专利名称：靶向人egfr的基因工程化淋巴细胞及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及抗EGFR的嵌合抗原受体和能表达该抗原受体的淋巴细胞。
背景技术：
表皮生长因子受体(EGFR)是ー种具有酪氨酸激酶活性的膜表面受体，在细胞许多生理过程中发挥重要的调节作用[1，2]。EGFR在结构上由胞外区、跨膜区和胞内区3个部分组成，其中胞外区具有两个半胱氨酸丰富区，胞内区具有典型的ATP结合位点和酪氨酸激酶区。EGFR在许多恶性肿瘤细胞表面均高表达[3]，其中包括表皮鳞癌、乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、肾癌及头颈部恶性肿瘤等。通常情况下，EGFR酪氨酸激酶以单体形式存在，当特异性的配体和EGFR受体结合后，引起受体由失活的单体状态转变为激活的ニ聚化状态，进而激活胞内内在的酪氨酸激酶，其胞内段的酪氨酸残基被自磷酸化或交叉磷酸化，引起下游PI3K-AKT、MAPK-ERK等信号通路的激活，其介导的信号转导途径在肿瘤细胞的增殖、损伤修复、侵袭及新生血管形成等方面起重要作用，已有众多的研究结果证实EGFR是具有良好应用前景的恶性肿瘤治疗的靶点[4-6]。近年来，靶向EGFR家族的抗肿瘤药物研发已经成为ー个热点。目前对EGFR的抑制主要有两类药物:一类为小分子酪氨酸激酶抑制剂，以吉非替尼和厄洛替尼为代表，这些小分子药物在临床上取得了较好的效果。虽然这些小分子靶向抗肿瘤药物没有化疗药物的细胞毒作用，但是其也存在着突出的耐药问题和脱靶效应等不良反应，长期应用甚至可以对机体造成明显的影响。另ー类为单克隆抗体，针对EGFR的抗体类药物也有三种在中国上市:西妥昔单抗、帕尼单抗和尼妥珠单抗，这些药物已在结肠癌、鼻咽癌等实体瘤的治疗中取得了较好的疗效，但是由于单抗的分子量比较大，导致其对实体瘤的穿透性比较差，在血中容易被清除，导致其疗效受到一定限制；另外，单抗的价格对普通病人来说非常昂贵，进一歩限制了其在临床上大量、广泛的应用。如何能在保持药物特异靶向性的同时，有效地降低其毒副作用？研究者们对此进行了多方面的探索。过继免疫治疗是通过给荷瘤机体输注抗肿瘤免疫效应细胞，使受体获得或增强抗肿瘤应答反应来杀伤肿瘤的治疗方法。目前在临床上肿瘤过激免疫治疗主要采用两类淋巴细胞:ー类效应细胞为肿瘤抗原特异性T淋巴细胞，包括肿瘤浸润性淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞，选取这两种T淋巴细胞的优点在于，它们均已被肿瘤抗原激活，可以识别自身MHC (主要组织相容性复合物)类分子抗原复合物，具有高度特异性的杀伤性能，在临床上显示出了明显的疗效；另外培养获得的细胞未经任何转基因修饰，安全性也比较高。其缺点在于体外培养技术体系较为复杂，细胞培养扩增速度较慢，细胞诱导培养周期较长，培养成功率比较低[7，8]。另外ー类包括淋巴细胞因子激活的杀伤细胞LAK和细胞因子刺激的杀伤细胞CIK，这类细胞是从外周血中分 后经过淋巴因子或细胞因子诱导刺激获得的，其杀伤机理是通过非MHC依赖的方式发挥抗肿瘤作用。LAK对靶细胞的杀伤没有MHC的限制，但其在体外扩增的能力较低而且体内杀瘤活性也不高，另外该疗法在临床应用上要使用大剂量IL-2，常常导致出现比较大副作用[9，10]。目前的CIK细胞治疗技术条件已比较成熟，国内有多家医院以开展了 CIK的临床治疗，并取得了不错的疗效[11，12]。但是CIK细胞中含有的一些具有肿瘤特异性的淋巴细胞并不能被特异的大量扩增，所以CIK所面临的突出问题就是其没有肿瘤特异杀伤作用。伴随着近代生物技术的迅猛发展尤其是基因工程技术的成熟，细胞过继免疫治疗迎来了新的发展契机。EshharZ.研究小组利用基因工程技术于上世纪八十年代末首先提出了克服上述缺陷的方法:嵌合性T淋巴细胞受体(CAR)技术，这将单抗的特异性与细胞毒T淋巴细胞的高效性有机地融为了一体；与天然的TCR (T细胞受体)相比，CAR的最大优点是与抗原结合时可以不受MHC的限制。将CAR基因转染入T淋巴细胞中，可以赋予非特异性的淋巴细胞特异识别肿瘤抗原并祀向杀伤肿瘤细胞的能力，并可让该细胞在受到相应抗原刺激时释放细胞因子、表现出细胞杀伤活性[13，14]。CAR—般由胞外结合区(来源于单克隆抗体的scFv)、免疫球蛋白恒定区(IgGFe)、跨膜区域(TM)和细胞 内信号域(SD)等部分组成。scFv负责肿瘤特异抗原的特异识别；IgG Fe使得ScFv保持一个天然的空间构象，更有效的识别抗原，并介导CAR的二聚化作用；TM的作用是将CAR锚定在细胞膜上；胞内信号域的功能是在CAR结合肿瘤抗原后，激活胞内信号通路，活化淋巴细胞，从而产生针对CAR所识别的肿瘤细胞的细胞毒性。近来，经过CAR基因修饰的淋巴细胞在淋巴瘤[15，16]、神经母细胞瘤[17]和转移性肾癌[18]等多种肿瘤的临床治疗上取得较好的疗效。目前还没有使用EGFR靶向嵌合抗原受体技术改造的淋巴细胞治疗肿瘤技术方案的报道。
发明内容
本发明的目的是为抗肿瘤技术领域提供一种新的有效选择。本发明首先提供了靶向EGFR单链抗体，该单链抗体是通过串联靶向EGFR的抗体轻链和重链可变区获得。进一步的，所述的单链抗体，的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。本发明还提供了编码所述的嵌合抗原受体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。本发明还提供了一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体是通过氮端到碳端顺次拼接hIL-2信号肽、所述的靶向EGFR的单链抗体、IgG2-Fc、⑶28跨膜区和⑶3 ζ链，所得到的嵌合抗原受体的结构为 ant1-EGFR(scFv)-1gG2(Fc)-CD28-CD3 ζ。进一步的，所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。本发明还提供了编码所述的嵌合抗原受体的基因，其核苷酸序列SEQ ID N0.3所
/Jn ο本发明还提供了表达载体，含有并能表达氨基酸序列为SEQ ID N0.3所示的嵌合抗原受体的编码基因。进一步的，所述的表达载体为pmaxCloning质粒载体。本发明还提供了含所述的表达载体的宿主细胞。进一步的，所述宿主细胞为淋巴细胞。
本发明还提供了所述的宿主细胞在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明还提供了制备所述的宿主细胞的方法:将所述的表达载体转染进淋巴细胞，从而获得能表达嵌合抗原受体的基因工程化的淋巴细胞。本发明还提供了抗肿瘤药物，是由的宿主细胞作为主要活性成分制备而成的。本发明的有益成果:本发明创造性地利用通过核糖体展示技术得到的具有高亲和力与特异性的抗EGFR的scFv片段新设计得到了ー种嵌合性抗原受体。将该嵌合抗原受体转入非病毒载体，通过核转染技术实现了 CAR在人淋巴细胞表面的高效表达，将非特异性的淋巴细胞定向改造为能够识别人EGFR从而介导对过表达EGFR的肿瘤细胞进行靶向杀伤的特异性淋巴细胞。其中特别优选的抗EGFR的单链抗体可以使得嵌合性抗原受体更好地发挥作用。EGFR靶向嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞在特异识别过表达EGFR的肿瘤细胞后，可以通过细胞因子的释放及CTL效应发挥抗肿瘤作用；其在体内可以显著抑制肿瘤的肿瘤形成、肿瘤生长及肺部转移，且没有明显的毒副作用。本发明设计了ー种新的基因工程化的淋巴细胞，提供了一种新的安全、有效的肿瘤治疗治疗方案。
图1为嵌合抗原受体基因表达检测。ー抗为ant1-EGFR scFv的兔抗血清。ニ抗为FITC标记的羊抗兔IgG。Mock:未加质粒，但核转染的淋巴细胞；Vehicle:核转染空载质粒的淋巴细胞；C，CAR:核转染嵌合抗原受体基因质粒的淋巴细胞。图2为嵌合抗原受体基因转染后淋巴细胞肿瘤杀伤活性检测。A431细胞为EGFR过表达细胞，A2780细胞为EGFR阴性细胞。图3为 CAR基因修饰淋巴细胞对A549皮下成瘤性的影响。NS:未加淋巴细胞，只接种肿瘤；Mock:未加质粒,但核转染的淋巴细胞；Vehicle:核转染空载质粒的淋巴细胞；C，CAR:核转染嵌合抗原受体基因质粒的淋巴细胞。图中所述的各类淋巴细胞与A549细胞共同接种N0D/SCID小鼠。纵坐标为未成瘤小鼠所占百分比，横坐标为接种后的时间(天)。图4为CAR基因修饰淋巴细胞对A431和A2780皮下瘤生长的影响。NS:生理盐水处理组；Mock:未加质粒、但核转染的淋巴细胞处理组；Vehicle:核转染空载质粒的淋巴细胞处理组；C，CAR:核转染嵌合抗原受体基因质粒的淋巴细胞处理组。纵坐标为成瘤小鼠肿瘤体积，横坐标为接种后的时间(天)。图5为CAR基因修饰淋巴细胞对A549肿瘤肺转移的影响。NS:生理盐水处理组；Mock:未加质粒、但核转染的淋巴细胞处理组；Vehicle:核转染空载质粒的淋巴细胞处理组；C，CAR:核转染嵌合抗原受体基因质粒的淋巴细胞处理组。纵坐标为成瘤小鼠生存率，横坐标为接种后的时间(天)。图6为A549肿瘤肺转移小鼠治疗后谷丙转氨酶(Alanine Transaminase, ALT)和谷草转氨酶(Aspartate Transaminase, AST)表达水平检测。小鼠分组与图5相同。
具体实施例方式本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)重组基因及其设计方式，该嵌合抗原受体可以靶向EGFR。其具体设计方式为通过氮端到碳端顺次拼接hIL-2信号肽、本发明所提供抗EGFR的单链抗体(scFv)、IgG2-Fc、⑶28TM-⑶3 ^，所得到的嵌合抗原受体的结构为ant1-EGFR(scFv)-1gG2(Fc)-CD28TM-CD3 し氨基酸序列见 SEQ ID N0.4。本发明所提供的CAR的设计方式是经过多次摸索后优化所得，组成嵌合抗原受体的每个片段均发挥着不同的功能:hIL-2信号肽可以在CAR其他组件表达后将其分泌到胞外；scFv具有特异靶向结合EGFR的作用；IgG2-Fc为scFv正确构象的伸展提供合适的空间；CD28跨膜区将CAR锚定在细胞膜上；CD3(链可以在scFv结合抗原后激活胞内信号，活化淋巴细胞。本发明中CAR核转染淋巴细胞的条件也是经过多次摸索后得到的，从而高效的将抗EGFR嵌合抗原受体基因转染入淋巴细胞，并使其在淋巴细胞的细胞膜上正确表达，成功的将非特异性的淋巴细胞定向改造成为能够识别人EGFR从而介导对高表达EGFR的细胞进行靶向杀伤的特异性的淋巴细胞。本发明的基因工程花淋巴细胞在体外和体内实验中均显示出显著的抗肿瘤作用，其可以作为抗肿瘤药物使用，具有很好的应用前景。实施例一 EGFR靶向CAR全长基因的获得及表达质粒载体的构建I实验路线CAR 基因由 SP hIL-2、识另Ij EGFR 的 scFv、IgG2_Fc、CD28TM-CD3 ^ 构成。其中 SPhIL-2序列通过引物合成的方式包含在上游扩增引物中；EGFR靶向scFv序列为从抗EGFR杂交瘤细胞扩增即核糖体展示技术优化后所得，具体步骤如下:制备抗EGFR杂交瘤细胞，提取总RNA，然后用RT-PCR的方式分别扩增出抗EGFR的重、轻链基因，送至Invitrogen公司进行测序。测序结果利用Jellyfish软件分析，对可以正确翻译的序列再通过VBASE2和GeneBank进行序列对比，并由核糖体展示技术对其特异性和亲和カ进行进化，所得到的具有高亲和カ的抗EGFR单链抗体的编码基因(氨基酸序列见SEQ ID N0.2)。通过设计并合成引物，分别扩增得到scFv的基因序列、IgG2Fc段(氨基酸序列见SEQ IDN0.6)和⑶28TM-⑶3(基因序列(通过RT-PCR从人外周血单核细胞中获得，氨基酸序列见SEQ ID N0.8)。三个片段经过PCR反应之后，再利用重叠PCR程序将三个片段连接。实验具体方案如下:I)引物设计(I)扩增scFv的引物:上游引物(Fl):SEQ ID N0.95 -GTGCTAGCTAGCATGTACAGGATGCA ACTCCTGTCTTGCATTGCACTA AGTCTTGCACT。此为扩增hIL-2信号肽的上游引物，下划线部分设计与hIL-2信号肽部分片段互补。该引物也引入酶切位点NheI。扩增Ant1-EGFR scFv 的上游引物(F2):SEQ ID N0.10 5，-GCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAACTCGGCCCGAGGTTCAGCTTCAGCAGTCTG-3，其中，下划线部分设计与Ant1-EGFR scFv基因片段互补。扩增Ant1-EGFR scFv 的下游引物(Rl):SEQ ID N0.115’ -ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAAcTCGGCCCAGATCCAGTTGCTGCAGTCT-3’。其中，下划线部分设计为与IgG2Fc某闵片段互补，以讲行重叠PCR。
(2)扩增 IgG2Fc 的引物:上游引物(F3):SEQ ID N0.125’ -GGGGACCAAGCTGGAAATAAAACCACCTTGCCCAGCAC-3’。其中，下划线部分设计为与scFv序列互补，以进行重叠PCR。下游引物(R2):SEQ ID N0.135’ -ACCACCAGCACCCAAAAGGGAATGGCCCTGATTGTGCTGGGGGG-3’。其中，下划线部分设计与⑶28TM-⑶3ζ序列互补。(3)扩增CD28TM-CD3 ζ序列的引物:上游引物(F4):SEQ ID N0.145 -AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAACCCTTTTGGGTGCTGGTGGTG-3>。下划线部分与IgG2Fc片段互补。下游引物(R3):SEQ ID N0.155’-CTAGCTAGCTAGGAAGATCTTCTTAGCGAGGGGGC-3’。引入酶切位点 Bgl II。2) PCR 反应PCR按照TaKaRa公司操作说明进行，反应体系如下:
I Ox Pyrobest Buffer5 LiL
2.5mM dNTP4 μ
ΙΟμιη Primer (丨..游)I ‘uL
IOum Primer (卜游)I pL
权利要求
1.靶向EGFR单链抗体，其特征在于该单链抗体是通过串联靶向EGFR的抗体轻链和重链可变区获得。
2.根据权利要求1所述的单链抗体，其特征在于:其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.编码权利要求2所述的嵌合抗原受体的基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。
4.一种嵌合抗原受体，其特征在于:该嵌合抗原受体是通过氮端到碳端顺次拼接hIL-2信号肽、权利要求1或2所述的靶向EGFR的单链抗体、IgG2_Fc、⑶28跨膜区和⑶3 ζ链，所得到的嵌合抗原受体的结构为ant1-EGFR(scFv)-1gG2(Fc)-CD28-CD3 ζ。
5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于:其氨基酸序列如SEQID N0.4所/Jn ο
6.编码权利要求5所述的嵌合抗原受体的基因，其特征在于:其核苷酸序列SEQIDN0.3所示。
7.表达载体，含有并能表达氨基酸序列为SEQID N0.3所示的嵌合抗原受体的编码基因。
8.根据权利要求7所述的表达载体,其特征在于所述的表达载体为pmaxCloning质粒载体。
9.含有权利要求7或8任一项所述的表达载体的宿主细胞。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于:所述宿主细胞为淋巴细胞。
11.权利要求9或10所述的宿主细胞在制备抗肿瘤药物中的用途。
12.制备权利要求9或10所述的宿主细胞的方法，其特征在于:将权利要求5 8任一项所述的表达载体转染进淋巴细胞，从而获得能表达嵌合抗原受体的基因工程化的淋巴细胞。
13.抗肿瘤药物，是由权利要求9或10所述的宿主细胞作为主要活性成分制备而成的。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体涉及抗EGFR的嵌合抗原受体和表达该抗原受体的淋巴细胞。本发明要解决的技术方案为抗肿瘤技术领域提供了新的有效选择。本发明的技术方案是提供一种靶向EGFR的单链抗体。通过基因工程技术手段将该单链抗体进一步设计构建成一种嵌合抗原受体，所得到的嵌合抗原受体的结构为anti-EGFR(scFv)-IgG2(Fc)-CD28-CD3ζ。通过核转染技术将嵌合抗原受体转染入淋巴细胞，可以赋予非特异性的淋巴细胞特异识别EGFR肿瘤抗原并靶向杀伤EGFR过表达肿瘤细胞的能力。该技术方案将过继细胞治疗和基因治疗有机结合，杀伤肿瘤效果明显，为本领域提供了一种新的有效选择。
文档编号C12N15/11GK103113470SQ20131006176
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月27日 优先权日2013年2月27日
发明者魏于全, 李炯, 周西坤 申请人:四川大学