一种没食子酸脱羧酶的分离纯化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别设及没食子酸脱簇酶的制备及其酶学性质研究的 制备方法。
【背景技术】
[0002] 焦性没食子酸别名焦倍酪、连苯Ξ酪、焦倍酸，系统名"1，2,3-Ξ径基苯"，白色有 光泽的结晶粉末，无气味，易溶于水、醇及酸，微溶于苯、氯仿和二硫化碳;在空气中易变成 浅灰色，其水溶液易在空气中变暗，在碱性溶液中则更快，慢慢加热开始升华。焦性没食子 酸具有极强的还原性，可发生苯环上的取代反应;能于錬、钢、祕、铁、姉、铁、金、粗等生成络 合物沉淀或显色反应;其酪径基，很易进行甲基化，能形成亲电的氨键，当加入到自由基比 较活泼的单体中时，可使单体聚合速率降为零。焦性没食子酸一直在化工和化学行业具有 广泛应用，如新型感光材料、抗肿瘤新药、屯、脑血管疾病治疗新药、治疗精神障碍药物、老年 痴呆治疗药物、精细化工、轻工日化、纺织印染、微电子产业、食品保鲜、彩色印刷制版、气体 分析、稀有金属分析、照相显影等。
[0003] 18世纪末，Scheele首次通过干馈由没食子酸得到了焦性没食子酸，90年代开始人 们采用催化剂脱簇、减压脱簇、常压脱簇等方法进行制备，20世纪70年代Hurd和 化ipchandler首次利用化学方法合成了焦性没食子酸。与化学法相比，通过微生物转化进 行的生物脱簇反应具有条件较溫和、后处理较简单、成本较低、产率高、污染较少的优点。微 生物转化法是利用微生物代谢过程中产生的某种或者某一系列的酶对底物的特定部位或 者基团进行催化反应生成所需产物。没食子酸经过化学法脱簇反应后得焦性没食子酸，也 可利用生物法在没食子酸脱簇酶(Gallie Acid Decarbo巧lases，GAD)的作用下发生脱簇 反应生成焦性没食子酸(如图1)。没食子酸脱簇酶(Gallic acid decarbo巧lase，GAD)是在 降解单宁较酸的第二步起催化作用的的酶，作用是将没食子酸降解成焦性没食子酸。但是， 运种酶由于其对氧气敏感而不稳定，到目前为止，还没有将其纯化出来。
[0004] 蛋白质通常是W复杂的混合物的形式存在于生物体中，但无论是什么蛋白质都可 W找到一种适当的分离提纯方法来得到其高纯度的制品。在提取蛋白质前，需要W溶解的 形式把它从所依附的生物载体中释放出来，同时不改变它的天然活性。在提取时，由于蛋白 质在较高溫度下会变性，故通常在常溫揽拌下进行提取或超声提取。当获得蛋白质混合物 提取液后，一般会用到盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，将所需蛋白与其他杂 质初步分离。进一步提纯一般使用离子交换层析、凝胶过滤、吸附层析W及亲和层析等层析 方法，或者电泳法、膜过滤分级，因为利用膜技术可有效的避免因高溫等因素造成的蛋白质 运类活性生物大分子的失活。
[0005] 离子交换层析的介质是一种可分为阳离子型和阴离子型的离子交换剂，最常用的 为DEAE-纤维素和DEGE-纤维素，通常前者在抑<8.6的情况下使用，而后者在抑>4时用。离 子交换葡聚糖基质纤维素为交联葡聚糖，凝胶过滤的介质是内部多孔的网状结构凝胶珠， 根据不同分子量大小的蛋白质混合物在流经凝胶层析柱时会因其所经路径的不同而得到 分离，从而导致大小分子量蛋白质的先后被洗脱出来。交联葡聚糖（Sephadex)、琼脂糖 (Sephrose)和SDS-PAGE聚丙締酷胺凝胶(Polyacrylamide Gel)是目前常用的凝胶过滤介 质。MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，英文名Mahix-Assisted Laser Deso;rption/Ionization Time of Flight Mass Spectromehy)是近年来发展起来的一种 新型的软电离生物质谱，其无论是在理论上还是在设计上都是十分简单和高效的。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种没食子酸脱簇酶(GAD)的分离纯化及其酶学性质的研 究方法，本发明的技术方案是采用如下步骤来实现：
[0007] 第一步，没食子酸脱簇酶(GAD)的粗提：由降解工艺的研究可知，为保证实验的可 重现性W及后续工作的可持续性，将上文中最优工艺下的菌体细胞用含1~2mM二硫苏糖 醇、50~1 OOmM硫代硫酸钢的憐酸盐缓冲液(pH 6.0)清洗2~3次，4~6°C下超声粉碎30~ 60min(超声5s、间隔5s)，4~6°C下离屯、15~30min(10000~20000r · min-i)，即从 10~20瓶 的发酵液中提取得到50~200mL粗酶液，存于4~6°C下备用。
[0008] 第二步，没食子酸脱簇酶(GAD)的盐析:硫酸锭沉淀法是根据不同蛋白质分子在不 同浓度的盐溶液中具有不同溶解度来沉淀蛋白质的盐析方法，常用于从大量蛋白质的粗制 剂中浓缩或部分纯化蛋白质。其原理主要是高浓度的盐离子与蛋白质溶液混合后可与蛋白 质竞争水分子，破坏了蛋白质表面的水化膜，降低它的溶解度，使它从溶液中沉淀出来。考 虑到粗酶液中GAD含量有限，本实验中采用硫酸锭固体进行盐析，为了达到较好的沉淀效 果，分析了硫酸锭盐浓度、沉淀时间、抑等因素对盐析效果的影响。
[0009] 第立步，没食子酸脱簇酶(GAD)的透析:该技术是一种利用选择透过性的薄膜，W 外界化学位差为推动力，来实现双组分或者多组分分离过程的一项新技术。该分离过程中 不发生相变，无化学变化，对能量要求低，选择性好且分离条件溫和，故可将其应用在蛋白 质运类活性生物大分子的提取分离技术上。由第二步中结果可知，粗酶液中的蛋白质的大 概范围，根据已有文献中GAD的大概范围在50~70kD，故选择透过蛋白分子量分别为3500~ 5000kD、8000~HOOOkD的透析膜进行分离。
[0010] 第四步，没食子酸脱簇酶(GAD)的PA(iE聚丙締酷氨凝胶电泳初步测定其分子量：W 最晚跑出的蛋白条带lOkD为基线零点，量出其余每个条带到它的平均距离，W此为横坐标 X，它们所代表的分子量即为纵坐标Y，绘制标曲。为了证明GAD的确是胞内酶，故将发酵液通 过蛋白分子透过分子量为3000~5000的半透膜将其中的蛋白进行收集，另外，将菌体细胞 破碎后的溶液同时利用电泳检测。
[0011] 第五步，没食子酸脱簇酶(GAD)的DEAE纤维素柱的初步纯化:装柱预处理:先称取 20~40g DEAE-Cellulose树脂，用将近50~200倍体积的去离子水浸泡化，去掉上层漂浮细 粒，抽干巧~10层纱布，下同），10~20倍体积的化0H(0.5~1 .Omol · 1/1，下同）边浸泡边揽 拌20~40min，抽干，去离子水冲洗至pH = 8~10，抽干，10~20倍体积的肥1 (0.5~1.Omol · [1，下同）边浸泡边揽拌30min，抽干，去离子水冲洗至中性，抽干，0.5~1.Omol · [1的NaOH 浸泡20~40min，柱子装好后用化Cl(5~10%)洗至CΓ型的。柱子的再生:Na0H浸泡20~ 40min，同时玻璃棒揽拌，抽干，水洗至抑为8~10，抽干，肥1浸泡20~40min，同时玻璃棒揽 拌，抽干，水洗至中性，抽干，NaO取曼泡20~40min使纤维素树脂转为0H-型，装柱后用5~ 10%化Cl洗脱使体系转为cr型。装柱:填料的时候首先在柱子中加入的去离子水或者 缓冲溶液，然后把柱料调成糊状(大概是1:1~10或者再稀一点），运样上柱没有气泡，柱料 全部填充完毕后，加入去离子水或者缓冲溶液进行沉降，使柱子更加紧实，W便更好的分离 蛋白质。
[001^ 第六步，没食子酸脱簇酶(gad)的葡聚糖凝胶柱的进一步纯化:预处理:将5~lOg 葡聚糖凝胶(Sephadex)干粉置于50~200mL蒸馈水中，玻璃棒揽拌均匀后，在室溫下浸泡10 ~20h，待其充分溶胀，除去悬浮在液面上的微粒，沸水煮2~化排空，此法不仅能加快溶胀 速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，最后再用去离子水浸泡，静置过夜，为后续实验准备。 不同葡聚糖凝胶(Sephadex)具有不同的孔径而截留不同分子量范围的蛋白质，本实验将选 择S邱hadex G-75和S邱hadex G-100来截留在50kD~90kD之间的目的蛋白。分别装柱后（规 格:200X20mm)，其填料高度为15~25cm。上样上述洗脱液(50~lOOmL)，去离子水洗脱(速 率ImL · min-i)，每5~lOmL收集一次，W280nm的吸收度值作出洗脱条件下的曲线。
[OOU] 第屯步，没食子酸脱簇酶(gad)的MALDI-T0F/T0F质谱鉴定：应用MALDI-T0F-T0F-MS对GAD蛋白条带beltl进行肤段测序，发现该蛋白条带共100~200条肤段，对其中离子强 度较大的肤段采用MS/MS进一步的分析，对比BLAST,将运些肤段序列在NCBI数据库中分析 同源性蛋白质，匹配到蛋白质。检测条件：检测器为4800P1US MALDI T0F/T0FTM Analyzer (ABI)，其MS/MS、MS的检测限分别为0.5~1.0Da、50~2(K)ppm;W正离子、反射检测的方式进 行；样品祀为3840pti-T0Fα23mmX81mmssABI)，WCHCA为基质；同时使用分析软件为 4800ExploreTM。没食子酸脱簇酶(GAD)的MLDI-TOF/TOF质谱鉴定采用的实验步骤
[0014] 第八步，没食子酸脱簇酶(GAD)的酶学性质的初步分析:酶活性的影响因素一般有 溫度、pH、酶浓度或者底物浓度、酶促进剂或者抑制剂。GAD是在降解单宁较酸的第二步起催 化作用的的酶，目标是将没食子酸降解成焦性没食子酸。本发明中也将对影响GAD的各种因 素进行研究，除了必要的溫度、pH、底物浓度、金属离子和添加剂外，由于接种量和发酵时间 也直接影响了菌种的数量，进而影响了酶的浓度，故也在实验中作为影响因素研究，另外， 憐酸盐缓冲溶液影响了金属离子的浓度，故也作为影响因素研究。酶活测定方法具体如下： 即将粗酶液加入到含有没食子酸的试管中