专利名称：黑眶蟾蜍胱抑素及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明提供一种黑眶蟾蜍胱抑素基因及其应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
黑眶蟾蜍，无尾目，蟾蜍科，蟾蜍属,是传统中药材“干蟾”的主要来源之一,一般于夏、秋二季捕捉；味辛、凉，有毒，归肝、脾、肺经，具有消肿解毒、止痛、利尿的功效，常用于慢性气管炎、痈疖疔疮、咽喉肿痛、水肿和小便不利等症治疗；民间也有用于癌症(尤其是乳腺癌)等的验方，但目前关于其功效的分子机制研究较少。在肿瘤发生发展的过程中，组织蛋白酶B起着重要的作用，组织蛋白酶B能够直接降解或激活纤溶酶原激活剂及基质金属蛋白酶等而间接降解许多细胞外基质成分，从而参与肿瘤的侵袭转移过程。此外它还可以促进肿瘤血管的增生，增强肿瘤细胞的运动能力，而且组织蛋白酶B转录、表达水平的高低与肿瘤的预后呈正相关。目前认为对组织蛋白酶B等半胱氨酸蛋白酶的抑制与抗肿瘤作用有关。将本发明的黑眶蟾蜍胱抑素氨基酸全序列及其编码基因分别对蛋白质数据库和基因数据库进行了比对搜索，均未发现有任何相同序列信息。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黑眶蟾蜍胱抑素，该黑眶蟾蜍胱抑素的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其是一种单链多肽，分子量10882.84道尔顿，等电点7.57。本发明另一目的是提供一种编码所述黑眶蟾蜍胱抑素的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示。
黑眶蟾蜍胱抑素基因的克隆方法如下:
黑眶蟾蜍皮肤总RNA提取、反转录及设计引物并利用PCR方法筛选黑眶蟾蜍胱抑素基因，其中正向扩增引物长度为23个核苷酸，其序列为5’ - ATGGATCAAAAAGGAAATGTTCC-3’，反向扩增引物序列为5’ -CTAAAAATAACAGATGGGGTCTTC-3’;所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定，基因测序结果表明编码黑眶蟾蜍胱抑素的基因由309个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为:
atggatcaaa aaggaaatgt tcctggcgga ctgggtgcag aaaagcctgc taccccagaa 60atacaggcgc tgtgtgacat ggtaaaatgc gcttttgagc aaaaatccgg gactaatgca 120gcagagttta aggccatctg ttacgcaagt caagttgttg ctggaacaat gtactatgtg 180aaggtggata ttggaggagg tcagtgctgt catctgaaaa tacttcaacc tctgcctact 240ggagggaaag tgagtctgag cgactaccag tgcgggaaga agaaggaaga ccccatctgt 300tatttttag309
编码黑眶蟾蜍成熟胱抑素为第1- 306位核苷酸，其氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示。
黑眶蟾蜍胱抑素的原核表达、纯化方法如下:构建原核表达载体，转化入BL21感受态细胞，培养于含氨苄青霉素的LB培养基中，经IPTG诱导表达后，离心收集菌体，超声破碎离心取上清，进行亲和层析获得融合黑眶蟾蜍胱抑素；经超滤后用肠激酶进行消化后，纯化即得重组黑眶蟾蜍胱抑素，该胱抑素具有强烈的抑制组织蛋白酶B活性。本发明另一目的是将黑眶蟾蜍胱抑素应用在制备组织蛋白酶B抑制剂中。本发明中所用黑眶蟾蜍来源于云南省西双版纳州，从农贸市场购得。本发明的有益效果在于:
由黑眶蟾蜍胱抑素编码基因推导其氨基酸结构，并进行原核表达，纯化后的黑眶蟾蜍胱抑素具有强烈的抑制组织蛋白酶B的活性，该黑眶蟾蜍胱抑素具有体外生产方便、抑制组织蛋白酶B活性强大的特点。本发明提供的黑眶蟾蜍胱抑素在2uM浓度可抑制75%的组织蛋白酶B活性，SuM浓度黑眶蟾蜍胱抑素可抑制90%的组织蛋白酶B活性。
图1是本发明黑眶蟾蜍胱抑素对组织蛋白酶B抑制活性结果示意图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特 殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。实施例1:黑眶蟾蜍胱抑素基因的克隆 一、黑眶蟾蜍皮肤总RNA提取
A、将活体黑眶蟾蜍用水清洗干净，放入液氮中速冻4小时，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入IOml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液,美国Invitrogen公司产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆10分钟；
B、加入等体积酚/氯仿溶液，振荡混匀，室温放置10分钟，4°C，12000rpm离心10分钟，吸取上层水相液体；
C、在上清液中加入上清液1/2体积的异丙醇，室温放置10分钟，4°C下7500g离心10分钟，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为黑眶蟾蜍皮肤总RNA。二、黑眶蟾蜍皮肤cDNA文库合成
米用 CL0NTECH 公司 CreatorTM SMART TM cDNA Library Construction Kit 质粒cDNA文库构建试剂盒，参照试剂盒说明书方法操作如下:
A、cDNA第一链合成(mRNA反转录)，具体步骤如下:
1、在0.5ml无菌的离心管加入I μ I黑眶蟾蜍皮肤总RNA、1 μ I SMART IV寡聚核苷酸、1μ I CDS 111/3’ PCR引物，加2μ1去离子水使总体积达到5μ1;
2、混匀离心管中的试剂并短暂离心，72°C保温2分钟；
3、将离心管在冰上孵育2分钟；
4、在离心管中加入以下试剂2.0μ I 5Χ第一链缓冲、Ι.Ομ I 20mM 二硫苏糖醇、
1.0 μ I IOmM dNTP 混合物、1.0 μ I PowerScript 反转录酶；5、混合离心管中试剂并短暂离心，在42°C保温I小时；
6、将离心管置于冰上中止第一链的合成；
7、从离心管取2μ I所合成的cDNA第一链备用。B、采用长末端聚合酶链式反应(LD- PCR )方法扩增第二链，具体内容如下:
1、95°C预热 PCR 仪；
2、将2μ1cDNA第一链(mRNA 反转录)、80μ1 去离子水、10μ1 IOXAdvantage 2 PCR缓冲、2 μ I 50 X dNTP 混合物、2 μ I 5’PCR 引物、2 μ I CDS 111/3，PCR 引物以及 2μ I 大肠杆菌聚合酶离心管进行反应；
3、在PCR仪中按以下程序扩增:
①95°C20秒钟
②22个循环:
95 0C5秒钟
68 0C6分钟；
4;循环结束后，将离心管中 合成的cDNA双链进行后续过程。三、黑眶蟾蜍胱抑素编码基因的扩增
1、95°C预热 PCR 仪；
2、将2μ I cDNA双链(上述产物)、75.5μ I去离子水、10 μ I PCR缓冲液、8 μ I dNTP混合物(各2.5uM)、2y I正向扩增引物、2 μ I反向扩增引物以及0.5 μ I大肠杆菌DNA聚合酶放入离心管中进行反应；正向扩增引物长度为23个核苷酸，其序列为5 ’ - ATGGATCAAAAAGGAAATGTTCC-3’ (SEQ ID NO:3)，反向扩增引物序列为
5’ -CTAAAAATAACAGATGGGGTCTTC-3’ (SEQ ID NO:4)；
3、在PCR仪中按以下程序扩增:
(1)预变性
95 0C5分秒钟
(2)25个循环:
95 0C30秒钟
56 0C40秒钟
72 0C30秒钟
(3)后扩增
72 0C5分钟
4、循环结束后，将PCR产物用TIANGEN公司的DNA产物纯化试剂盒进行抽提回收，步骤如下:
(1)将PCR产物与等体积的膜结合液颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合，12000rpm离心分I钟，倒掉收集管中的废液；
(2)加入700μ 的漂洗液(含乙醇)于离心纯化柱中，12000 rpm离心I分钟，倒掉收集管中的废液；
(3)重复步骤2；
(4)12000 rpm 离心 3 分钟；
(5)将离心纯化柱置于新的离心管中；(6)加入30μ1超纯水，在室温下静置5分钟；
(7)12000 rpm离心I分钟，管底溶液即为纯化过的黑眶蟾蜍胱抑素编码基因PCR产物。四、大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备
1、挑取单个DH5a菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50ml LB培养基中，37°C振荡2小时。当0D600值达到0.35时，收获细菌培养物；
2、将细菌转移到一个50ml预冷的无菌聚丙烯管中，冰上放置lOmin，使培养物冷却；
3、于4°C下4100rpm离心lOmin，吸出培养液，并将管倒置I min以使残留的培养基流
尽；4、每50ml 初始培养液用 30ml 预冷的 0.lmol/L CaCl2-MgCl2 溶液(80mmol/L MgCl2,20mmol/L CaCl2)重悬细胞沉淀；
5、于4°C下4100rpm离心lOmin，吸出上清液，并将管倒置I min以使残留的液体流
尽;
6、每50ml初始培养物用2ml预冷的0.lmol/L CaCl2溶液重悬细胞沉淀，分装后备用。五、连接及连接产物的转化
1、在微量离心管中加入Iμ I Takara pMD19_T simple载体、4 μ I黑眶蟾蜍胱抑素编码基因PCR产物及5 μ I的连接酶缓冲混合物；
2、16°C反应3小时；
3、全量(10μ I)加入至100 μ I DH5a感受态细胞中，冰中放置30分钟；
4、42C加热90秒钟后，再在冰中放直I分钟；
5、加入37°C温浴过的LB培养基890μ 1，37°C缓慢振荡培养60分钟；
6、取200μ I涂布于含有X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB培养基上，37°C培养16小时以形成单菌落。六、黑眶蟾蜍胱抑素基因克隆筛选及鉴定
挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C缓慢振荡培养4小时，进行PCR扩增，扩增引物及扩增条件同前述黑眶蟾蜍胱抑素编码基因的扩增条件；将经PCR确证的阳性克隆进行质粒提取后，以美国Applied Biosystems3730A全自动核苷酸序列测定仪进行核苷酸序列的测定；测序引物为BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47 (5，CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’)，基因测序结果自5’端至3’端序列为:
atggatcaaa aaggaaatgt tcctggcgga ctgggtgcag aaaagcctgc taccccagaa 60atacaggcgc tgtgtgacat ggtaaaatgc gcttttgagc aaaaatccgg gactaatgca 120gcagagttta aggccatctg ttacgcaagt caagttgttg ctggaacaat gtactatgtg 180aaggtggata ttggaggagg tcagtgctgt catctgaaaa tacttcaacc tctgcctact 240ggagggaaag tgagtctgag cgactaccag tgcgggaaga agaaggaaga ccccatctgt 300tatttttag309
黑眶蟾蜍胱抑素基因核苷酸序列长度为309个碱基，序列类型:核酸，链数:单链，拓扑学:直链状，序列种类:cDNA，来源:黑眶蟾蜍皮肤。编码黑眶蟾蜍胱抑素为第1- 306位核苷酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例2:黑眶蟾蜍胱抑素的原核表达、纯化 一、黑眶蟾蜍胱抑素原核表达载体的构建
根据编码黑眶蟾蜍胱抑素的基因设计引物，正向嵌套引物序列两条，加入Kpn I限制性内切酶切位点和肠激酶酶切位点，Fl序列为5’-GGTACCGACGACGACGACAAGATGGA-3’ (SEQ IDNO:5) ；F2 序列为 5，-CGACAAGATGGATCAAAAAGG-3，(SEQ ID NO:6);反向引物 R 序列为 5’-AAGCTTCTAAAAATAACAGATGGG-3’(SEQ ID NO:7)，加入 Hind III 酶切位点，经 PCR、胶回收后，进行双酶切；PCR、胶回收操作步骤同前实施例1中的步骤三。在PCR管中配制下列酶切体系:
PCR产物/环状载体50 ul
ddH2030ul
IOXM BufferIOul
Kpn I5ul(15 U )
Hind III5ul (15 U )
总体积IOOul
37°C酶切10小时，在反应管中加入6X溴酚兰载样缓冲液20μ1，混匀后于1.0%琼脂糖凝胶中电泳，根据条带大小回收目的片段，操作步骤同前实施例1中的步骤三。在PCR管中配制下列连接体系:
载体 DNA200ng
插入片段DNA30ng
连接酶IOX缓冲液2 ul
T4 DNA连接酶2U
加无核酸酶水至20ul15°C连接18小时，连接产物转入大肠杆菌BL21感受态细胞并筛选阳性克隆，操作步骤同前实施例1中的步骤三。二、黑眶蟾蜍胱抑素的诱导表达
1、37°C摇床培养至0D600到0.4-1 (建议0D600为0.6)；
2、加入IOOmMIPTG储液至终浓度0.4mM，继续培养2_3小时；
3、将摇瓶置于冰上5分钟，5000g4°C离心5分钟收集菌体；
4、重悬细胞于0.25倍体积预冷的20mM磷酸钠，20mM咪唑(pH7.4)中，离心；
5、除去上清，菌体保存于-700C冰箱或继续纯化。
三、黑眶蟾蜍胱抑素的纯化
1、超声破碎提取蛋白
以20mM磷酸钠，20mM咪唑(pH7.4)重悬细胞后，于冰浴中进行超声波破碎，功率100-200W,每次超声3s,间歇7s,总时间15min,离心取上清即可用于亲和层析；
2、亲和层析柱的准备
组装层析柱后，用蒸馏水冲洗以去除末端的气泡，关闭层析柱流出口，保持层析柱下端有部分水存在，重悬Ni Sepharose 6 Fast Flow填料后,连续单次将其装入层析柱,打开层析柱出口，将恒流泵设置为所需流速后，完成至少3个柱体积的洗脱、备用；
3、亲和层析以150cm/h的线性流速用5到10个柱体积的结合缓冲液(20mM磷酸钠，20mM咪唑，pH7.4)平衡层析柱，加入前述样品，用结合缓冲液洗柱子，直至280nm处吸收回复至基线处，用洗脱缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH7.4)进行线性梯度洗脱，收集60%-100%洗脱组分，即为黑眶蟾蜍胱抑素融合蛋白；
4、超滤
使用截留分子量3kD的超滤离心管进行超滤，于常温下4000转离心30min，加入等体积ddH20后重复离心步骤两次，收集离心管上方的液体进行后续操作；
5、肠激酶切割及纯化
取上述蛋白5mg，加入重组肠激酶20U，10X反应缓冲液lOOul，总体积Iml ;25V反应12小时后，进行亲和层析，收集层析柱不能结合的组分，再次进行超滤，即得纯度超过99%的黑眶蟾蜍胱抑素。实施例3:黑眶蟾蜍胱抑素的应用 检测黑眶蟾蜍胱抑素的组织蛋白酶B抑制活性。以生色底物 Z-Arg-Arg-pNA(Benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-arginine-p-nitroan1- lide)为反应底物，将牛组织蛋白酶B (0.2ng/反应)与反应缓冲液(0.1 M乙酸钠，pH 5.5，含ImM DTT, 2mM EDTA和4mM半胱氨酸)、不同浓度的黑眶蟾蜍胱抑素(终浓度2 - 8 μ M)，混合后置于室温5min，加入Z-Arg-Arg-pNA至终浓度为400uM，37°C孵育30min后检测410nm处吸光度(记为Abo I),设置加入重组黑眶蟾蜍胱抑素的作为对照(记为AboC)，计算抑制率，计算方法为(Abo C-Abo I)/Abo C X 100%。结果如图1显示，黑眶蟾蜍胱抑素具有强大的组织蛋白酶B抑制活性，在2uM浓度时可抑制75%的组织蛋白酶B活性，8uM浓 度黑眶蟾蜍胱抑素可抑制90%的组织蛋白酶B活性，而且这种抑制作用十分迅速，在15秒内2uM黑眶蟾蜍胱抑素即可抑制60%的组织蛋白酶B活性，实验证明其可以作为组织蛋白酶抑制剂使用。
权利要求
1.一种黑眶蟾蜍胱抑素，其特征在于:所述黑眶蟾蜍胱抑素的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
2.一种编码权利要求1所述黑眶蟾蜍胱抑素的基因，其特征在于:核苷酸序列如SEQID NO:1 所示。
3.权利要求1所述的黑眶蟾蜍胱抑素在制备组织蛋白酶B抑制剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种黑眶蟾蜍胱抑素及其基因，该黑眶蟾蜍胱抑素的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，编码黑眶蟾蜍胱抑素的基因核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，通过原核表达手段获得的黑眶蟾蜍胱抑素具有很强的组织蛋白酶B抑制活性，并且还具有体外生产方便、抑制组织蛋白酶B活性强大的特点，可做为组织蛋白酶B抑制剂进行应用。
文档编号C12N15/15GK103172730SQ20131008570
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者宋玉竹, 刘娃, 张阿梅, 韩芹芹, 纪森林 申请人:昆明理工大学