的甲醛耐受性和降解速率比已有文献报道的甲醛降解菌明显要高。本发明甲醛降解菌可以通过下述方法筛选得到:1、菌源采自四川彭山贝尔化工有限公司内长期受甲醛污染的土壤，采集距表层3-6cm的土壤样品11份；2、称取IOg 土样加入到20ml无菌蒸馏水中，充分打散，静置后取5ml上清液接种于45ml含0.5g/L甲醛的MSM培养基中，于30°C、150rpm培养72h ；3、取培养液5ml转接至新鲜MSM培养基中，甲醛浓度提高至lg/L，同样条件下培养72h,然后取5mL培养液转移至新鲜MSM培养基中，如此反复5次，其中甲醛浓度分别为0.5、
1、1.5、2、2.5g/L ;将含甲醛2.5g/L的驯化液按不同比例梯度稀释，分别涂布于含甲醛Ig/L的MSM平板上，30°C培养3d。挑取边缘清晰的菌落，经BPM培养基平板反复划线纯化直到获得单菌落，并分别进行甲醛降解实验；4、确定各菌株降解能力后，以BPM培养基斜面保藏降解性能优良的菌株。5、菌株的鉴定I)、甲醛降解菌Scuhtp-FD3的菌落形态特征及生理生化特征:将已充分活化的菌株Scuhtp-FD3接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，生长48h后观察菌落为乳白色，呈圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，中心凸起。经染色镜检，该菌为革兰氏阴性菌，椭球状，无鞭毛，不运动。好氧，呼吸代谢；接触酶阳性，氧化酶阳性。2)、甲醒降解菌s cuhtp_FD3的16s rDNA鉴定:16s rDNA序列的扩增米用正向引物(Seq ID N02) 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物(Seq ID N03)5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，以细菌总DNA为模板，PCR反应程序如下:95°C变性5min，95°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s，共 35 个循环；72°C 10min，4°C保存。PCR 产物测序由上海英俊生物技术有限公司完成。将得到的16S rRNA序列登录GenBank，进行Blast同源比对并构建进化树。经比对发现，菌株scuhtp_FD3的16S rRNA基因与Paracoccus yeei的16SrRNA基因序列同源性最高，为99%。结合形态、生理生化指标和16S rRNA基因序列分析，初步鉴定菌株 scuhtp_FD3 为 Paracoccus yeei。本发明还提供了含有上述本发明甲醛降解菌的甲醛降解试剂。本发明还提供了上述的本发明甲醛降解菌用于降解甲醛的用途。本发明还提供了上述甲醛降解试剂用于降解甲醛的用途。进一步的，本发明甲醛降解菌降解甲醛的最适条件为30°C、pH7.0。因此，本发明甲醛降解菌和本发明甲醛降解试剂优选在30°C，pH7.0条件下降解甲醛。另外，本发明甲醛降解菌对盐分的耐受能力较强，盐度l_10wt%条件下12h对5g/L甲醛的降解率超过90%，，优于已报道的其它同功能菌株，适用于高盐环境下的甲醛废水降解。其中，上述的盐分可以是含有甲醛的工业废水中常含有的盐分，比如:氯化钠，各种重金属盐等。因此，本发明甲 醛降解菌和本发明甲醛降解试剂优选在盐浓度0-10wt%的液态环境中降解甲醛。下面结合实施例对本发明的具体实施方式
做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例1甲醛降解菌scuhtp-FD3的分离筛选及鉴定1、培养基及试剂活化培养基(BPM):牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L, NaC15g/L，蒸馏水IOOOmL,ρΗ7.3-7.5。基础盐培养基(MSM)=NH3NO3lg/L, K2HPO4.3Η201.73g/L, KH2PO40.68g/L,MgSO4.7H200.2g/L, FeSO4.7H200.03g/L, MnSO4.H2O0.03g/L, CaCl2.6H200.02g/L, pH7.0。2、甲醛检测方法甲醛检测方法参照修订后的GB/T 13197-1991 (水质甲醛的测定乙酰丙酮分光光度法[S].),吸取适量试样于25mL具塞刻度试管中,用水稀释至标线,加入2.5mL乙酰丙酮溶液摇匀，于60°C水浴15min，取出冷却至室温后，在波长414nm处以水为参比测量吸光度，减去空白管测得的吸光度，然后根据标准曲线计算试样中甲醛含量。3、菌株的筛选及纯化(1)菌种来源菌源采自四川彭山贝尔化工有限公司内长期受甲醛污染的土壤，采集距表层3-6cm的土壤样品11份。(2)菌株的分离纯化称取IOg 土样加入到20ml无菌蒸懼水中，充分打散，静置后取5ml上清液接种于45ml含0.5g/L甲醛的MSM培养基中，于30°C、150rpm培养72h。取培养液5ml转接至新鲜MSM培养基中，甲醛浓度提高至lg/L，同样条件下培养72h，然后取5mL培养液转移至新鲜MSM培养基中，如此反复5次，其中甲醛浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5g/L ;将含甲醛2.5g/L的驯化液按不同比例梯度稀释，分别涂布于含甲醛lg/L的MSM平板上，30°C培养3d。挑取边缘清晰的菌落，经BPM培养基平板反复划线纯化直到获得单菌落，并分别进行甲醛降解实验。确定各菌株降解能力后，以BPM培养基斜面保藏降解性能优良的菌株。4、菌株的鉴定(I)甲醛降解菌scuhtp-FD3的菌落形态特征及生理生化特征将已充分活化的菌株Scuhtp-FD3接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，生长48h后观察菌落为乳白色，呈圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，中心凸起。经染色镜检，该菌为革兰氏阴性菌，椭球状，无鞭毛，不运动。好氧，呼吸代谢；接触酶阳性，氧化酶阳性。(2)甲醒降解菌 scuhtp_FD3 的 16s rDNA 鉴定16s rDNA序列的扩增采用正向引物5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，以细菌总DNA为模板，PCR反应程序如下:95°C变性5min，95°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s，共 35 个循环；72°C 10min，4°C保存。PCR 产物测序由上海英俊生物技术有限公司完成。将得到的16S rRNA序列登录GenBank，进行Blast同源比对并构建进化树。经比对发现，菌株scuhtp_FD3的16S rRNA基因与Paracoccus yeei的16SrRNA基因序列同源性最高，为99%。结合形态、生理生化指标和16S rRNA基因序列分析，初步鉴定菌株 scuhtp_FD3 为 Paracoccus yeei。试验例I甲醒降解菌scuhtp_FD3的降解特性1、培养条件对菌株降解能力的影响种子菌液:将菌种接种于富集培养基(BPM)培养过夜，取培养液于4000rpm离心IOmin,以0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤2次，配置为细胞浓度1.0X 109cellS/mL的菌悬液，作为种子液，进行本实施例的实验研究及后续实施例的实验研究，如无特殊说明，接种量均为1%(ν/ν)。(I)培养温度影响考察不同的培养温度(20、25、30、35、40°C )对菌株scuhtp_FD3降解甲醛的影响。在锥形瓶中，将种子液接种到25mL含甲醛5g/L的基础盐培养基(MSM)中，摇瓶培养12h后测定甲醛残留量，计算去除率，其结果如图1所示。由图1可知30°C为最适温度，菌株scuhtp-FD3能在12h内将5g/L甲醛降解至97%。值得注意的是当温度低至20°C时，菌株FD3对甲醛的降解率仍>90%，说明该菌具有一定的抗低温能力。(2)初始pH的影响考察不同的初始pH值(5、6、7、8、9)对菌株scuhtp_FD3降解甲醛的影响。在锥形瓶中，将种子液接种到25mL含甲醛5g/L的基础盐培养基(MSM)中，摇瓶培养12h后测定甲醛残留量，计算去除率，其结果如图2所示。由图2可知中性环境更适合菌株FD3降解甲醛，最适pH值为7，pH值小于4或大于10，该菌无法生长。(3)摇床转速的影响考察不同的摇床转速(90、120、150、180、210rpm)对菌株scuhtp_FD3降解甲醛的影响。在锥形瓶中，将种子液接种到25mL含甲醛5g/L的基础盐培养基(MSM)中，摇瓶培养12h后测定甲醛残留量，计算去 除率，其结果如图3所示。由图3可知当转速为90rpm时甲醛降解率明显低于转速为120、150和180rpm时的降解率，而转速处于150_180rpm时降解率变化很小，可认为转速到达150rpm时已能满足菌株scuhtp_FD3降解甲醒的溶氧需求。
2、最适条件下菌株Scuhtp-FD3对各浓度甲醛的降解根据前述培养条件对甲醛降解影响的实验得出，菌株Scuhtp-FD3降解甲醛的最适条件为温度30°C，pH值7，摇床转速150rpm，在此条件下考察该菌对不同浓度甲醛的降解。在锥形瓶中，将种子液接种到25mL含甲醛5g/L的基础盐培养基(MSM)中，在最适条件下摇瓶培养，连续测定培养液中甲醛残留量，其结果如图4所示。由图4可知菌株scuhtp-FD3可在6h完全降解lg/L甲醛，随着甲醛浓度提高，完全降解所需时间也不断延长，完全降解5g/L和8g/L甲醛分别需时16和22h，所有浓度下均未观察到延滞期出现。试验例2甲醒降解菌scuhtp_FD3的耐盐性考察不同的NaCl浓度(O、1、5、10、15%，质量百分含量)对菌株scuhtp_FD3降解甲醛的影响。在锥形瓶中，将种子液接种到25mL含甲醛5g/L的基础盐培养基(MSM)中，摇瓶培养12h后测定甲醛残留量，计算去除率，其结果如图5所示。由图5可知当NaCl浓度低于5%时，菌株scuhtp-FD3降解甲醛几乎没有受到影响，12h内对5g/L甲醛的降解率均>95% ；当NaCl浓度为10%时，降解率有所下降，但仍维持在较高水平，降解率>80%，当盐浓度继续升高时，该菌的生长和甲醛降解均收到严重抑制。结果表明，菌株scuhtp-FD3为耐盐菌，在液体培养基中的耐盐度为0-10%。试验例3甲醛降解菌Scuhtp-FD3对高盐甲醛实际废水的降解本试验例所述废水取自四川新津某化工厂，其COD值为14.33g/L，甲醛浓度
4.51g/L，NaCl浓度6.9%，pH值1.1-1.2。在试验中，取废水25mL置于锥形瓶中，调节pH至
7.0，以1%接种量加入scuhtp-FD3种子液，于30°C，150rpm摇瓶培养，连续测定培养液中甲醛残留量，其结果如图6所示。由图6可知，Scuhtp-FD3在26h内完全降解4.51g/L甲醛，这充分说明其在高COD高盐浓度 的实际废水环境中仍能保持对甲醛的高效降解，而对照组甲醛几乎无降解。
权利要求
1.醒降解菌，其特征在于:命名为耶氏副球菌(Paracoccusyeei) scuhtp_FD3,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0.M2012430。
2.有权利要求1所述的甲醛降解菌的甲醛降解试剂。
3.权利要求1所述的甲醛降解菌用于降解甲醛的用途。
4.权利要求2所述的甲醛降解试剂用于降解甲醛的用途。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于:在30°C,pH7.0条件下降解甲醛。
6.根据权利要求3或5所述的用途，其特征在于:在盐浓度0-10wt%的液态环境中降解甲醒。
7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于:在30°C,pH7.0条件下降解甲醛。
8.根据权利要求4或7所述的用途，其特征在于:在盐浓度0-10wt%的液态环境中降解甲醒。
全文摘要
本发明涉及甲醛降解菌及其用途，属于生物技术领域。本发明所解决的技术问题是提供了一种耐受浓度较高的甲醛降解菌。本发明甲醛降解菌，命名为耶氏副球菌(Paracoccus yeei)scuhtp-FD3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M 2012430。本发明甲醛降解菌和本发明甲醛降解试剂对甲醛的耐受性高，甲醛降解速率快，本发明为含甲醛废水的处理特别是高盐甲醛废水的处理提供了一种新的途径，具有广阔的应用前景。
文档编号C12R1/01GK103087952SQ20131001693
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月17日 优先权日2013年1月17日
发明者侯太平, 陶科, 刘崑, 赵浩宇, 耿宇聪 申请人:四川大学