α-半乳糖苷酶缺陷的治疗的制作方法

α-半乳糖苷酶缺陷的治疗的制作方法
【专利摘要】本发明提供了高纯度的α-Gal?A及其多种纯化方法；电荷改变的α-Gal?A制剂及其制备方法；在哺乳动物宿主中循环半衰期延长的α-Gal?A制剂及其制备方法；以及对受治疗者施用α-Gal?A制剂的方法和剂量。
【专利说明】Ct-半乳糖苷酶缺陷的治疗
[0001]本申请是申请号为00807312.0、申请日为2000年3月9日、发明名称为“ a-半乳
糖苷酶缺陷的治疗”的中国发明专利申请的分案申请。
发明领域
[0002]本发明涉及用于治疗a -半乳糖苷酶A缺陷的方法和组合物。
[0003]发明背景
[0004]Fabry病(费勃莱氏病，酰基鞘氨醇己三糖苷酶缺乏症)是X染色体连锁的遗传性溶酶体贮积病，特征为严重的肾损伤、血管角质瘤、和心血管异常(包括心室膨大和二尖瓣闭锁不全)。Fabry病还影响外周神经系统，引起极度痛苦的发作，四肢灼痛。Fabry病是由a-半乳糖苷酶A(a-Gal A)的缺陷引起的。a-Gal A是溶酶体糖水解酶，切割各种复合糖的末端a-半乳糖基部分。Fabry病导致阻断中性糖神经鞘脂一一酰基鞘氨醇己三糖苷(CTH)的分解代谢，并在细胞内和血流中积累这种酶底物。
[0005]由于这种疾病具有X染色体连锁的遗传模式，大多数Fabry病患者是男性。虽然已经观察到受到严重影响的女性杂合子，但是女性杂合子通常没有症状，或者具有相对较弱的症状(诸如特征性角膜混浊)。剩余a-Gal A活性低、抑或有很微弱的症状抑或表面上没有Fabry病其它特征性症状的非典型性变异型Fabry病，与左心室肥大和心脏病有关Nakano 等人，新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.) 333:288 — 293，(1995)。a -Gal A 的降低可能是这些心脏异常的病因。
[0006]已经分离得到了编码人a-Gal A的cDNA和基因并进行了测序。人a-Gal A是作为429个氨基酸的多肽表达的，其N末端31个氨基酸为信号肽。人的这种酶已经在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中(Desnick等人，美国专利5，356，804 ；1annou等人，细胞生物学杂志(J.Cell Biol.) 119:1137，(1992))和昆虫细胞中(Calhoun 等人，WO 90/11353)得到表达。
[0007]然而，目前的a-Gal A制剂的功效有限。高纯度a-Gal A的制备方法依赖于使用的亲和层析法，即植物凝血素亲和层析法(伴刀豆球蛋白A (ConA) Sepharose?)和基于
将a -Gal A与Sepharose?基质偶联的底物类似物N-6-氨基己酰基-a -D-半乳糖基胺
的结合的亲和层析法的联合。参阅例如，Bishop等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.) 256:1307 — 1316,1981)。使用蛋白质性质的植物凝血素亲和树脂和底物类似物树脂通常与亲和剂从固相支持物连续脱落有关(Marikar等人，分析生化(Anal.Biochem.) 201:306 —310，1992)，导致纯化产物中污染了在溶液中游离的或结合了洗脱蛋白质的亲和剂。这些污染使产物不适合用于制药学制剂。结合的底物类似物和植物凝血素也可能对蛋白质的酶学、功能性、和结构特性具有实质性的消极影响。此外，用以前的方法制备的a-Gal A在肝脏中被快速清除。
[0008]因此，本领域仍然需要使用传统层析树脂的纯化方案，这种树脂可以从供应商处容易地获得，质量适用于大剂量商业用途，而且产生的a-Gal A制剂，不含亲和剂。另外，本领域仍然需要循环半衰期延长、在肝脏以外的特定组织中的摄取增加的a-Gal A制剂。
[0009]发明概述
[0010]本发明提供了高纯度的a-Gal A制剂及用于纯化a-Gal A糖形式的多种方法。本发明还提供了电荷改变的a-Gal A制剂及其制备方法。电荷变化是通过增加a-Gal A的唾液酸含量和/或增加a-Gal A的磷酸化来实现的。本发明还提供了在哺乳动物宿主中循环半衰期延长的a-Gal A制剂及其制备方法。最后，本发明还提供了对受治疗者施用a-Gal A制剂的方法和剂量。本发明的a-Gal A可用于治疗Fabry病患者或Fabry病非典型性变异型患者(如主要为心血管异常的特定Fabry病患者群，诸如心室膨大，如左心室肥大(LVH)，和/或二尖瓣闭锁不全；或者主要为肾累及的患者)。
[0011]图的简述
[0012]图1表示用于从人成纤维细胞cDNA文库分离a -Gal A cDNA的2IObp探针(SEQID N0:l)o探针的序列来自a-Gal A基因的外显子7。该探针是通过聚合酶链反应(PCR)由人基因组DNA分离的。图中标有下划线的区域对应于扩增引物的序列。
[0013]图2表示完成a-Gal A cDNA克隆5’端的DNA片段的序列(SEQ ID NO:2)。此片段是通过PCR由人基因组DNA扩增的。标有下划线的区域对应于扩增引物的序列。同时还标明了实施例1中所述亚克隆利用的NcoI和SacII限制性内切酶位点的位置。
[0014]图3表示了 a -Gal A cDNA的序列，包括编码信号肽的序列(SEQ ID NO:3)。
[0015]图4是a -Gal A表达构建物pXAG_16的示意图，包括CMV(细胞肥大病毒)启动子、第一个外显子、和第一个内含子，hGH信号肽编码序列和第一个内含子，a-Gal A的cDNA(缺a-Gal A信号肽序列),和hGH3’UTS。pcDNeo指示了从质粒pcDNeo得到的neo基因的位置。
[0016]图5是a -Gal A表达构建物pXAG_28的示意图，包括胶原蛋白I a 2启动子和第一个外显子，P -肌动蛋白内含子，hGH信号肽编码序列和第一个内含子，a-Gal A的cDNA(缺a -Gal A信号肽序列),和hGH3’UTS。pcDNeo指示了从质粒pcDNeo得到的neo基因的位置。
[0017]图6表示了人a-Gal A氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
[0018]图7表示了编码人a -Gal A的cDNA序列(无信号肽)(SEQ ID NO:5)。
[0019]图8是使用丁基Sepharose?树脂的a-Gal A纯化步骤的层析图谱。显示了选
定的收集液在280nm处的吸光率(普通线)和a -Gal A活性(打点线)。
[0020]图9是pGA213C的示意图。
[0021]图10是靶向构建物pGA213C及其与内源a -半乳糖苷酶A基因座进行同源重组的图解。将PGA213C描述成靶向序列，排列于X染色体a-半乳糖苷酶A基因座的相应序列的上面。在线性图谱上面的数字表示的是相对于甲硫氨酸起始密码子ATG的位置。在第-221位的上面显示了含有通过DNA克隆插入该处的鼠dhfr、细菌neo、和CMV启动子/醛缩酶内含子序列的激活单位。a-半乳糖苷酶A编码序列由深色盒表示。a-半乳糖苷酶A非编码基因组序列由浅色盒表示。大箭头表示dhfr和neo表达盒的转录方向。激活的a-半乳糖苷酶A (GA-GAL)基因座图谱下面的分段线表示成功`靶向和基因活化后的GA-GAL mRNA剪接。
[0022]发明详述[0023]序言
[0024]此处所述的发明涉及一些新的a -Gal A制剂及其生产方法，以及使用这些制剂治疗Fabry病或非典型性变异型Fabry病患者的方法。下文概述和更详细地说明了某些受到关注的代表性实施方案。
[0025]本发明将在任何细胞(a -Gal A生产细胞)中生产的a -Gal A用于Fabry病的治疗。在优选的实施方案中，本发明使用由标准基因工程技术(基于将克隆的a-Gal A基因或cDNA导入宿主细胞)或基因活化方法生产的人a-Gal A。
[0026]本发明提供了含有纯度高于在现有技术中制备的a -Gal A的制剂及其生产方法。如SDS-PAGE或反相HPLC所测量，使用本发明的纯化方法，人a -Gal A制剂组合物优选地纯化到至少98%同质性，更优选地至少99%同质性，最优选地至少99.5%同质性。本发明的a-Gal A制剂的比活性优选地至少2.0xlO6单位/mg蛋白质,更优选地至少3.0xlO6单位/mg蛋白质,最优选地至少3.5xl06单位/mg蛋白质。
[0027]在一个实施方案中，在疏水相互作用树脂上将各种糖形式的a-Gal A与其它成分分开，由此纯化a-Gal A制剂，但是不包括植物凝血素层析步骤。在优选的实施方案中，疏水相互作用树脂的功能部分包括丁基。
[0028]在备选的实施方案中，首先在层析柱中于平衡缓冲液中酸性pH下使各种糖形式的a-Gal A结合到阳离子交换树脂上，然后用平衡缓冲液清洗层析柱，洗脱未结合的物质，并使用10 -1OOmM的盐溶液、pH4 一 5的缓冲液、或其组合作为洗脱液洗脱各种糖形式的a-Gal A，由此纯化a-Gal A制剂。在优选的实施方案中，平衡缓冲液的pH为大约4.4。
[0029]在另一个备选的实施方案中，用包括层析聚焦层析法、金属螯合物亲和层析法、或免疫亲和层析法中的至少一个方法的纯化步骤，将样品中的各种糖形式的a-Gal A与样品中的其它成分分开，从而纯化·了 a-Gal A制剂。
[0030]本发明还提供了 a-Gal A电荷改变的a-Gal A制剂及其生产方法。制剂可能包括不同糖形式的a-Gal A。电荷的改变是通过增加a-Gal A制剂中的唾液酸含量和/或增加a-Gal A制剂的磷酸化程度来实现的。
[0031]a -Gal A制剂中的唾液酸含量是如下增加的:(i)在纯化过程之中或之后分离高电荷和/或高分子量的糖形式的a-Gal A ;(ii)使用经遗传修饰的细胞(通过传统的基因工程方法或基因活化方法)表达唾液酰基转移酶基因或cDNA来添加唾液酸残基在低铵环境发酵或培养表达该酶的细胞。
[0032]如下增加a -Gal A制剂的磷酸化:(i )使用经遗传修饰的细胞来(通过传统的基因工程方法或基因活化方法)表达磷酸转移酶基因或cDNA，添加磷酸残基；或(^)向培养细胞加入磷酸酶抑制剂。
[0033]使用本发明的方法，获得了人的糖基化a-Gal A制剂，其中35 % — 85 %的寡糖带电荷。在优选的实施方案中，至少35%的寡糖带电荷。在更优选的实施方案中，至少50%的寡糖带电荷。
[0034]可供选择的优选的人糖基化a-Gal A制剂具有多种a-Gal A糖形式，其中优选地至少20%，更优选至少50%，最优选至少70%使聚糖与2 — 4个唾液酸残基复合。在可供选择的优选的实施方案中，具有多种糖形式的人糖基化a-Gal A制剂的寡糖电荷如Z数目测量所得，大于100，优选地大于150，更优选地大于170。在另一个可供选择的优选的实施方案中，具有多种糖形式的人糖基化a -Gal A制剂平均至少16 — 50%，优选地25 —50%,更优选地至少30%磷酸化。在另一个可供选择的实施方案中，具有多种糖形式的制剂中，50 — 75%，优选地60%的总聚糖唾液酸化。
[0035]在本发明的一个实施方案中，生产寡糖电荷增加的糖基化a -Gal A制剂的步骤如下:首先将编码GlcNAc转移酶III (GnT-1II)的多核苷酸导入a-Gal A生产细胞或者通过同源重组导入调控序列以调控内源GnT-1II基因的表达；然后在能够表达a-Gal A和GnT-1II的培养条件下培养a-Gal A生产细胞；最后分离寡糖电荷增加的a-Gal A制剂。
[0036]在本发明的备选实施方案中，生产寡糖电荷增加的糖基化a-Gal A制剂的步骤如下:首先将编码唾液酰基转移酶的多核苷酸导入生产的a-Gal A细胞或者通过同源重组导入调控内源唾液酰基转移酶基因的表达的调控序列；然后在能够表达a-Gal A和唾液酰基转移酶的培养条件下培养a -Gal A生产细胞；最后分离寡糖电荷增加的a -Gal A制剂。优选的唾液酰基转移酶包括a 2，3-唾液酰基转移酶和a 2，6-唾液酰基转移酶。该方法在优选的实施方案中，包括通过制剂的分级分离或纯化来选择大小或电荷增加的a -GalA糖形式的额外步骤。
[0037]在另 一个实施方案中，获得唾液酸化增加的糖基化a-Gal A制剂的步骤如下:将a -Gal A生产细胞接触铵浓度低于IOmM的培养基，更优选地铵浓度低于2mM。在优选的实施方案中，低铵环境是通过向培养基中加入谷氨酰胺合成酶来兑现的。在备选的优选的实施方案中，低铵环境是通过用新鲜培养基连续或间歇灌注a-Gal A生产细胞以维持铵浓度低于IOmM (优选地低于2mM)来实现的。
[0038]在另外的一个实施方案中，获得磷酸化增加的糖基化a-Gal A制剂的步骤如下:首先将编码磷酸转移酶的多核苷酸导入a-Gal A生产细胞或者通过同源重组导入调控内源磷酸转移酶基因表达的调控序列；然后在能够表达a-Gal A和磷酸转移酶的培养条件下培养上述a-Gal A生产细胞；最后分离磷酸化程度比不含所述多核苷酸的细胞产生的a-Gal A更大的a-Gal A制剂。在优选的实施方案中，由本发明方法生产的a-GalA制剂具有多种糖形式，其中的16 - 50%，优选地25 - 50%，更优选地至少30%的糖形式是磷酸化的。在优选的实施方案中，该方法包括通过分离或纯化制剂来选择大小或电荷增加的a-Gal A糖形式的额外步骤。
[0039]在另外的一个实施方案中，磷酸化增加的糖基化a-Gal A制剂是通过向培养细胞中加入磷酸酶抑制剂(如溴四咪唑)获得的。在用作培养细胞的生长添加剂的胎牛血清中可以存在低水平的牛血浆碱性磷酸酶。这增加了分泌的a-Gal A上暴露的Man-6-P表位成为血浆碱性磷酸酶底物的可能性。已经显示，溴四咪唑是碱性磷酸酶的潜在抑制剂，Ki=2.8mM (Metaye 等人，生化药理学(Biochem.Pharmacol.) 15:4263 — 4268,1988));并在0.1mM浓度时达到完全抑制(Borgers 和 Thone,组织化学(Histochemistry) 44:277 — 280,1975)。因此，在一个实施方案中，可以在培养的细胞中加入磷酸酶抑制剂(如溴四咪唑)，从而通过预防Man-6-P酯基的水解使得存在于培养基中的a-Gal A的高摄取形式最大化。
[0040]本发明还提供了在哺乳动物宿主中循环半衰期延长的a-Gal A制剂及其生产方法。增强循环半衰期和细胞摄取的步骤如下:(i)增加a-Gal A的唾液酸含量(如上兑现)；(ii)增加a-Gal A的磷酸化(如上兑现);(iii)PEG化a-Gal A;或(iv)相继除去a-GalA寡糖链上的唾液酸和末端半乳糖残基，或除去末端半乳糖残基。[0041]改善的a-Gal A制剂的唾液酸化也增强了外源a-Gal A的循环半衰期。另外，相对于肝细胞而言，非肝细胞中改善的a-Gal A的唾液酸化也增强了 a-GalA的摄取，这些非肝细胞如肝内皮细胞、肝血窦细胞、肺细胞、肾细胞、神经细胞、内皮细胞、或心细胞。唾液酸含量增加的人糖基化a-Gal A制剂优选包括多种糖形式，其中至少20%的复合聚糖含2 — 4个唾液酸残基。备选的优选人糖基化a -Gal A制剂也具有多种糖形式，其中50 —75%，优选地至少60%的总聚糖唾液酸化。
[0042]a-Gal A制剂的磷酸化也提高了进入细胞的a-Gal A水平。磷酸化是在表达a-Gal A的细胞内发生的。本发明的优选人糖基化a-Gal A制剂优选地包括多种糖形式，其中至少平均16 - 50%的糖形式磷酸化，优选地25 - 50%，更优选地至少30%。
[0043]在备选的实施方案中，a -Gal A与聚乙二醇复合增强了人a -Gal A制剂的循环半衰期。在优选的实施方案中，a-Gal A制剂是通过与tresyl单甲氧基PEG (TMPEG)复合形成PEG化a -Gal A。然后将它纯化提供了分离的PEG化a -Gal A制剂。PEG化a -GalA加长了蛋白质的循环半衰期，增强了体内功效。
[0044]唾液酸化影响蛋白质的循环半衰期和生物分布。含微量唾液酸或不含唾液酸的蛋白质容易通过蛋白质上暴露的半乳糖残基由肝细胞上的唾液酸糖蛋白受体(Ashwell受体)进行内在化。以半乳糖结尾的a-Gal A的循环半衰期可以如下步骤按序增强:(1)让a -Gal A接触神经氨酸苷酶(唾液酸酶)除去唾液酸，由此暴露末端半乳糖部分，并(2)使脱唾液酸a-Gal A接触P _半乳糖苷酶除去末端半乳糖苷残基。产生的a-GalA制剂的寡糖链上的末端唾液酸和/或末端半乳糖苷残基数目比未相继接触神经氨酸苷酶和3-半乳糖苷酶的a-Gal A制剂的寡糖链上的少。或者，让脱唾液酸a-Gal A只接触P -半乳糖苷酶，除去末端半乳糖苷残基而增长半乳糖结尾的a -Gal A的循环半衰期。产生的a -GalA制剂的寡糖链上的末端半乳糖苷残基数目比未接触P -半乳糖苷酶的a -Gal A制剂少。在优选的实施方案中，在先后接触神经氨酸苷酶和(6-半乳糖苷酶后，再让产生的a-GalA制剂接触3 -氨基己糖苷酶，从 而将寡糖切至三甘露糖核。
[0045]另外，唾液酸化水平可以根据所用的细胞类型而变化。因此，在另一个优选的实施方案中，a-Gal A的唾液酸化是通过筛选唾液酰基转移酶活性相对较高的哺乳动物细胞(如人细胞)并利用这些细胞作为a -GalA生产细胞而增强的。
[0046]本发明还提供了基本上不含非a-Gal A蛋白质(诸如清蛋白、宿主细胞产生的非a-Gal A蛋白质、或从动物组织或流体分离的蛋白质)的a-Gal A制剂的配方。在一个实施方案中，配方还包括赋形剂。优选的赋形剂包括甘露醇、山梨醇、甘油、氨基酸、脂类、EDTA、EGTA、氯化钠、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷、葡聚糖、或这些赋形剂的任意组合。在另一个实施方案中，配方还包含非离子去污剂。优选的非离子去污剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80、屈立通X-100、屈立通X-114、Nonidet P-40、辛基a-葡萄糖苷、辛基P -葡萄糖苷、Brij 35、Pluronic、和吐温20。在优选的实施方案中，非离子去污剂包括聚山梨酯20或聚山梨酯80。优选的配方还包括磷酸盐缓冲液，PH优选地为6。
[0047]本发明还提供了对受治疗者施用a-Gal A制剂的方法。在优选的实施方案中，a-Gal A制剂是本文所述电荷改变(如寡糖电荷增加)和/或循环半衰期延长的a-Gal A制剂。施用剂量优选地每kg体重0.05 — 5.0mg,更优选地每kg体重0.1 — 0.3mg, a -GalA制剂，一周一次或两周一次。在优选的实施方案中，施用剂量可以每kg体重约0.2mg,两周一次。在这些方法中，可以如下施用:通过肌肉内、口、直肠、皮下、动脉内、腹膜内、大脑内、鼻内、真皮内、鞘内、穿粘膜、穿真皮、或吸入。在一个实施方案中，向受治疗者投递a-GalA制剂的方法包括两周一次或一周一次每kg体重皮下施用0.01 - 10.0mg，优选地0.1 一
5.0mga-Gal A制剂。a-Gal A制剂也可以静脉内施用，如静脉内大剂量注射、慢推静脉内注射、或连续静脉内注射。在任何上述方法中，a-Gal A制剂可以使用投递系统投递，诸如泵投递、包囊细胞投递、脂质体投递、针头投递注射、无针头注射、喷雾器、气雾器、电穿孔、和透皮贴。任何上述a-Gal A制剂可以使用这些方法施用。
[0048]使用上述施用方法和剂量，a -Gal A制剂可以治疗怀疑患有或已知患有Fabry病的个体。本发明关注对Fabry病患者(“Fabry患者”)以及非典型性变异型Fabry病患者(如主要为心血管异常的特定Fabry病患者群,本文中定义为心室膨大的Fabry患者,如左心室肥大(LVH)，和/或二尖瓣闭锁不全，或者主要为肾累及的患者)的治疗。
[0049]a -Gal A
[0050]a -Gal A是从糖脂和糖蛋白水解末端a -半乳糖基部分的同型二聚体糖蛋白。
[0051]术语成熟的“ a -Gal A”和“GA-GAL”和SEQ ID NO:5”(见图7)指不含信号肽的a-Gal A (对于含信号肽的a-Gal A，见图3和SEQ ID NO:3)。如本文中定义的，术语“ a -Gal A制剂”可与术语“糖基化a -GalA制剂”互换使用，而且包括各种糖基化的a -GalA糖形式。
[0052]“信号肽”指将该信号肽与之连接的新合成的肽引向内质网(ER)进行进一步的翻译后加工和分布的肽序列。
[0053]如本文中对a -Gal A的论述中所用，`“异源信号肽”指非人a -Gal A信号肽，通常是除a-Gal A之外的一些哺乳动物蛋白质的信号肽。
[0054]技术人员会认识到，人a-Gal A DNA序列(cDNA [SEQ ID NO:5]或基因组DNA)或者因沉默密码子变化或产生保守性氨基酸替代的密码子变化而与人a-Gal A DNA不同的序列可以用于遗传修饰培养人细胞，使得细胞过度表达并分泌本酶。a-Gal A序列中的某些突变可以编码保留了或展示改善的a-Gal A酶活性的多肽。比如说，特别是如果它们占蛋白质总残基数的比率低于10%，技术人员将期望保守性氨基酸替代对生物学活性影响较小或没有影响。保守性替代通常包括下列几组中的替代:甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。参阅，例如美国专利5，356，804，引入本文作为参考。
[0055]Fabry 病
[0056]Fabry病是由酶a -Gal A的活性缺陷引起的遗传性紊乱。“ a -Gal A缺陷”指患者中该酶的量或活性的缺乏导致中性糖脂(如globotriaosylceramide)在血管壁组织细胞中积累异常，伴随大腿、臀部、和生殖器上的血管角质瘤，少汗，四肢感觉异常，角膜轮生，和辐状后囊下内障。该物质的沉积可以导致疼痛、严重的肾和心血管疾病、和中风。正如通常在Fabry病男性患者中观察到的糖脂的积累会诱导严重的症状。或者如在缺陷基因的杂合子女性携带者中有时看到的，积累诱导相对微弱的症状。受影响个体的期望寿命大大缩短；常常大约40岁就因肾、心、或脑血管并发症而死亡。这种疾病没有特异性治疗。归类为溶酶体贮积紊乱的Fabry病患者在全世界有15，000人以上。
[0057]上文定义的Fabry病是一种复杂的临床综合症，特征是涉及多器官和多系统。患有角膜营养不良、皮肤病变(血管角质瘤)、痛苦的神经病、脑血管疾病、心肌病、和肾功能障碍全部病症的患者归为“典型性”表型。而一些没有全部典型性表型的患者归为“Fabry病非典型性变异型”。存在几种与a-半乳糖苷酶A缺陷有关的非典型性变异型表型。例如，一些a-半乳糖苷酶A缺陷患者患有只涉及心的变异型Fabry病，如左心室肥大(LVH)。还存在只涉及肾的另一种变异型表型。虽然在男性半合子中已经确认了这两种变异型表型，但是同样在女性杂合子中也已经有变异型Fabry病的报道。
[0058]非典型性心变异型患者通常在生命后期患有症状性疾病。心变异型表型患者的诊断的平均年龄大约是52岁，而典型性表型大约是29岁(Desnick等人，在《遗传性疾病的代谢和分子基础》(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease)中，第 6版，1996, Scriver 等人(编),McGraw-Hi 11,纽约，第 2741 — 2784 页；Meikle 等人,美国医学学会会刊(J.Am.Med.Assoc.) 281:249 — 254，1999)。这种综合症的患者通常存在微弱的心功能障碍症状，诸如劳力性呼吸困难。通常，标准回声心动图分析表明，心变异型表型患者左心室肥大(LVH)或中隔不对称肥大。然而，患者还可能有心肌梗死或心肌病(Scheidt等人，新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)324:395 — 399,1991 ；Nakao等人，新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.) 333:288 — 293，1995))。这些患者经常进行心肌活组织检查，表明变异型综合症的病理学与典型性Fabry病(贮积的糖脂浸润心肌)基本相似。这些患者的a-半乳糖苷酶A酶实验发现酶水平的范围很广。例如，有报导，心变异型患者的a-半乳糖苷酶A酶活性高达正常水平的30%，因此，至今尚未考虑作为a-Gal A取代疗法的候选疗法。
[0059]本发明人现在已经出人意料地发现，虽然非典型性心变异型或非典型性肾变异型患者的a -半乳糖苷酶A酶活性水平可能比典型性Fabry病表型患者高，但是这些患者也可以受益于a-半乳糖苷酶A酶疗法。例如，患者可以具有在细胞中产生动力学不稳定的a-Gal A酶的突变，而且对这些患者施用本发明的a-Gal A制剂显著提高了 a-Gal A酶水平。同样，据报导，一些非典型性心变异型表型患者的a-半乳糖苷酶A第215位氨基酸具有点突变。而未突变蛋白质中的该氨基酸是糖基化的天冬酰胺(Eng等人，美国人类遗传学杂志(Am.J.Hum.Genet.) 53:1186 — 1197,1993)。由此，使用本发明的适当糖基化的a -半乳糖苷酶A制剂的a -Gal A酶取代疗法在这些患者中可能是有效的。此外，已有报导，发现了唯一的Fabry病临床表现是微弱的蛋白尿的非典型性肾突变型患者。然而，肾活组织检查发现了 Fabry病的典型性糖脂内含物，而a-Gal A酶实验发现其酶水平低于正常a-Gal A水平。然而，因为在这些患者的尿沉淀物中的脱落肾小管细胞中可以检测到肾中贮积的酰基鞘氨醇己三糖苷，所以施用本发明的a-Gal A制剂可以实质性的降低这些水平。通过与甘露糖-6-磷酸(M6P)受体的相互作用可以将溶酶体酶(诸如a-Gal A)靶向细胞的溶酶体腔，M6P受体结合定位于溶酶体腔的酶的寡糖部分中存在的M6P残基(Kornfeld和Mellman，细胞生物学年鉴(Ann.Rev.Cell Biol.)5:483 — 525，1989)。初级相互作用发生于高尔基体中，结合高尔基体M6P受体的酶被分离并转运至溶酶体。可以相信第二种相互作用发生于细胞外a-Gal A与位于细胞表面的M6P受体之间。不在常规系统中的酶是经组成性分泌途径被细胞分泌的，而且常常被细胞表面M6P受体再次捕获，通过内吞途径使a-半乳糖苷酶A返回溶酶体。经内在化的细胞外物质在内吞小泡中转运穿过细胞质，内吞小泡与初级溶酶体融合，并将其内容物全部输入溶酶体中。在此过程中，细胞表面M6P受体也掺入到内吞小泡中并转运至溶酶体中。具体地说，高水平唾液酸化和/或磷酸化的本发明a-Gal A制剂在治疗Fabry病非典型性变异型患者时特别优选。这样的制剂例如能够使从肝细胞清除的注射入a-Gal A部分最小化，并使得非肝细胞能够摄取高水平的a -Gal A,诸如肾细胞、血管细胞、肾小管细胞、肾小球细胞、心肌细胞、和心血管细胞。
[0060]携带M6P残基的细胞外a -Gal A可以结合细胞表面M6P受体，并转运进入溶酶体腔。一旦进入溶酶体腔，a-Gal A就可以发挥适当功能。正是溶酶体酶转运使得a -半乳糖苷酶A酶取代疗法成为治疗Fabry病患者的可行方法。由此，甚至当细胞有a-Gal A生成遗传缺陷时，如果a-Gal A是适当糖基化的，且缺陷细胞携带M6P受体，那么细胞仍可以摄取细胞外a-Gal A。在Fabry病患者中，肾和心的血管内皮细胞严重地组织病理学异常，且造成该疾病的临床病理。携带M6P受体的这些细胞是a-Gal A的特殊治疗靶。本发明的一个目的是提供M6P存在于N-连接寡糖中的a-Gal A制剂。
[0061]a -Gal A的N-连接寡糖的唾液酸化修饰程度对a -Gal A药物动力学和生物学分布具有实质性影响。当没有适当的唾液酸化时，由于结合肝唾液酸化蛋白质受体(Ashwell受体)a -Gal A在肝细胞内在化并降解后,经循环系统快速清除(Ashwell和Harford,生化年鉴(Ann.Rev.Biochem.)51:531 — 554，1982)。这降低了循环系统中可获得的、结合诸如肾和心的血管内皮细胞上的M6P受体的a-Gal A的量，造成了 Fabry病的临床病理。经遗传修饰的人细胞分泌的a -Gal A具有适于治疗Fabry病的糖基化特性，可以通过纯化的分泌型蛋白质的传统制药学方法施用，抑或通过基因治疗而不需要额外酶修饰。据已有的报导，溶酶体酶葡糖脑苷脂酶需要这种修饰，其中临床相关细胞摄取纯化的葡糖脑苷脂酶需要在从人胎盘纯化之后对酶进行复杂的修饰(Beutler,新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)325:1354 - 1360,1991)。
[0062]适用于a-Gal A生产的细胞
[0063]怀疑患有a -Gal A缺陷(诸如Fabry病)的个体可以用从培养的、经遗传修饰的细胞(优选地人细胞)获得的纯化·的人a -Gal A进行治疗。
[0064]在以治疗Fabry病为目的而对细胞进行遗传修饰时，细胞可以通过传统的遗传工程方法或通过基因激活方法来修饰。
[0065]按照传统方法，含有a -Gal A cDNA或基因座DNA序列的DNA分子，可以包含在表达载体构建体中，并通过标准方法转化到初生、次生、或永生细胞中，标准方法包括(但不限于)脂质体、聚凝胺、或DEAE葡聚糖介导的转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、微注射、或速度驱动的微弹(“biolistics”)(参阅，如同样悬而未决的USSN 08/334，797，此处引入作为参考)。技术人员或者可以使用通过病毒载体投递遗传信息的系统。已知可用于基因转移的病毒包括腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、Sindbis(辛德毕斯)病毒、和牛痘病毒(诸如金丝雀痘病毒)。
[0066]或者，利用基因激活(“GA”)方法修饰细胞，诸如美国专利5，733，761和5，750，376所述，引入本文中作为参考。本文将基因激活产生的a-GalA称为GA-GAL。
[0067]因此，如本文所用，对于细胞，术语“遗传修饰”包括导入编码基因产物的DNA分子和/或控制基因产物编码序列表达的调控元件后表达特定基因产物的细胞。可以通过基因靶向或同源重组导入DNA分子，即在特定基因座位点导入DNA分子。同源重组可以用于取代缺陷基因自身。在Fabry病患者自身细胞中，可以用完整基因或其一部分取代缺陷型a-Gal A基因或其一部分。
[0068]如本文中所用，术语“初生细胞”包括从脊椎动物组织分离的细胞悬浮液中存在的细胞(在铺板即吸附组织培养基质之前，诸如培养皿或培养瓶)，从组织得到的外植体中存在的细胞，第一次铺板的上述细胞种类，和从这些铺板细胞得到的细胞悬浮液。
[0069]“次生细胞”指处于所有培养开始后步骤中的细胞。换言之，第一次由培养基质上取下铺板的初生细胞并再次铺板(传代)，将之称为次生细胞，正如随后传代中的所有细胞。[0070]“细胞株”包括已经传代一次或多次；在培养中展示有限次数的平均群体倍增；展示接触抑制、依赖贴壁的生长特性(除了在悬浮培养中繁殖的细胞)；且不是永生的次生细胞。
[0071]“永生细胞”指源自培养中表观上寿命不受限制的已建立细胞系的细胞。
[0072]初生或次生细胞的例子包括成纤维细胞、上皮细胞(包括乳房和肠上皮细胞)、内皮细胞、血液的组成元素(包括淋巴细胞和骨髓细胞)、胶质细胞、肝细胞、角质细胞、肌细胞、神经细胞、或这些细胞类型的前体。用于本方法的永生人细胞系的例子包括(但不限于)Bowes黑素瘤细胞(ATCC登记号CRL 9607)、Daudi细胞(ATCC登记号CCL 213)、HeLa细胞及其衍生物(ATCC登记号CCL2、CCL2.1、和CCL2.2)、HL-60细胞(ATCC登记号CCL240)、HT-1080 细胞(ATCC 登记号 CCL121)、Jurkat 细胞(ATCC 登记号 TIB152)、KB 癌细胞(ATCC登记号CCL17)、K-562白血病细胞(ATCC登记号CCL243)、MCF-7乳癌细胞(ATCC登记号BTH22)、M0LT-4 细胞(ATCC 登记号 1582)、Namalwa 细胞(ATCC 登记号 CRL1432)、Raji 细胞(ATCC 登记号 CCL86)、RPMI8226 细胞(ATCC 登记号 CCL155)、U-937 细胞(ATCC 登记号CRL1593)、W1-38VA13 亚系 2R4 细胞(ATCC 登记号 CLL75.1)、CCRF-CEM 细胞(ATCC 登记号CCL119)、和 2780AD 卵巢癌细胞(Van der Blick 等人，癌症研究(Cancer Res.)48:5927 —5932，1988)，以及通过人细胞与其它物种细胞的融合产生的异种杂交瘤细胞。
[0073]在对人细胞进行遗传修饰产生分泌a -Gal A的细胞后，可以产生基本上由遗传性状相同的已培养的初生永生人细胞集合组成的无性繁殖细胞株，即一个基本上由遗传性状相同的永生人细胞集合组成的无性繁殖细胞系。有一个实施方案中，无性繁殖细胞株或无性繁殖细胞系的细胞是成纤维细胞。另一个优选的实施方案中，细胞是次生人成纤维细胞，如BRS-1l细胞。
[0074]在经遗传修饰后，培养细胞培养条件允许分泌a-Gal A。从培养细胞分离蛋白质步骤如下:收集使细胞生长的培养基和/或裂解细胞以释放其内容物，然后应用蛋白质纯化技术，得到蛋白质。
[0075]从稳定转染的细胞的已调节好的培养基纯化a-Gal A
[0076]按照本发明的方法，从培养细胞(“ a -Gal A生产细胞”)分离a -GalA蛋白质步骤如下:收集生长细胞的培养基和/或裂解细胞以释放其内容物，然后应用不使用植物凝血素亲和层析的蛋白质纯化技术纯化蛋白质。优选的纯化过程在下文实施例2中有概述。
[0077]备选的疏水相互作用树脂，诸如Source Iso (Pharmacia)、
MaCIO-PTep?MethyI Support (Bio-Rad)、TSK Butyl (Tosohaas)、或
Phenyl Sepharose? (Pharmacia)，也可以用于纯化a-Gal A。层析柱可以用浓度相对较高的盐(如IM硫酸铵或2M NaCl，于pH5.6的缓冲液中)平衡。待纯化的样品是通过调至平衡缓冲液的PH和盐浓度制备的。将样品加至层析柱，并用平衡缓冲液清洗层析柱以除去未结合物质。a-Gal A是用离子强度较低的缓冲液、水、或溶于水的有机溶剂(如20%乙醇或50%丙二醇)从层析柱中洗脱得到的。或者，使用盐浓度较低的平衡缓冲液和样品或使用不同pH，让a-Gal A流过层析柱。其它蛋白质可能与层析柱结合，使含a-Gal A的样品不与层析柱结合，获得纯化。第一步纯化步骤优选使用羟基磷灰石层析柱。
[0078]备选的纯化过程可以使用阳离子交换树脂，如SP Sepharose? 6Fast Flow
(Pharmacia)、 Source 30S (Pharmacia)、 CM Sepharose?Fast Flow (Pharmacia)、MacrO-Prep?CM Support (Bio-Rad)、或 MacrO-Prep?High S Support (Bio-Rad),
来纯化a-Gal A。“第一步层析步骤”是第一次将样品加于层析柱(不包括与样品制备有关的所有步骤)。a-Gal A能够结合pH4.4的层析柱。诸如IOmM醋酸钠(pH4.4)、IOmM柠檬酸钠(pH4.4)、或在大约pH4.4具有适当缓冲能力的其它缓冲液可以用来平衡层析柱。将待纯化样品的PH和离子强度调至与平衡缓冲液一样。将样品加于层析柱，并在加样后清洗层析柱以除去未结合物质。诸如NaCl或KCl等盐可以用于从层析柱洗脱a-Gal A。或者，可以用更高PH或更高盐浓度更高pH的缓冲液从层析柱洗脱a-Gal A。a-Gal A也可以通过在加样过程中增加平衡缓冲液和样品中的盐浓度，通过在较高pH进行层析，或者通过高盐高pH组合,使流经层析柱。
[0079]纯化的另一步可以使用Q SepharoSe?6 Fast Flow来纯化a -Gal A。Q Sephar0se?6 Fast Flow是相对较强的阴离子交换树脂。较弱的阴离子交换树脂，诸如 DEAE SepharOSe?FaSt Flow (Pharmacia)或 Macro-Prep?DBAB (Bio-Rad)，也可
以用于纯化a-Gal A。层析柱是用如IOmM磷酸钠(pH6)等缓冲液平衡的。将样品的pH调至PH6，并通过稀释或渗滤样品达到低离子强度。将样品加到能够结合a -GalA的条件下的柱上，用平衡缓冲液清洗层析柱以除去未结合物质。用如NaCl或KCl等盐或者用较低pH缓冲液或者高盐低pH组合洗脱a-Gal A。通过在加样过程中增高加载物的盐浓度，在较低PH进行层析，或者在高盐低pH组合中层析，也可以让a-Gal A流经层析柱。
[0080]另一纯化步骤使用Superdex?2 00 (Pharmacia)大小排阻层析纯化a-Gal A。
其它大小排阻层析树脂，诸如Sephacryl?S-200 IiR或Bio-Ge 1?A-1.5cm,也可用于
纯化a-Gal A。大小排阻层析的优选缓冲液是含0.05M NaCl的25mM磷酸钠(pH6.0)。其它与配方兼容的缓冲液也可以利用，如IOmM柠檬酸钠或柠檬酸钾。缓冲液的pH可以在pH5与PH7之间，而且应当含有盐，如NaCl或NaCl与KCl的混和物。
[0081]还有一个纯化方法使用层析聚焦树脂纯化a-Gal A,诸如Polybuffer ExchangerPBE94 (Pharmacia)。在较高pH (如pH7.0或以上)平衡层析柱，将待纯化样品的pH调至相同pH,并将样品加于层析柱上。蛋白质是用pH已调至4的Polybuffer74 (Pharmacia)等缓冲液系统，洗脱带有逐渐降低至诸如4的pH的pH梯度。
[0082]或者可以利用免疫亲和层析纯化a-Gal A。可以将针对a-Gal A的适当的多克隆或单克隆抗体(使用标准技术，使用a-Gal A或由a-Gal A序列衍生的肽进行免疫而产生)固定在激活偶联的树脂上，如NHS激活的Sepharose?4 Fast Flow (Pharmacia)或CNBr激活的Sephar0se?4 Fast Flow (Pharmacia)。将待纯化样品加于pH约为6
或7的固定了抗体的层析柱上。清洗层析柱以除去未结合物质。用亲和层析采用的典型试剂诸如低PH (如pH3)、变性剂(如胍-HCl或硫氰酸盐)、或有机溶剂(如溶于pH6的缓冲液的50%丙二醇)从层析柱洗脱a-Gal A。纯化过程还可以使用金属螯和物亲和树脂如Chelating SepharOSe?FaSt Flow (Pharmacia)来纯化 a-Gal A。预先用金属离子如
Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、或Cd2+使层析柱带电荷。将待纯化样品加于pH适当的(如pH6 -7.5)的层析柱，并清洗层析柱以除去未结合的蛋白质。利用咪唑或组氨酸的竞争性洗脱，或利用柠檬酸钠或柠檬酸钾将PH降低至6以下，或者利用诸如EDTA或EGTA等螯合剂，洗脱结合的蛋白质。
[0083]按照上述方案，本发明提供了比以前技术制备的含更高纯度的a-Gal A的制剂，如由SDS-PAGE或反相HPLC测量的纯度至少98 %同质性，更优选地至少99%同质性，最优选地至少99.5%同质性。本发明的a-GalA制剂可以含有多种a-Gal A糖形式。因此，如本文中a-Gal A制剂章节所用，术语“同质性”指基本上不含(〈2%总蛋白质)a-Gal A以外的蛋白质的制剂。非a-Gal A蛋白质的例子诸如清蛋白、由宿主细胞产生的非a-Gal A蛋白质、和由动物组织或流体分离的非a-Gal A蛋白质。本发明a-Gal A制剂的比活性优选地至少2.0xlO6单位/mg蛋白质,更优选地至少3.0xlO6,最优选地至少3.5xl06单位/mg蛋白质。
[0084]通过聚糖改造增加寡糖电荷增长a -Gal A制剂的循环半衰期
[0085]本发明提供了提高肝和巨噬细胞以外的特定组织摄取治疗性酶的糖蛋白修饰程序。使用本发明的方法，得到了人糖基化a-Gal A制剂，其中35 — 85%的寡糖带电荷，优选地至少50%的寡糖带电 荷。
[0086]蛋白质N-糖基化通过修饰寡糖结构的适当天冬酰胺残基起作用，影响其特性和生物学活性(Kukuruzinska 和 Lennon, 口生物学和医学评论(Crit.Rev.0ral.Biol.Med.)9:415 — 448，1998)。本发明提供了分离的a-Gal A制剂，其中主要是通过在复合聚糖上添加I 一 4个唾液酸残基，在高甘露糖聚糖上添加I 一 2个磷酸部分，或者在杂合聚糖上添加I个磷酸和I个唾液酸使高百分率的寡糖带负电荷。还存在较少数量的硫酸化复合聚糖。高比率的带电荷结构具有两个主要功能。第一，通过2，3-或2，6-连接的唾液酸掩盖倒数第二个半乳糖残基，由此防止通过肝细胞上的唾液酸糖蛋白受体从循环中过早清除。该受体识别含末端半乳糖残基的糖蛋白。增长a-Gal A循环半衰期让重要靶器官(诸如心和肾)有机会在酶输液后从血浆中内吞更大数量的酶。第二，高甘露糖或杂合聚糖上存在Man-6-磷酸提供不依赖阳离子的Man_6磷酸受体(C1-MPR) —个受体介导的摄取机会。这种受体介导的摄取发生于许多细胞的表面，包括血管内皮细胞，这是CTH在Fabry患者中的主要储存位点。含两个M6P残基的酶分子与C1-MPR的亲和力大大高于含一个M6P残基的酶分子。表1提供了有代表性的聚糖结构。
[0087]表1.有代表性的聚糖结构
[0088]
【权利要求】
1.含人a-Gal A制剂的组合物，如SDS-PAGE或反相HPLC测量，纯化至至少99.5%同质性，其中所述制剂包含多种a-Gal A糖形式且具有至少3.0xlO6单位/mg蛋白质的比活性，而且其中所述制剂基本上不含植物凝血素。
2.权利要求1的组合物，其中所述a-GalA糖形式的寡糖至少35%带电荷。
3.权利要求1的组合物，如Z数目测量的，其中所述a-GalA糖形式的寡糖电荷超过150。
4.权利要求1的组合物,其中所述a-GalA糖形式的总聚糖至少60%唾液酸化。
5.权利要求4的组合物，其中所述制剂的循环半衰期延长。
6.用于生产含多种a-GalA糖形式的纯化a-Gal A制剂的方法，所述方法包括下列步骤:a)在平衡缓冲液中于酸性pH使所述a-GalA糖形式结合阳离子交换树脂，b)用所述平衡缓冲液清洗所述树脂以洗脱未结合的物质，并c)使用选自下组的洗脱溶液洗脱所述a-Gal A糖形式:10 — IOOmM的盐溶液、pH4 —5的缓冲液、及其组合，其中所述a-Gal A制剂纯化至至少99.5%同质性，且其中所述制剂基本上不含植物凝血素。
7.权利要求6的方法，还包 括选自下组的纯化步骤:层析聚焦层析法、金属螯合物亲和层析法、和免疫亲和层析法。
8.含多种a-GalA糖形式的a-Gal A制剂，纯化至至少99.5%同质性，由权利要求6的方法生产。
9.用于生产寡糖电荷增加的糖基化a-GalA制剂的方法，所述方法包括下列步骤:a)将编码GlcNac转移酶III(GnT-1II)的多核苷酸导入a-Gal A生产细胞，或者通过同源重组导入调控序列以调控内源GnT-1II基因的表达；b)在能够表达a-Gal A和GnT-1II的培养条件下培养所述a -Gal A生产细胞；并c)分离a-GalA，其中所述a-Gal A制剂的寡糖电荷比不含所述多核苷酸的细胞产生的a-Gal A多。
10.权利要求9的方法，其中所述a-GalA制剂的寡糖至少35%带电荷。
11.权利要求9的方法，其中所述a-GalA制剂包含多种糖形式，所述糖形式的复合聚糖至少20%含2 — 4个唾液酸残基。
12.权利要求9的方法，如Z数目测量的，其中所述a-GalA制剂的寡糖电荷超过150。
13.权利要求9的方法，其中所述制剂包含多种糖形式，所述糖形式平均至少25-50%磷酸化。
14.寡糖电荷增加、由权利要求9一 13任一项的方法生产的糖基化a-Gal A制剂。
15.用于生产寡糖电荷增加的糖基化a-GalA制剂的方法，所述方法包括下列步骤:a)将编码唾液酰基转移酶的多核苷酸导入a-GalA生产细胞，或者通过同源重组导入调控序列以调控内源唾液酰基转移酶的表达；b)在能够表达a-GalA和唾液酰基转移酶的培养条件下培养所述a-Gal A生产细胞；并c)分离a-GalA，其中所述a-Gal A制剂的寡糖电荷比不含所述多核苷酸的细胞产生的a -Gal A多。
16.权利要求15的方法，还包括下列步骤:d)通过分离或纯化步骤(C)的制剂来选择大小或电荷增加的a-Gal A糖形式。
17.寡糖电荷增加、由权利要求15或16的方法生产的糖基化a-Gal A制剂。
18.用于生产唾液酸化增加的糖基化a-GalA制剂的方法，所述方法包括使a-Gal A生产细胞接触铵浓度低于IOmM的培养基的步骤。
19.权利要求18的方法，其中接触步骤包括用新鲜培养基连续或间歇灌注所述a-GalA生产细胞以维持铵浓度低于10mM。
20.用于生产磷酸化增加的糖基化a-GalA制剂的方法，所述方法包括下列步骤:a)将表达后编码磷酸转移酶的多核苷酸导入a-GalA生产细胞，或者通过同源重组导入调控序列以调控内源磷酸转移酶的表达；b)在导致a-GalA和磷酸转移酶表达的培养条件下培养所述a-Gal A生产细胞；并c)分离a-GalA，其中所述a-Gal A制剂的磷酸化比不含所述多核苷酸的细胞产生的 ct -Gal A 多。
21.磷酸化增加、由权利要求20的方法生产的糖基化a-GalA制剂。
22.生产寡糖链上唾液 酸和末端半乳糖残基数目减少的糖基化a-GalA的方法，所述方法包括下列步骤: a)将a-GalA接触神经氨酸苷酶(唾液酸酶)以除去唾液酸残基，并使末端半乳糖部分暴露；并b)将步骤(a)的脱唾液酸a-GalA接触P -半乳糖苷酶以除去末端半乳糖残基，其中步骤(b)的脱唾液酸，脱半乳糖a-Gal A产物寡糖链上的末端唾液酸或半乳糖残基数目比来自未接触a-Gal A的a-Gal A减少。
23.用于生产寡糖链上末端半乳糖残基数目减少的糖基化a-GalA的方法，所述方法包括将a-Gal A接触(6-半乳糖苷酶以除去末端半乳糖残基的步骤，其中产物寡糖链上的末端半乳糖残基数目比未接触a-Gal A的a-Gal A减少。
24.由权利要求23的方法生产的脱半乳糖a-GalA制剂。
25.a-Gal A制剂在制药中的用途，药剂用于一周一次或两周一次每kg受治疗者体重施用0.05 - 5.0mg剂量的所述a -Gal A制剂。
26.权利要求25的用途，其中所述药剂用于一周一次或两周一次每kg受治疗者体重施用大约0.2mg剂量的所述a -Gal A制剂。
27.权利要求25或26的用途，其中所述剂量配制用于肌肉内、口、直肠、皮下、动脉内、腹膜内、大脑内、鼻内、鞘内、穿粘膜、穿真皮、或经吸入施用。
28.a-Gal A制剂在制药中的用途，药剂用于一周一次或两周一次皮下每kg受治疗者体重施用0.01 -1Omg剂量的所述a -Gal A制剂。
29.权利要求27或28的用途，其中所述剂量配制用于使用选自下组的投递系统的施用:泵投递、包囊细胞投递、脂质体投递、针头投递注射、无针头注射、喷雾器、气雾器、电穿孔、和透皮贴。
30.a-Gal A制剂在制药中的用途,药剂用于治疗Fabry病,其中所述药剂用于一周一次或两周一次每kg受治疗者体重施用0.01 — IOmg剂量的所述a -Gal A制剂。
31.权利要求30的用途，其中所述药剂配制用于皮下施用。
32.a-Gal A制剂在制药中的用途，药剂用于治疗非典型性变异型Fabry病，其中所述药剂用于一周一次或两周一次每kg受治疗者体重施用0.05 — 5.0mg剂量的所述a -Gal A制剂。
33.权利要求32的用途，其中所述患者患有心血管异常。
34.权利要求3 3的用途，其中所述心血管异常是左心室肥大(LVH)。
【文档编号】C12N15/56GK103585621SQ201310243356
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2000年3月9日 优先权日:1999年3月11日
【发明者】R·F·赛尔顿, M·布罗斯克, C·M·克诺施塔, D·A·瑞寇, M·D·维拉姆斯, T·J·舒特兹, P·F·达尼尔 申请人:夏尔人类遗传性治疗公司