专利名称：一种预测优秀冰雪运动员弹跳潜能的分子生物学方法
技术领域：
本发明是一种预测优秀冰雪运动员弹跳潜能的分子生物学方法，即运用分子生物学方法对冰雪运动员的跳跃潜能进行预测，属于体育科学和生物科学的交叉学科。
背景技术：
弹跳是冰雪运动员的一项重要专项素质，跳跃项目要求运动员在短时间内表现出最大速度或最大力量，对爆发力要求高，需要大功率、短时间的供能。教练员们无不将弹跳的训练放在优秀冰雪运动员身体训练的重要地位上。弹跳是一项综合性素质，弹跳的发展受多种因素的影响和制约。尽管后天训练和营养等环境因素也能显著影响人体的运动能力，研究也发现运动员的基因组成和多态性在很大程度上决定着他们的体能。爆发力有多种定义，简单地说就是人体的功率，即力量乘以速度，很多冰雪运动项目都需要运动员有很好的弹跳力。如花样滑冰，跳跃动作已经是自由滑中最重要的成分，各种跳跃动作在现今自由滑内容中，占有极大的百分比。做为一个参加比赛的运动员，不单有完成单个跳跃动作的能力，而且也应该能联跳和连续跳。跳跃动作是肌肉作功的结果，是由冰面弹起身体、自由地掠过空中及降落在冰上向后滑行的一些位移。它们的突出特点是要求运动员在短暂的时间内，最大限度地募集肌肉收缩力量，发挥出体能潜力，运动员需要有较高的速度素质和速度力量。大量研究表明a -肌动蛋白-3(a -actinin-3，ACTN3)基因与人体肌肉的爆发力密切相关，ACTN3基因定位于第11号染色体上，进化上具有高度的保守性，在人类肌肉的结构和功能上都很重要。世界上约10亿人缺乏ACTN3蛋白。这与人类ACTN3基因的多态性有关。ACTN3基因野生型(R)的第16个外显子的第1747位是C，当C突变成了 T后就成为突变型(X)。因此当个体的ACTN3基因型是577XX纯合子时，第577个氨基酸残基(精氨酸)就变成了一个终止码，从而导致ACTN3的缺失。速度素质与神经系统的反应速度、灵敏、协调和肌肉系统、肌纤维类型有关，受先天性遗传的影响较大，发展敏感期早，因此可以较早地运用表象指标进行测试评价，为早期选材提供依据。速度力量发展敏感期较晚，到青春期后期才能达到较高水平。因此，利用ACTN3基因在早期准确预测个体爆发力的水平，无疑可以提高速度力量性项群人才培养的成功率。研究证实，带有R等位基因的个体具有爆发力的优势，而带有X等位基因的个体无论在爆发力还是耐力上，都没有显现出任何特别之处。携带这种基因的运动员在接受相同质量训练时比非携带者更容易取得好的运动成绩。新的分子生物学证据表明，由于提高了有氧代谢相关酶类的生理活性，增加了慢肌纤维数量，减少了快肌纤维直径，导致ACTN3敲除小鼠体内的肌肉力量显著降低。血管紧张素I转换酶(angiotensin I converting enzyme,ACE)基因多态性也已被证实与人体运动天赋相关。ACE基因位于17q23染色体区域，全长21kb，含26个外显子和25个内含子，在第16号内含子以一段287bp的重复序列为标记构成ACE基因的插入/缺失((Insertion/Deletion, I/D)多态性。
研究发现运动员与常人不论在基因型频率还是等位基因频率上均有显著差异(P< 0.02和？ < 0.003)，且优秀运动员多为ACE-1I纯合子，而少见DD纯合子。普遍认为确实存在ACE基因的I/D多态性与运动能力的相关性。Williams等发表在《Nature》杂志上的一篇研究结果认为，肌肉作功与能量消耗的比值(DE)是评价肌肉效能的最好指标，其研究发现经过11周训练后仅ACE-1I基因型的DE显著增高。另一研究报道ACE-1I基因型群体较ACE3/ID和DD基因型群体表现出相对高的能量节省化状态，且去脂体重也高于其他基因型。这些研究结果均支持I等位基因主要是通过肌肉效能影响运动能力。此外，与ACE-1等位基因关联的优秀耐力运动员群体血浆和心肌组织的ACE水平也高于其他基因型。如果一名运动员同时拥有多种促进运动能力的基因组合，则他很可能在自己的领域取得较大突破。影响运动能力的基因变异体的发现和性质鉴定，使得在儿童中开展DNA测试，以辨别出适合某种特殊体育运动项目的天才或者优化训练方法成为可能。
发明内容
本发明通过检测ACTN3基因R/X多态性和ACE基因I/D多态性来预测冰雪运动员的弹跳潜能。实施方案主要试剂:红细胞裂解液(10mmol/LTris-HCL pH7.6，5mmol/L，MgCl2，IOmmoI/L NaCl)，白细胞裂解液(10mmol/L Tris,pH7.6,10mmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl)、蛋白酶 K、10% SDS、6M饱和氯化钠、苯酚氯仿异戊醇(25: 24:1)。操作步骤:1、抽取血液静脉抽取冰雪运动员静脉血10mL，肝素抗凝。2、基因组DNA的提取及纯化(I)将抗凝血以1500r/min离心5min,吸出血衆。(2)加等体积的红细胞裂解液,上下颠倒充分混勻，2500 3000r/min离心15min,
去上清液。(3)加适量红细胞裂解液2 3mL,上下颠倒充分混勻，4000r/min离心12min,去
上清液。(4)重复步骤(3)2 3次，加白细胞裂解液3mL，上下颠倒混匀，加适量10% SDS,轻轻摇匀，加10mg/mL RNAase，37°C水浴中孵育2h，加10mg/mL蛋白酶K，37°C恒温水浴中孵育过夜。(5)加入等量体积的饱和酹,混勻后2500r/min离心IOmin,取上清液(注意不要吸到有机相和无机相之间的蛋白质)。(6)加等量体积的苯酹氯仿异戍醇(25: 24: I), 5000r/min离心IOmin,取上清液加等量的氯仿异戍醇(24: I) 5000r/min离心lOmin。(7)取上清液，加2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻摇动至絮状DNA析出，1000 1500r/min离心5min,使DNA贴壁去乙醇，用70 乙醇清洗一次，1000 1500r/min离心5min,去乙醇。
(8)适量 70% 乙醇将 DNA 重悬，移入 0.15mL 的 ^pendof 管中，1000 1500r/min离心5min，去乙醇，自然干燥。(9)将DNA溶解于TE缓冲液中。取2 y LDNA样品，用紫外分光光度法检测样品的A (OD)值及DNA浓度，最后DNA均调整至100 U g/mL。3、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)(I)引物设计ACTN3 基因上游引物:5，CTG TTG CCT GTG GTA AGT GGG-3’ACTN3 基因下游引物:5，TGG TCA CAG TAT GCA GGA GGG-3，ACE 基因上游引物:5，CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3，ACE 基因下游引物:5’ GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T-3’ (2) ACTN3基因-PCR反应体系及循环参数PCR 反应体系 :3u L ddH20、上下游引物个 Iii L、10ii L 2 X Reddy Mix (5mM MgCl2)、5 ii L基因组DNA。基因PCR反应条件:95 °C预变性5min，94 V变性30s，60 V退火30s，72 °C延伸30s，共35个循环，72°C延伸30s，延伸循环完毕，取出PCR管，置于4°C冰箱待测。(3) ACE基因-PCR反应体系及循环参数PCR 反应体系:总体系 25 ii L、ddH2015 u L、dNTP2.0 u L, 10*buffer2.5 y L (内含 Mg2+，浓度为 15_/1)、]\%2+1.01^(浓度2511111/1)、引物各 1.0ii L、模板 2.0ii L Taq 酶
0.5 u L0ACE 基因 PCR 反应条件:94°C预变性 4min，94°C变性 lmin，55.5°C退火 lmin，72DC延伸lmin30s，共30个循环，72°C延伸lOmin，延伸循环完毕，取出PCR管，置于4°C冰箱待测。4、ACTN3和ACE基因型鉴定(1)ACTN3基因型鉴定取15 ii L PCR产物与Loadingbuffer混合，3%琼脂糖凝胶电泳约90min，电泳后取出凝胶块放置于紫外线分析仪内，观察电泳条带并用照相机拍摄图片。根据MARKER识别86、97、108和205bp大小片段的RR基因型的个体。(2) ACE基因型鉴定琼脂糖凝胶电泳:按2: 7体积将Loadingbuffer与PCR产物混合，I %琼脂糖凝胶电泳约40min，电泳后取出凝胶块放置于紫外线分析仪内，观察电泳条带并用照相机拍摄图片。筛选仅有401bp条带的纯合子插入型(II)。5、统计筛选根据凝胶电泳的条带大小来判断待测者的ACTN3基因和ACE基因的基因型。筛选出ACTN3基因为RR型同时ACE基因为II型的个体。
权利要求
1.本发明是一种预测优秀冰雪运动员弹跳潜能的分子生物学方法。
2.依据权利要求1所述的方法，其特征在于通过测定冰雪运动员血液来源基因组DNA中ACTN3基因型R/X多态性和ACE基因型I/D多态性来预测冰雪运动员的弹跳潜能。即筛选ACTN3(RR)型同时ACE基因 为(II)型的个体。
全文摘要
ACTN3基因的577R等位基因对于力量素质和速度素质来说是优势等位基因。在众多对抗阻训练效果的研究中，也均发现R等位基因携带者的训练敏感性更高。ACTN3基因的多态性与力量素质密切相关不容置疑。另外，ACE基因组中I等位基因也可能是力量素质的相关基因。本发明通过同时测定冰雪运动员血液来源基因组DNA中ACTN3基因型R/X多态性和ACE基因型I/D多态性来预测冰雪运动员的弹跳潜能即筛选ACTN3-RR型同时ACE基因为纯合子插入(II)型的群体。本发明可用于优秀冰雪运动员早期的选拔。
文档编号C12Q1/68GK103160597SQ20131011593
公开日2013年6月19日 申请日期2013年4月7日 优先权日2013年4月7日
发明者贾春佳, 吕婵, 张臣, 孙玉姣, 陆涛峰, 关伟军 申请人:哈尔滨体育学院