一种磁性海藻酸钠固化漆酶的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种磁性海藻酸钠固化漆酶的制备方法，属于固定化酶制备技术领域。
【背景技术】
[0002]漆酶是一种含铜多酚氧化酶，广泛存在于真菌、细菌和植物中。漆酶具有较广泛的底物专一性和较强的稳定性，能催化许多酚类和芳香胺类物质，如苯酚、对氯苯酚、苯胺以及多酚和多胺类物质，因而在生物传感器、生物燃料电池、生物转化及废水处理等领域具有广泛应用。但是由于漆酶易溶于水，在水中游离的漆酶不可回收也不能长期保存，且在高温或其他极端环境下漆酶的稳定性不易保持，因而限制了漆酶的实际应用。
[0003]游离的漆酶因在使用过程中易随环境的变化变性失活、易混入产品和不易循环利用等使其应用受到限制，对漆酶进行固定化是实现其重复利用、改善其稳定性的有效方法。固定化漆酶是指将水溶性漆酶以物理或化学的方法固定在有机或无机载体上，形成不溶于水的具有酶活性的衍生物，在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，容易与水溶性反应物分离，可反复使用。
[0004]固定化技术在保持游离漆酶的专一、高效的催化活性的同时，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，更是提高漆酶重复利用性、操控性和稳定性的有效手段，常用的固定化载体包括活性炭、壳聚糖、多孔硅胶以及微滤膜等多种材料，但现有的固定化材料存在固定化效率低、加工工艺复杂、分离困难以及操作性不高等缺陷。
【发明内容】
[0005]本发明主要解决的技术问题:针对目前传统漆酶易溶于水，在水中游离不可回收也不能长期保持，且在高温或其他极端环境下稳定性不易保持，容易变性失活，因此限制了应用，而常用的固定化技术虽可以保持游离漆酶的催化活性，提高利用率和稳定性，但使用的固定化材料存在固定化效率低、加工工艺复杂、分离困难以及操作性不高等现状，提供了一种利用产漆菌种发酵制得漆酶酶液，掺加磁性粒子，辅以海藻酸钠对其固定，振荡吸附后干燥，从而得到磁性海藻酸钠固定化漆酶。该方法工艺简单，成本低廉，制得的磁性海藻酸钠固定化漆酶不仅活力在250IU/mL以上，总产量也提高至85?90%，均达到了较高水平，而且纳米级磁性粒子的掺入使其更容易进行吸附，易于分离，使得固定化漆酶回收率提高，稳定性也得到显著增强，具有优异的性能。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(1)按接种量为培养基底物质量5?7%将白毒鹅膏菌接种到装有50?10mL基础液体培养基的300mL三角瓶中，放置在摇床上在25?30°C下以100?200rpm的速率恒温振荡培养3?5天，用无菌水淋洗菌丝表面并收集淋洗液，得到菌丝悬浮液，于4?6°C下保存；
(2)向80?10mL基础液体培养基中分别加入I?2%(w/v)茶叶、I?2%(w/v)豆柏和I?2%( w/v)蔗渣组成的混合物以及5?I OmL浓度为0.5mo I /L硫酸铜溶液，混合均匀后再加入20?25mL上述制备的菌丝悬浮液，放入恒温箱在25?35°C下发酵7?8天，再将发酵液移入卧式离心机，以7000?9000r/min转速离心分离，得上清液即为漆酶酶液，备用；
(3)按摩尔比为3: 2将浓度为0.3mol/L氯化铁和0.2mol/L氯化亚铁溶液混合均匀，取100?200mL混合液装入300mL三口烧瓶中，用质量浓度为17%氨水调节pH至9?10后，向烧瓶中以10mL/min速率持续通入氮气并移入水浴锅中，升温至75?85°C保温熟化30?40min，在磁场作用下吸附分离，得纳米级磁性粒子；
(4)取I?3g纳米级磁性粒子在超声作用下分散于40?50mL浓度为10%海藻酸钠溶液中，制得混合液，用注射器向制得的混合液中注入200?300mL蓖麻油并移入高剪切乳化机，以12000?13000r/min转速进行乳化，在乳化过程中再逐滴滴入5?1mL蔗糖脂肪酸酯，滴加完毕后继续乳化5?1min;
(5)乳化结束后将乳化液倒入400?500mL质量浓度为5%氯化钙溶液中，用搅拌棒搅拌均匀后静置沉淀过夜，再过滤分离得到沉淀物，将得到的沉淀物用含有5%脂肪酸甘油酯水溶液冲洗I?2h，放入烘箱在105?110°C下干燥至恒重；
(6)称取20?30g上述冲洗干燥后的烘干物放入装有300?500mL步骤(2)制备的漆酶酶液的漩涡振荡仪中，以30?50W功率在30?40°C下振荡吸附12?24h后滤出，真空干燥后即得一种磁性海藻酸钠固化漆酶。
[0007]所述的基础液体培养基是由I?1.2L马铃薯浸出液、15?25g葡萄糖、2?3g蛋白胨、3?5g磷酸二氢钾和2?4g硫酸镁混合而成。
[0008]本发明的应用方法是:使用时，取本发明制得的磁性海藻酸钠固定化漆酶加入废水池中，其中加入量为每I?3L废水中加入5?1g固定化漆酶，加入完毕后对池底进行曝气，使固定化酶与废水充分混合均匀，处理3?5h后，检测废水，测得废水中的COD从原来的3000?5000mg/L降低到了300?500mg/L，去除率达到了90 %以上，处理结束后用磁性装置回收固定化酶即可。
[0009]本发明的有益效果是:
(1)本发明操作简便，大大降低了生产成本；
(2)本发明制得的磁性海藻酸钠固定化漆酶活力在250IU/mL以上，总产量提高至85%以上，均达到了较高水平，具有广泛的工业使用价值和显著的经济效益；
(3)本发明利用纳米级磁性粒子对固定化漆酶进行吸附，易于分离，使其活性回收率尚，提尚了漆酶的稳定性；
(4)本发明制得的磁性海藻酸钠固定化漆酶活性高，可以广泛应用于纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、食品、废水处理等方面。
【具体实施方式】
[0010]首先按接种量为培养基底物质量5?7%将白毒鹅膏菌接种到装有50?10mL基础液体培养基的300mL三角瓶中，放置在摇床上在25?30°C下以100?200rpm的速率恒温振荡培养3?5天，用无菌水淋洗菌丝表面并收集淋洗液，得到菌丝悬浮液，于4?6°C下保存;然后向80?10mL基础液体培养基中分别加入I?2%(w/v)茶叶、I?2%(w/v)豆柏和I?2%(w/V)鹿渣组成的混合物以及5?1mL浓度为0.5moI/L硫酸铜溶液，混合均勾后再加入20?25mL上述制备的菌丝悬浮液，放入恒温箱在25?35°C下发酵7?8天，再将发酵液移入卧式离心机，以7000?9000r/min转速离心分离，得上清液即为漆酶酶液，备用；随后按摩尔比为3:2将浓度为0.3mol/L氯化铁和0.2mol/L氯化亚铁溶液混合均匀，取100?200mL混合液装入300mL三口烧瓶中，用质量浓度为17%氨水调节pH至9?10后，向烧瓶中以1mL/min速率持续通入氮气并移入水浴锅中，升温至75?85°C保温熟化30?40min，在磁场作用下吸附分离，得纳米级磁性粒子;接下来取I?3g纳米级磁性粒子在超声作用下分散于40?50mL浓度为10%海藻酸钠溶液中，制得混合液，用注射器向制得的混合液中注入200?300mL蓖麻油并移入高剪切乳化机，以12000?13000r/min转速进行乳化，在乳化过程中再逐滴滴入5?1mL蔗糖脂肪酸酯，滴加完毕后继续乳化5?1min;乳化结束后将乳化液倒入400?500mL质量浓度为5%氯化钙溶液中，用搅拌棒搅拌均匀后静置沉淀过夜，再过滤分离得到沉淀物，将得到的沉淀物用含有5%脂肪酸甘油酯水溶液冲洗I?2h，放入烘箱在105?110°C下干燥至恒重；最后称取20?30g上述冲洗干燥后的烘干物放入装有300?500mL上述制备的漆酶酶液的漩涡振荡仪中，以30?50W功率在30?40°C下振荡吸附12?24h后滤出，真空干燥后即得一种磁性海藻酸钠固化漆酶。其中所述的基础液体培养基是由I?1.2L马铃薯浸出液、15?25g葡萄糖、2?3g蛋白胨、3?5g磷酸二氢钾和2?4g硫酸镁混合而成。
[0011]实例I
首先按接种量为培养基底物质量5%将白毒鹅膏菌接种到装有50mL基础液体培养基的300mL三角瓶中，放置在摇床上在25°C下以10rpm的速率恒温振荡培养3天，用无菌水淋洗菌丝表面并收集淋洗液，得到菌丝悬浮液，于4°C下保存;然后向80?10mL基础液体培养基中分别加入l%(w/v)茶叶、l%(w/v)豆柏和l%(w/v)鹿渣组成的混合物以及5mL浓度为
0.5mol/L硫酸铜溶液，混合均匀后再加入20mL上述制备的菌丝悬浮液，放入恒温箱在25°C下发酵7天，再将发酵液移入卧式离心机，以7000r/min转速离心分离，得上清液即为漆酶酶液，备用；随后按摩尔比为3:2将浓度为0.311101/1氯化铁和0.21]101/1氯化亚铁溶液混合均匀，取100mL混合液装入300mL三口烧瓶中，用质量浓度为17%氨水调节pH至9后，向烧瓶中以10mL/min速率持续通入氮气并移入水浴锅中，升温至75°C保温熟化30min，在磁场作用下吸附分离，得纳米级磁性粒子;接下来取Ig纳米级磁性粒子在超声作用下分散于40mL浓度为10%海藻酸钠溶液中，制得混合液，用注射器向制得的混合液中注入200mL蓖麻油并移入高剪切乳化机，