突变株，培养成熟后进行甲醒降解率的测定。
[0027] 2. 1甲醒降解菌筛选分离与鉴定 2. 1. 1菌株的形态鉴定 经过反复富集与W无机盐培养基添加甲醒为唯一碳源纯化培养，从印染厂废水处理的 活性污泥中筛选一株甲醒降解菌，命名为W1。菌株W1于30 ° C条件下培养24 h，菌落呈 圆球形，边缘规则，表面光滑湿润，有黏性，有凸起，呈乳白色；细菌革兰氏染色显示，该菌株 为阴性菌。通过扫描电镜观察菌株W1呈短杆状（图1A ;菌落，1B ;革兰氏染色（100X油镜)， 1C;扫描电镜图像（5 kV，8. 7 mmXl0.0 k))，对菌株W1的多项生理生化指标进行测定，结果 如表1所示。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》与《常见细菌系统鉴定手册》等，可初步鉴定菌 株W1为假单胞菌。
[0028] 表1菌株W1生理生化实验结果
2. 1. 2菌株的16S rDNA序列分析 提取菌株W1的全基因组DNA做模板，利用16S rDNA通用引物27F/1492R进行 PCR扩增，结果显示扩增产物大小约1.5化左右，将产物提交上海生工生物工程技术服 务有限公司克隆测序，将序列与GenBank数据库中报道的16S rDNA核巧酸序列进行 BLAST比对分析，与恶莫假单胞菌(&e化/〇曲onas /wiii/a)相似度达到96%,序列长度为1 485bp(AccessionNo. NC_002947. 3)。
[0029] 2. 2菌株W1生长曲线和甲醒降解率曲线 从图3可W看出，菌株W1的甲醒降解曲线与生长曲线基本吻合，在菌液加入培养基10 h前期，由于菌株在新环境下生长处于延滞期，菌体生长缓慢，因此对甲醒降解也稍缓慢； 随后进入对数生长期间（10 - 40 h)，培养液W值由0. 105上升至0. 680,而甲醒降解率从 21%上升到92. 0%，说明菌株W1对培养基环境适应后迅速生长的同时对甲醒的降解量也随 之升高；40 h后W值上升速度减缓直至趋于不变，开始进入稳定期，因此甲醒降解率基本 保持不变；稳定期后由于细胞繁殖越来越慢，菌体自溶，死亡数增多，50 h后细胞进入衰亡 期，甲醒降解率开始趋于下降，56 h后下降至60%。由此可W确定菌株W1处于对数生长期 所需培养时间12 - 40 h范围。
[0030] 2. 3 ARTP诱变率致死率曲线的测定 按照方法1.4.4对甲醒降解菌株W1的ARTP致死率曲线进行了测定，如图3所示。
[0031] 由图4可知，ARTP对菌株W1具有很强的致死效应，按公式对菌体的致死率进行了 计算，ARTP处理2 min时，其致死率达到了 99. 25%，处理150s与180s时致死率达到100%。 由于突变的发生具有随机性，致死率和正突变之间的关系并不是十分清楚，把致死率控制 在99% W上，可能有利于提高菌株对甲醒的耐受程度和提高对甲醒的降解效率，综合考虑 能源节约等因素，由此本研究选取ARTP处理时间2min为最佳诱变剂量。
[0032] 2. 4突变菌的菌落形态研究 根据菌落生长的大小、圆整、丰度及生长特点对获得的菌株W1突变株进行观察。诱变 1. 5min与2min筛选的突变株属于菌落生长缓慢型突变体，在经培养3d时，几乎未长任何菌 落，培养时间再长至5山其菌落直径不会达到2mm，但此时肉眼可区别，再经过14d的平板培 养，送时突变体菌落成为生长优势菌，1. 5min与2min突变体形成的菌落直径分别较野生菌 株W1大100%与200%，经t测验后，差异达极显著水平（P<0. 01)，部分菌落放大图如图4所 /J、- 〇
[0033] 2. 5高活性耐受突变株的浓度梯度平板法快速筛选 采用不同浓度甲醒梯度双层琼脂培养基中直接进行筛选，测试野生菌株Wl、l. 5min与 2min突变株最终所能耐受的甲醒最高浓度，不同浓度梯度平板统计结果如表2所示。
[0034] 表2不同甲醒浓度对野生菌W1和突变株生长的影响
注；+++表示长得好；++表示长得一般；+表示长得差；-表示单菌落数量稀少 由表2可知，随着甲醒浓度的增加，野生菌株W1在筛选平板上的单菌落数逐渐减少， 当甲醒浓度达到1500mg/L时，平板上菌落形态已经较差，而甲醒浓度达到3000mg/L时重复 平板上单菌落已经不长，继续增加甲醒浓度达到4000mg/L时平板上单菌落仍未长，因此可 确定甲醒浓度对野生菌株W1的最低抑制浓度（MIC, Minimum InhibitoiT Concentration) 为3000mg/L。而相对野生菌株Wl，突变株1. 5min与2min对甲醒的耐受浓度有明显程度 提高。其中1.5min突变株在甲醒7000mg/L开始出现菌落稀少现象，而目前2min突变株在 lOOOOmg/L的甲醒浓度平板上长势依然较好，而在15000mg/L的甲醒梯度平板中无任何生 长迹象，因此甲醒浓度对2min突变株的最低抑制浓度为lOOOOmg/L《MIC《15000mg/L。 相对野生菌株W1在500mg/L的甲醒平板中良好的生长状况，2min突变株对甲醒的耐受性提 高近20倍之多。
[0035] 2.6高活性耐受突变株对不同浓度甲醒降解率的计算 W甲醒作为菌株代谢的唯一碳源，通过ARTP诱变获得高活性耐受甲醒降解菌的2min 突变株，在含甲醒浓度分别为500、1000、2000、3000、4000、5000、6000mg/L的液体培养基 中，振荡培养2地、4她、72h、96h、12化后，测定该突变株与原野生菌株W1对甲醒的降解率， 结果如图5所示。
[0036] 由图5的甲醒降解率分析可知，经24h培养后，突变株2min在甲醒浓度为500mg/ L时，甲醒降解率最大，达到70. 7%，而野生菌株W1在该浓度下降解率为48. 8%，而2min突变 株对甲醒的降解速度比野生菌株W1明显加快；当甲醒浓度> 500mg/L时，甲醒降解率随甲 醒浓度的增加而趋于平稳。反映了甲醒浓度的增加可在一定程度促进菌株对其的降解，可 能在于甲醒为菌株的生长提供了较好的碳源与能源，随着甲醒浓度的增加，细菌大量生长 繁殖，促进了对甲醒的生物降解，但当甲醒浓度过大时，有可能阻隔了菌体与化的接触，导 致菌体不能良好地生长繁殖，细菌量变化不再明显，并且影响菌体代谢的能力，甲醒对菌株 的毒害作用也增大，送时菌株对甲醒的耐受达到极限，从而导致甲醒降解率不会再随着甲 醒浓度的增加而发生大的变化，表现为在高浓度甲醒的液体培养基中培养12化后甲醒降 解率< 20%。但总体来说，2min突变株在经12化的振荡培养后，其中对浓度500mg/L甲醒 的降解率可高达98%，对lOOOmg/L的甲醒降解率也达到了 86. 3%。
[0037] W上实施例仅用W说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例 对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可W对前述各实施 例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而送些修改或者 替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
【主权项】
1. 一种使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法，包括如下步骤： 1) 利用ARTP诱变装置对筛选出的甲醛降解菌株进行诱变，以99. 99%氦气作为工作 气体，在电源功率为115W、工作气流量为10 L/min、等离子体发射源与菌株之间的距离为 2mm，操作温度23. 0-35. 0 ° C，诱变处理时间(λ 5 min~3 min ; 2) 配制甲醛浓度在100(Tl5000mg/L呈线性梯度的琼脂平板培养基，一端浓度高，另一 端浓度低，在双层梯度平板上涂布经过ARTP诱变后的菌株，30°C恒温培养数天，挑选高浓 度区域内生长良好的菌落接入斜面培养基，得到高活性耐受甲醛突变株。2. 根据权利要求1所述的使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法，其特 征在于：所述筛选出的甲醛降解菌株为假单胞菌。3. 根据权利要求1所述的使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法，其特 征在于：所述诱变处理时间为2min。4. 根据权利要求3所述的使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法，其特 征在于：所述突变株的抑制浓度为l〇〇〇〇mg/L彡MIC彡15000mg/L。5. 根据权利要求1至4中任意一项所述的使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌 突变株方法，其特征在于：所述筛选出的甲醛降解菌株经过富集培养和菌株分离得到，所述 1) 富集培养：将长期浸泡废水的活性污泥各5 g加入100 mL LB培养基的锥形瓶中搅 拌静置，LB培养基（g/L):蛋白胨10重量份，酵母膏5重量份，Nacl 10重量份，蒸馏水1 1， 调pH至7. 0,1 X 105 Pa灭菌20 min，取2 mL上清液加入到浓度50 mg/L甲醛为碳源的LB 培养基中，置于150 r/min摇床上30 ° C振荡培养，3 d转接1次菌液，每次按2%(?/κ) 接种量转接到新鲜培养基中振荡培养，如此重复10次，同时将甲醛浓度从50 mg/L增加到 100 mg/L ； 2) 菌株分离：利用倍比稀释法涂布于含甲醛（50 mg/L)的固体平板上，将平板上长出的 单菌落编号并多次划线纯化。
【专利摘要】本发明涉及一种使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法，采用新型常压室温等离子体射流诱变系统构建降解甲醛菌株的诱变育种体系，结合高浓度甲醛梯度双层琼脂培养基筛选手段，获得一系列高活性耐受甲醛降解效率发生变化的突变株。制备的诱变菌株在相比国内外报到的甲醛耐受浓度有了极大的提高,进而能在较高浓度下降解甲醛。
【IPC分类】C12N13/00, C12N15/01
【公开号】CN105505915
【申请号】CN201410502482
【发明人】孔芳, 郭凤献
【申请人】安徽工程大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年9月26日