专利名称：电转染的方法及设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及转基因的方法和设备，特别适合但不仅限于对原代淋巴细胞转基因中的电转染的方法及设备。
背景技术：
肿瘤免疫治疗领域中，采用转基因技术设计靶向肿瘤细胞的效应T淋巴细胞是很有前景的免疫治疗新方法。同种异体骨髓的干细胞移植成功和向高度恶性血液癌症患者输注淋巴细胞的临床案例表明，人体免疫系统可以控制甚至消灭残余病灶。输入外源淋巴细胞的主要并发症是移植物抗宿主反应，除了攻击肿瘤细胞也要攻击正常细胞。由于自体免疫系统的耐受机制，自体淋巴细胞不包含高亲和力效应细胞，通过转基因技术使自体淋巴细胞具有靶向肿瘤抗原并杀伤肿瘤细胞成为肿瘤免疫治疗的新方向。
筛选和克隆出针对肿瘤抗原的特异性T细胞受体，通过转基因技术把该T细胞受体转入患者外周血T淋巴细胞，然后扩增和激活，回输患者体内，具有靶向性的T淋巴细胞就能杀伤肿瘤细胞，同时又不会杀伤正常组织细胞。尤其对发生转移和产生化疗药物抵制的肿瘤干细胞采用过继性T淋巴细胞治疗能取得好的效果，这弥补了手术和化疗手段治疗肿瘤干细胞的不足。
到目前为止，肿瘤免疫治疗中使用过继性转基因T细胞，都采用逆转录病毒载体才能产生有效的稳定的治疗效果，这也导致一些安全隐患。第一:由于转录病毒载体存在随机插入整合的问题，会对患者自体细胞造成不可逆的遗传操作，有产生癌变的潜在风险；第二:目前嵌合抗原受体T细胞一般是用反转录或者慢病毒转染的外周血T淋巴细胞，在体外筛选并扩增出稳定表达细胞，当治疗完成或者出现副作用时如何清除掉这些转基因T细胞成为一个后患问题；第三:病毒载体转基因技术在操作上繁琐，会导致产生质量管理与控制的不利因素问题。安全问题成为病毒载体转基因的固有缺陷。
非病毒载体转基因方法中最引人关注的是电转染技术，根据clinicaltrials.gov统计显示，到目前为止共有35个电转染的临床试验。电转染DNA疫苗，皮下肌肉注射疫苗并辅以电转染的临床试验有19例，其中结肠癌疫苗I例，前列腺癌疫苗I例，H5N1禽流感病毒DNA疫苗2例，黑色素瘤DNA疫苗2例，HIV疫苗5例，乳头瘤病毒DNA疫苗2例，宫颈上皮内瘤DNA疫苗I例，慢性丙型肝炎疫苗2例，血液恶性肿瘤疫苗I例,抗恶性疟原虫DNA疫苗I例，晚期癌症肿瘤疫苗I 例。
电转染细胞因子质粒，在瘤内注射细胞因子质粒并辅以电转染的临床试验有3例，转移性黑色素瘤内注射并电转IL2质粒2例，恶性黑色素瘤内注射并电转IL12质粒I例。
电转染化疗药物，对顽固性、皮肤鳞状、胶质状肿瘤注射博莱霉素并辅以电转染的临床试验有9例，其中头颈癌注射电转博莱霉素2例，皮肤及皮下肿瘤注射电转博莱霉素I例，胰腺癌电转博莱霉素I例，黑色素瘤电转博莱霉素I例，直肠癌电转博莱霉素I例，脑转移肿瘤电转博莱霉素I例，电转博莱霉素治疗肿瘤皮肤溃疡转移I例，电转博莱霉素治疗复发乳腺癌I例。电转染的其它临床试验包括电转染安全与耐受性测试2例，不可逆电穿孔治疗早期原发性肝癌I例。以上统计数据显示电转染技术还没有用于原代淋巴细胞的转基因治疗，原因是以下四点:首先，现有的电转染技术采用电容单次放电形成高压电场。如图1所示现有电转染仪的电路原理示意图，电路包含一个充电回路和一个放电回路。当开关Ki导通时，控制电路向电容C充电，待电容充电完成后，断开开关K1。放电时，使K2导通时，电容C向负载放电。整个电路的放电时间是由放电时间RC的值决定，R是放电回路的等效电阻，包括负载电路的电阻，C是电容的容量值，该电路只能产生单次、正向的高压放电脉冲，不能产生低压的放电脉冲。在电容放电中，如果电压低了，不能在细胞膜上有效的形成小孔，如果电压高了，能量过于集中，会在细胞膜上形成永久性穿孔，导致靶细胞死亡。由此表明了电容单次放电容易导致原代淋巴细胞凋亡率升高，进而成功转基因的原代淋巴细胞可得率降低。其次，现有的电转染技术采用正向脉冲放电，由于细胞内是负电荷，因此正电极附近的细胞转染效率比负电极附近 的细胞转染效率高，而且细胞膜穿孔都是面向正电极方向，电转染细胞总数降低和膜穿孔偏少导致转基因原代淋巴细胞可得率降低。再次，紧接着高压脉冲放电之后，长时间的低电压电泳对提高原代淋巴细胞的电转染效率是必要的，但目前没有这项措施。因为在短暂的高压电场中，细胞膜会形成暂时性小孔，这时施加低电压电流，外源分子被电泳进入细胞质中。最后，现有的电转染技术用于植物细胞，微生物和培养细胞系的转基因，具有一定的转染效率，但对原代淋巴细胞的转染效率极低，原因在于现有的基因电转染技术都是依赖于细胞核的有丝分裂，此时细胞核膜会暂时解聚，外源DNA依靠被动扩散运动进入细胞核中，只有极少数的治疗基因能够通过核膜孔自由的扩散到细胞核内。因此，对于处于静息期或者极少分裂的细胞，现有的基因电转染技术的转染效率极低。因此，安全且高效的转基因技术已成为细胞免疫治疗需要突破的关键技术瓶颈。
发明内容
针对传统电转仪对原代淋巴细胞转基因效率极低的技术问题，本发明提供了一种电转染的方法及设备，可以提高转基因中的转染率，提高病毒载体转基因的安全性。本发明电转染的方法，包括:对细胞进行四次放电，放电之间进行两次暂停:第一次放电:电压为500 1500V的正向脉冲，持续时间20 60 μ s (微秒)；第一次暂停:暂停持续时间600 1200 μ s ；第二次放电:电压为500 1500V的负向脉冲，持续时间20 60 μ s ;第二次暂停:暂停持续时间600 1200 μ s ；第三次放电:电压为500 1500V的正向脉冲，持续时间10 50 μ s ;第四次放电:电压为100 300V的正向电泳电场，持续时间20 IOOms (毫秒)。通过正负方向高压脉冲电场和低压脉冲电场组合的方法，能够对细胞膜进行两个方向的穿孔，长时间的低压脉冲能够使外源分子被电泳进入细胞质中，从而提高电转染细胞的总数和膜穿孔的数量，由此提高了电转染率。经过测试，外周血单核细胞转染pmaxGFP(绿色荧光蛋白)细胞学实验结果转染效率达到了 50%左右，为开发肿瘤的生物治疗药物提供了关键技术支持。优选的，第一次放电的电压为800 1100V的正向脉冲，持续时间35 45μ S。优选的，第一次暂停的暂停持续时间800 1000 μ S。优选的，第二次放电的电压为800 1100V的负向脉冲，持续时间35 45 μ S。优选的，第二次暂停的暂停持续时间800 1000 μ S。优选的，第三次放电的电压为800 1100V的正向脉冲，持续时间15 25μ S。优选的，第四次放电的电压为150 200V的正向电泳电场，持续时间40 60ms。进一步的，与上述方法配合使用的电转染缓冲液的组分可以为:PBS (磷酸缓冲液)缓冲液，浓度 30 200mM ；Tris — HCl，浓度 30 150mM ；Ca (NO3) 2，浓度 0.2 ImM ；KC1，浓度2 8mM ；MgCl2,浓度10 20mM ；NaCl,浓度50 150mM ;葡萄糖，浓度5 30mM ；pH为6.5 ρΗ7.2。所述电转染缓冲液的另一种组分为:PBS缓冲液，浓度30 200mM ;Tris —HC1，浓度 30 150mM ;Ca (NO3) 2，浓度 0.2 ImM ;KC1，浓度 2 8mM ;MgCl2，浓度 10 20mM ;NaCl，浓度 50 150mM ；pH 为 6.5 ρΗ7.2。本发明还提供了一种用于所述方法的电转染的设备，包括顺序连接的显示电路、控制电路、逻辑电路和驱动电路，驱动电路的输出端通过导通元件与低压直流电源连接，驱动电路的输出端还通过全桥电路与高压直流电源连接，全桥电路的输出端连接负载，并通过电流检测电路连接所述 的控制电路。所述的导通元件可以为三极管或MOS管。其中:控制电路:用于精确控制时间的MCU控制电路，主要完成波形的发生。可以通过常见的单片机或现有芯片、模块和常规外围电路构成。控制电路的主要作用是控制、监督、协调整个设备的正常运行，其主要功能是完成放电波形的产生，精确控制放电时间，与操作显示面板进行通讯，发送显示信息并记录按键操作等。其核心是一个单片机，例如可以是PIC16F1937型单片机，也可以是其它具有类似功能的单片机。逻辑电路:用于保证全桥电路正常工作，防止同臂上下桥同时导通，以及快速产生各种波形和快速保护。逻辑电路使用可编程器件PLD (Programmable Logic Device可编程逻辑器)作为电路的核心，编写相应的嵌入式控制程序，确保下游的桥式电路按照规定的逻辑顺导通。PLD与外围电路的连接根据具体的PLD型号进行对应连接即可。驱动电路:总计六个驱动导通模块，此电路包括驱动模块电源。驱动模块有过流保护功能。在驱动导通模块中核心的导通元件为IGBT (Insulated Gate BipolarTransistor，绝缘栅双极型晶体管)器件，IGBT是由BJT (双极型三极管)和MOS (绝缘栅型场效应管)管组成的复合全控型电压驱动式功率半导体器件，兼有MOSFET (金属-氧化层-半导体-场效晶体管)的高输入阻抗和GTR (电力晶体管)的低导通压降两方面的优点。GTR饱和压降低，载流密度大，但驱动电流较大；M0SFET驱动功率很小，开关速度快，但导通压降大，载流密度小。IGBT综合了以上两种器件的优点，驱动功率小而饱和压降低。IGBT采用相对应的驱动电路的进行驱动。每个驱动导通模块各有一个输出端，将各模块的输出端连接后输出到全桥电路中。全桥电路:由一个单独的导通元件和四个相同结构的导通元件组成一个全桥电路，假设左正右负(即图3中全桥电路部分的左边一个三极管导通，右边一个三极管导通，其它三极管截止)，则高压输入或低压输入直流电源可输出正负波。全桥电路是四个三极管或MOS管组成的振荡。全桥电路的优点是不容易产生泻流。低压直流电源:当用于过压保护时，在电压超过低压直流阈值时强制关闭此电路的输入，并报警，正常情况下不会超过低压直流阈值；用于自放电保护时，在任何情况下，只要电源插头没电，自放电路会在几分钟内自动放完电容上的电；用于充电电路时，给电容充电；用于电源检测电路时，检测此电源上的电压是否符合要求，不符合要求，充电电路继续完成充电。高压直流电源:当用于过压保护时，在电压超过高压直流时强制关闭此电路的输入，并报警，正常情况下是不会超过高压直流；用于自放电保护时，在任何情况下，只要电源插头没电，自放电路会在几分钟内自动放完电容上的电；用于充电电路时，给电容充电；用于电源检测电路时，检测此电源上的电压是否符合要求，不符合要求，充电电路继续完成充电。电流检测电路:主要作用是对放电回路的保护和检测充电电压是否符合要求，使设备的整个电路得到保护。当设备电路中没有负载时，即没有接入细胞电击杯时(细胞电击杯是一个方形杯状的金属小盒，在电击杯中加注细胞及细胞转染液)，为了避免产生高压电击危害，设备的整个放电电路是断路的，不会放电，并由信号灯提示；当设备电路接入细胞电击杯时，电流检测电路检测高压直流电源和低压直流电源的电压是否符合要求，如果不符合要求，启动充电电路继续完成充电，当电压符合要求后，信号灯提示。本发明的电转染的方法及设备，能够大幅度提高电转染的成功率，在外周血单核细胞转染pmaxGFP (绿色荧光蛋白)细胞学实验结果中转染效率达到了 50%左右，为开发肿瘤的生物治疗药物提供了关键技术支持。以下结合实施例的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。
图1为传统电转染仪的电路框图。图2为本发明电转染的方法的放电脉冲示意图。图3为本发明电转染的设备的电路示意图。图4为图3中驱动电路模块的电路示意图。图5为在本发明方法经缓冲液ML16的电转染的白光视场和突光视场下的显微镜对比图。图6为在本发明方法经缓冲液GD20的电转染的白光视场和荧光视场下的显微镜对比图。图7为经传统方法和本发明的方法后对外周血单核细胞的流式检测转染率的对比图示。图8为经传统方法和本发明的方法后对外周血淋巴细胞的凋亡率和可得率的对比图示。
具体实施例方式使用本发明的设备进行细胞电转染。试验方法:如图2所示本发明电转染的方法，本实施例的实验是用人外周血单核细胞通过本发明方法转染AMAXA公司的，货号为VPA1001的pmaxGFP (绿色荧光蛋白)质粒，细胞流式分析转染效率。方法中包括了对细胞进行I次正向高压脉冲，暂停一段时间，接着I个负向高压脉冲，再暂停一段时间，再接着I个正向高压脉冲，随后I个长时间的低压电泳电场。试验设备:电转染的设备电路如图3所示，包括顺序连接的显示电路、控制电路、逻辑电路和驱动电路，驱动电路的输出端通过三极管结构的导通元件与低压直流电源连接，驱动电路的输出端还通过全桥电路与高压直流电源连接，全桥电路的输出端连接负载，并通过电流检测电路连接所述的控制电路。其中:控制电路:用于精确控制时间的MCU控制电路，主要完成波形的发生。逻辑电路:用于保证全桥电路正常工作，防止同臂上下桥同时导通。驱动电路:总计六个如图4所示的驱动三极管的模块，驱动模块有过流保护功能。每个驱动导通模块各有一个输出端0UTPUT1，将各模块的输出端0UTPUT1连接后输出到全桥电路中。图4中的E201是集成的IGBT (Insulated Gate Bipolar Transistor,绝缘栅双极型晶体管)驱动模块，型号是VLA517-01R，电路中的端口 OutA由PLD(可编程逻辑器件)控制，是E201模块的控制输入端，E201模块再控制三极管M201的基极G，电流由集电极C流向发射机E，最后由输出端OUTPUT I。
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全桥电路:由一个单独的导通元件和四个相同结构的导通元件组成一个全桥电路，假设左正右负，则高压输入直流可输出正负波，低压输入直流只能输出正波。全桥电路是四个三极管或MOS管组成的振荡。全桥电路的优点是不容易产生泻流。低压直流电源:用于过压保护时，当电压超过低压直流阈值时强制关闭此电路的输入，并报警，正常情况下不会超过低压直流阈值；用于自放电保护时，在任何情况下，只要电源插头没电，自放电路会在几分钟内自动放完电容上的电；用于充电电路时，给电容充电；用于电源检测电路时，检测此电源上的电压是否符合要求，不符合要求，充电电路继续完成充电。高压直流电源:用于过压保护时，当电压超过高压直流时强制关闭此电路的输入，并报警，正常情况下是不会超过高压直流；用于自放电保护时，在任何情况下，只要电源插头没电，自放电路会在几分钟内自动放完电容上的电；用于充电电路时，给电容充电；用于电源检测电路时，检测此电源上的电压是否符合要求，不符合要求，充电电路继续完成充电。本实施例中通过传统的3次正向高压脉冲和I次正向低压脉冲放电，与本发明的正负方向高压脉冲电场和低压脉冲电场组合的放电方法进行对比试验。传统的方法为:3次正向高压均为800V，I次正向低压为200V，脉宽分别为50 μ s+T+50 us + Τ+50 μ s+20ms,暂停时间 T=IOOO μ S。本发明的方法为:正向高压为800V，负向高压为一 800V，低压为200V，脉宽分别为50 μ S+T+50 μ S + Τ+50 μ s+20ms,暂停时间 T=IOOO μ s,具体为:第一次放电:电压为800V的正向脉冲，持续时间50 μ s (微秒)；第一次暂停:暂停持续时间1000 μ s ；第二次放电:电压为一 800V的负向脉冲，持续时间50μ s ;第二次暂停:暂停持续时间1000 μ s ；第三次放电:电压为800V的正向脉冲，持续时间50 μ s ;第四次放电:电压为200V的正向电泳电场，持续时间20ms (毫秒)。本实施例中采用两种缓冲液进行配合试验:缓冲液ML16组成:PBS缓冲液(磷酸缓冲液)，浓度30 200mM ；Tris — HCl，浓度30 150mM ；Ca (NO3)2,浓度 0.2 ImM ;KC1，浓度 2 8mM ;MgCl2，浓度 10 20mM ；NaCl,50 150mM ;葡萄糖，浓度 5 30mM ；pH6.5 ρΗ7.2。缓冲液⑶20组成:PBS缓冲液，浓度30 200mM ；Tris — HCl，浓度30 150mM ；Ca(NO3)2,浓度 0.2 ImM ；KC1,浓度 2 8mM ；MgCl2,浓度 10 20mM ；NaCl,50 150mM ；ρΗ6.5 ρΗ7.2。试验数据及结果:如图5所示，其中图5Α是经缓冲液ML16的电转染在白光视场下的显微镜照片图，图5Β是经缓冲液ML16的电转染在荧光视场下的显微镜照片图。目测荧光和白光视场下的转染细胞比值在40%至50%。如图6所示，其中图6Α是经缓冲液⑶20的电转染在白光视场下的显微镜照片图，图6Β是经缓冲液GD20的电转染在荧光视场下的显微镜照片图。目测荧光和白光视场下的细胞比值在30%至40%。采用缓冲液ML16进行传统方法和本发明方法的转染率准确数据的对比试验。如图7所示，其中图7Α为传统方法的转染率试验结果，图7Β为本发明方法的转染率试验结果。由图7的对比图示可知，图7Α的传统方法转染率为39.6%，图7Β的本发明方法转染率为51.3%，本发明方法的转染率较传统方法提高了 11.7%。凋亡率和可得率如图8所示，其中图8Α为传统方法的试验结果，图8Β为本发明方法的试验结果。由图8的对比图示可知，图8Α的传统方法凋亡率为8.8%，可得率为91.2%,图8Β的本发明方法凋亡率为11%，可得率为89%，本发明方法的凋亡率仅比传统方法增加了
2.2% (即可得率减少了 2.2%)， 可得率的减少完全在可接受范围内。通过对比数据可知，通过本发明正负方向高压脉冲电场和低压脉冲电场组合的方法，在对细胞膜进行两个方向的穿孔和长时间的低压脉冲后，能够使外源分子被电泳进入细胞质中，从而提高电转染细胞的总数和膜穿孔的数量，大幅度提高了电转染率，使外周血单核细胞转染pmaxGFP (绿色荧光蛋白)细胞学实验结果转染效率达到了 50%左右，为开发肿瘤的生物治疗药物提供了关键技术支持。
权利要求
1.电转染的方法，其特征包括:对细胞进行四次放电，放电之间进行两次暂停: 第一次放电:电压为500 1500V的正向脉冲，持续时间20 60μ S ; 第一次暂停:暂停持续时间600 1200 μ s ； 第二次放电:电压为500 1500V的负向脉冲，持续时间20 60μ s ; 第二次暂停:暂停持续时间600 1200 μ s ； 第三次放电:电压为500 1500V的正向脉冲，持续时间10 50μ s ; 第四次放电:电压为100 300V的正向电泳电场，持续时间20 100ms。
2.如权利要求1所述的电转染的方法，其特征为:第一次放电的电压为800 1100V的正向脉冲，持续时间35 45 μ S。
3.如权利要求1所述的电转染的方法，其特征为:第一次暂停的暂停持续时间800 1000 μ S。
4.如权利要求1所述的电转染的方法，其特征为:第二次放电的电压为800 1100V的负向脉冲，持续时间35 45 μ S。
5.如权利要求1所述的电转染的方法，其特征为:第二次暂停的暂停持续时间800 1000 μ S。
6.如权利要求1所述的电转染的方法，其特征为:第三次放电的电压为800 1100V的正向脉冲，持续时间15 25 μ S。
7.如权利要求1所述的电转染的方法，其特征为:第四次放电的电压为150 200V的正向电泳电场，持续时间40 60ms。
8.如权利要求1至7之一所述的电转染的方法，其特征为:配合使用的电转染缓冲液组分为:PBS缓冲液，浓度30 200mM ；Tris — HCl，浓度30 150mM ;Ca (NO3)2，浓度0.2 ImM ;KC1，浓度2 8mM ;MgCl2，浓度10 20mM ;NaCl，浓度50 150mM ;葡萄糖，浓度5 30mM;pH 为 6.5 ρΗ7.2。
9.如权利要求1至7之一所述的电转染的方法，其特征为:配合使用的电转染缓冲液组分为:PBS缓冲液，浓度30 200mM ；Tris — HCl，浓度30 150mM ;Ca (NO3)2，浓度0.2 ImM ；KC1，浓度 2 8 mM ；MgCl2,浓度 10 20mM ；NaCl，浓度 50 150mM ；pH 为 6.5 ρΗ7.2。
10.用于权利要求1所述方法的电转染的设备，其特征为:包括顺序连接的显示电路、控制电路、逻辑电路和驱动电路，在驱动电路中通过导通元件将驱动电路与低压直流电源连接，驱动电路的输出端还通过全桥电路与高压直流电源连接，全桥电路的输出端连接负载，并通过电流检测电路连接所述的控制电路。
全文摘要
本发明涉及电转染的方法及设备。方法中包括了对细胞进行1次500～1500V，20～60μs的正向高压脉冲放电，暂停600～1200μs，接着1个500～1500V，20～60μs的负向高压脉冲放电，再暂停600～1200μs，再接着1个500～1500V，10～50μs的正向高压脉冲放电，随后1个100～300V，20～100ms的低压电泳电场放电。本发明的电转染的方法及设备，能够大幅度提高电转染的成功率，在外周血单核细胞转染绿色荧光蛋白细胞学实验结果中转染效率达到了50％左右，为开发肿瘤的生物治疗药物提供了关键技术支持。
文档编号C12M1/42GK103146750SQ20131008662
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者莫邦辉, 马雨, 王永生, 魏于全 申请人:四川大学