使用artp诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于等离子体技术在生物学领域的应用，具体涉及一种利用常压室温等离 子体诱变筛选高活性耐受甲醒降解菌突变株方法。
【背景技术】
[0002] 甲醒是一种无色有强烈刺激性气味的有机污染物，其主要污染源来自有机合成、 塑料、涂料、装演材料及油漆等行业排放的废气、废水等，由于甲醒在接触部位较易被吸收 进入人体，可再经呼吸道吸收后引起生物细胞核基因突变、损害DNA;高浓度甲醒则对神经 系统、免疫系统等都有毒害，国际癌症研究机构（IARC)已将甲醒上升为第I类致癌物质，因 此对甲醒污染物进行防治工作对人类健康意义重大。目前去除甲醒污染的方法有活性炭吸 附、纳米光催化、莫氧负离子、植物分解等，但送些方法存在药剂消耗量大、费用高、不能将 甲醒有效去除等缺点。而生物法降解甲醒具有效果好，成本低、无二次污染等优点，因此筛 选分离具有较强降解甲醒污染物的微生物已成为近年来国内外研究热点，降解效果总体来 说是低浓度到高浓度筛选趋势。目前甲醒降解菌株没有较高的耐受甲醒浓度，送是一个重 大的难题。
[0003] 由清华大学与北京思清源生物科技有限公司联合自主研发的新型常压室温等离 子体（ARTP)生物诱变育种技术，由于其具有射流温度低（25^35°C )，活性粒子分布均匀，对 人体和环境无危害，操作简易等优势，因此ARTP为利用系统生物学和合成生物学手段构建 高性能菌株提供了平台方法。但目前未见有关于使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醒降解 菌突变株方法的报道。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述现有技术问题，本发明的目的在于提供一种使用ARTP诱变筛选高 活性耐受甲醒降解菌突变株方法，采用该方法制备的诱变菌株在甲醒耐受浓度有了极大的 提高，进而能在较高浓度下降解甲醒。
[0005] 本发明的技术方案如下：一种使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醒降解菌突变株 方法，包括如下步骤： 1) 利用ARTP诱变装置对筛选出的甲醒降解菌株进行诱变，W 99. 99%氮气作为工作 气体，在电源功率为115W、工作气流量为10 L/min、等离子体发射源与菌株之间的距离为 2mm，操作温度23. 0~35. 0。C，诱变处理时间0. 5 min~3 min ; 2) 配制甲醒浓度在100(Tl5000mg/L呈线性梯度的琼脂平板培养基，一端浓度高，另一 端浓度低，在双层梯度平板上涂布经过ARTP诱变后的菌株，3(TC恒温培养数天，挑选高浓 度区域内生长良好的菌落接入斜面培养基，得到高活性耐受甲醒突变株。所述筛选出的甲 醒降解菌株为假单胞菌，菌株为阴性菌，菌株呈短杆状。
[0006] 作为本发明进一步的改进，所述诱变处理时间为2min，其致死率控制在99% W上， 可能有利于提高菌株对甲醒的耐受程度和提高对甲醒的降解效率，综合考虑能源节约等因 素，选取ARTP处理时间2min为最佳诱变剂量 作为上述方案的进一步改进，所述突变株的抑制浓度为lOOOOmg/L《MIC《15000mg/ L此为ARTP处理时间2min是突变株的最低抑制浓度，相对野生菌株在500mg/L的甲醒平 板中良好的生长状况，2min突变株对甲醒的耐受性提高近20倍之多。
[0007] 所述筛选出的甲醒降解菌株经过富集培养和菌株分离得到，所述1)富集培养：将 长期浸泡废水的活性污泥各5 g加入100 mL LB培养基的锥形瓶中揽拌静置，LB培养基（g/ L);蛋白腺10重量份，酵母膏5重量份，化cl 10重量份，蒸傭水1 1，调抑至7. 0,1X105 化灭菌20 min,取2血上清液加入到浓度50 mg/L甲醒为碳源的LB培养基中，置于150 r/min摇床上30 ° C振荡培养，3 d转接1次菌液，每次按2% (m/v)接种量转接到新鲜培 养基中振荡培养，如此重复10次，同时将甲醒浓度从50 mg/L增加到100 mg/L ;2)菌株分 离：利用倍比稀释法涂布于含甲醒（50 mg/L)的固体平板上，将平板上长出的单菌落编号并 多次划线纯化，W确保菌株的纯度和甲醒降解性能的稳定。
【附图说明】
[0008] 图1分离株的菌落及在显微镜下观察的菌体形态； 图2菌株W1的生长曲线与甲醒降解率曲线图； 图3菌株W1的ARTP诱变致死率曲线； 图4突变菌的部分菌落放大示意图； 图5高活性突变株对不同质量浓度甲醒降解过程。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合附图，详细介绍本发明的实施例。
[0010] 1. 1菌株的筛选分离 从安徽宪湖中天印染厂采集活性污泥(长期被印染废水浸泡）作为菌种筛选样品。
[0011] 1.2试剂与仪器 牛肉膏，蛋白腺，甲醒溶液质量分数为37%，化cl, Μ拆〇4, FeS〇4 · 7&0, MnS〇4 · &0， 化CI2 · 2&0,（NH4)2S04, KH2PO4和K2HPO4等系上海国药集团化学试剂有限公司提供，均为分 析纯。
[001引 MG96G?PCR扩增仪朗基科学仪器有限公司；T化-16G高速冷冻离必机上海安亭 科学仪器厂；UV-2100分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司；Olympus CX41生物显微 镜奧林己斯公司；DYCP-31D水平电泳槽北京市六一仪器厂；SZ-97自动Η重纯水蒸傭器上 海本波仪器有限公司；扫描电镜（Scanning ElechonicMicroscope, SEM)阳I如anta 200 为安徽工程大学生物实验中必公用仪器。
[0013] 1.3培养基及培养条件 LB培养基（g/L);蛋白腺10,酵母膏5,化cllO,蒸傭水1 1，调抑至7.0，1X105化灭 菌 20 min。
[0014] 基本无机盐培养基（g/L);(畑4) 2SO4 1. 0, K2HPO4 2. 16, Μ拆O4 0. 1，KH2PO4 0. 85， MnS〇4 · &0 0. 05, CaClz · &0 0. 03, FeS〇4 · 7&0 0. 01，加蒸傭水定容至 1 L，调抑至 7. 0， 0. 68 X 1〇5 F*a 灭菌 30 min。
[001引 己醜丙丽溶液；6血冰己酸、50g己酸倭、0. 5血己醜丙丽及100血蒸傭水。
[0016] 培养条件；W下实验如无特别情况，均在30 ° C恒温培养箱振荡培养，摇床转速 150 r/min,培养 24 h。
[0017] 1.4实验方法 1. 4. 1甲醒降解菌的筛选分离： 富集培养：收集长期浸泡印染废水的活性污泥各5 g加入100 mL LB培养基的锥形瓶 中揽拌静置，取2血上清液加入到浓度50 mg/L甲醒为碳源的LB培养基中，置于150 r/ min摇床上30 ° C振荡培养。3 d转接1次菌液，每次按2% U/k)接种量转接到新鲜培养 基中振荡培养，如此重复10次，同时将甲醒浓度从50 mg/L增加到100 mg/L。
[001引菌株分离：利用倍比稀释法涂布于含甲醒（50 mg/L)的固体平板上，将平板上长出 的单菌落编号并多次划线纯化，W确保菌株的纯度和甲醒降解性能的稳定。
[0019] 1. 4. 2菌株W1生长曲线的绘制与降解甲醒的测定 将分离筛选出的菌株按2%接种量U/K)接种在甲醒浓度为100 mg/L的LB培养液中， 30 ° C条件下，转速150 r/min摇床上振荡培养，WLB培养液为空白对照，每2 h在灭菌 超净台迅速移取1 mL于灭菌的离必管中，取1 mL菌液于414 nm波长处测光密度W值，作 出W-t曲线，同步取样测定培养液在414 nm处的甲醒含量。
[0020] 参照GB/T13197-1991。取适量待测样品加入25血具塞刻度试管，用蒸傭水稀释至 刻度线后，吸取2. 5血己醜丙丽溶液加入该试管，并颠倒数次使其混匀，60。C水浴15min， 取出室温冷却比后检测在波长414nm处的吸光度，W水为参比。
[0021] 1.4. 3菌株的鉴定 菌株染色及生理生化分析，采用透射电镜观察菌株形态。
[002引提取该菌株全基因组DNA，采用通用引物扩增16S rDNA，扩增产物提交上海生工生 物工程技术服务有限公司测序，将该序列在NCBI数据库上BLAST进行比对。
[002引根据NCBI中公布的恶莫假单胞菌(Ae化/0曲(Was饼/。泌）基因序列，设计了甲醒 脱氨酶（抑H)基因特异性引物。f化-F;5' -CCATATGCTGGCAATCGTGGAGGT-3'，f化-R序列 为；5' -CTACTCGAGCGCCGCA CCCCACATCTTGTGCG-3'，由上海生工生物工程技术服务有限公 司合成。
[0024] 1. 4. 4菌株的ARTP诱变方法 利用ARTP诱变装置对筛选出的甲醒降解菌株进行诱变，W 99. 99%氮气作为工作气体， 在电源功率为115W、工作气流量为10 L/min、等离子体发射源与样品之间的距离为2mm，操 作温度23. 0-35.0 D C。为了寻找最佳的诱变处理时间，首先分别考察了照射时间为0.5 min、l min、1.5 min、2 min、2. 5 min、3 min时的细菌致死率。对处理过的样品在适当稀释 度下涂板，通过CFU来计算其致死率，并获得致死曲线W。
[00巧]致死率按如下公式计算： Lethality U T 媒)二 iU-t) / milW% 注；其中U为不经过诱变处理对照菌的总菌落数，Τ为经诱变处理后对应的总菌落 数。
[0026] 1. 4. 5浓度梯度法筛选高活性耐受甲醒菌株 配制甲醒浓度呈梯度分布的琼脂平板培养基，培养基内的甲醒浓度呈线性梯度 (1000~15000mg/L)，一端浓度高，另一端浓度低，在双层梯度平板上涂布经过ARTP诱变后 的菌株，3(TC恒温培养数天，挑选高浓度区域内生长良好的菌落接入斜面培养基上，即得到 高活性耐受甲醒