防治苹果果实轮纹病的生防菌娄彻氏链霉菌a-1及其生防制剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种防治苹果果实轮纹病的生防菌娄彻氏链霉菌（Streptomyces?rochei）A‐1，于2012年1月12日保藏于：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号：CCTCC?NO:M2012008，经检验存活。利用上述的娄彻氏链霉菌（Streptomyces?rochei）A‐1所制备的用于防治苹果果实轮纹病的生防制剂。本发明有益效果：本发明所提供的生防制剂活性成分娄彻氏链霉菌（Streptomyces?rochei）A‐1具有防治效果稳定，对环境友好等特点，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。本发明生防制剂在果树病害的生物防治中具有持续有效、防治效果好、无污染、对人畜安全、无残留、特异性强等优点，且有利于保护环境、保持生态平衡。
【专利说明】防治苹果果实轮纹病的生防菌娄彻氏链霉菌A-1及其生防
制剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物病害生物防治【技术领域】，特别涉及一种防治苹果果实轮纹病的生防菌娄彻氏链霉菌A -1及其生防制剂。
【背景技术】
[0002]苹果是世界上食用最广泛的的水果品种，同时也是我国的重要经济作物和出口水果。中国苹果产业在出口创汇、农业产业结构调整和增加农民收入等方面发挥了重要的战略作用。我国的苹果栽培面积和产量均居世界首位，然而，苹果出口率不足总产量的3%，在国际上的市场占有率与我国苹果生产大国的地位极不相称，影响我国苹果产业发展的一个重要因素就是储藏期病害。我国苹果因储藏期病害每年损失10%~15%，降低5%可以减少27亿元人民币损失(农博网--国家苹果产业技术体系，2009)，储藏期病害还影响苹果的长期储藏和远距离运输。
[0003]由葡萄座腔菌Botryosphaeria berengeriana引起的苹果果实轮纹病是目前危害最大的果实病害之一，该病菌在7月份侵入果实，在树上生长期间和储藏、运输过程中均会造成烂果，一般年份烂果率为20%~40%，大发生年份烂果率达60%以上。目前，化学药剂处理是控制苹果采后轮纹病 的主要措施，化学药剂的使用严重危害人类健康，污染生态环境，而且易引起病原菌的抗药性，因此迫切需要寻找一种高效且无公害的防治方法，以有效微生物取代化学杀菌剂用于采后果蔬病害的防治已显示出巨大的应用前景。
【发明内容】
[0004]本发明针对目前农业生产中苹果储藏期主要病害果实轮纹病防治难度大，成本高，化学农药抗性日益突出，农药残留高等问题，筛选出一株高效生防菌株并制备生防制剂，对苹果果实轮纹病进行有效防治。
[0005]本发明提供的技术方案是:
[0006]一种防治苹果果实轮纹病的生防菌娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei) A -1,于2012年I月12日保藏于:中国典型培养物保藏中心，地址:中国.武汉.武汉大学，保藏号:CCTCC N0:M2012008，经检验存活。
[0007]利用上述的娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)A-1所制备的用于防治苹果果实轮纹病的生防制剂。
[0008]本发明有益效果:
[0009]本发明娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)A-1对苹果果实轮纹病有显著的防治效果，实施例的研究表明，本发明的生防菌株可显著抑制苹果轮纹病菌菌丝的生长，且娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)A -1菌株的抑菌谱较广，除苹果轮纹病菌外,还对苹果树腐烂病菌、桃褐腐病菌及苹果干腐病菌等多种果树病原真菌具有显著的拮抗作用。苹果果实接种实验表明，娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)A -1的菌饼、发酵液和菌悬液对果实轮纹病的防治效果均在95%以上，与化学药剂10%苯醚甲环唑Difenoconazole (世高)可湿性粉剂防效相当。
[0010]本发明所提供的生防制剂活性成分娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)A -1具有防治效果稳定，对环境友好等特点，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。
[0011]本发明生防制剂在果树病害的生物防治中具有持续有效、防治效果好、无污染、对人畜安全、无残留、特异性强等优点，且有利于保护环境、保持生态平衡。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1.娄彻氏链霉菌A -1对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制作用；
[0013]图中A为对峙培养7d的抑制情况；B为对峙培养I个月的抑制情况，左侧培养皿为仅接种轮纹病菌的对照；
[0014]图2.娄彻氏链霉菌A -1的菌落形态图；
[0015]图中A为菌株A-1菌落正面；B为菌株A-1菌落背面；
[0016]图3.娄彻氏链霉菌A -1的孢子(丝)及菌丝形态图；
[0017]C为菌株A -1的孢子丝及孢子；D为菌株A -1的菌丝；
[0018]图4.娄彻氏链霉菌A - 116S rDNA基因PCR扩增示意图；
[0019]图中M为核酸Marker DL2000 ;1- 2分别为菌株A -1基因组DNA稀释100和50
倍的扩增结果；`
[0020]图5.娄彻氏链霉菌A -1对苹果轮纹病菌菌丝形态的影响；
[0021]图中A和D为苹果轮纹病菌的正常菌丝，D为A的局部放大；B和C为苹果轮纹病菌与A -1对峙培养5d后的菌丝形态，C为B的局部放大；E和F为苹果轮纹病菌与A -1对峙培养3周后的菌丝形态，F为E的局部放大；
[0022]图6.娄彻氏链霉菌A -1对活体果实上苹果轮纹病菌菌丝形态的影响；
[0023]图中A为苹果轮纹病菌的正常菌丝；B为苹果轮纹病菌和A-1接种果实3d后的菌丝形态；C为苹果轮纹病菌和A -1接种果实7d后的菌丝形态；
[0024]图7.娄彻氏链霉菌A -1菌饼对苹果轮纹病的防治效果；
[0025]图中左侧为接种PDA培养基再接种轮纹病菌的对照；图中右侧为A -1菌饼对轮纹病的防效。
[0026]图8娄彻氏链霉菌A -1发酵滤液和菌悬液对苹果轮纹病的防治效果；
[0027]图中，左侧为接种发酵培养基再接种轮纹病菌的对照，中间为A -1发酵滤液对轮纹病的防效，右侧为A -1菌悬液对轮纹病的防效。
【具体实施方式】
[0028]以下实施例仅用于对本发明做进一步的描述，并不是用来限制本发明的范围。
[0029]实施例1
[0030]菌株的筛选、分离
[0031]从山东省莱阳市商品苹果园中感染苹果轮纹病菌的发病富士苹果上，采用组织分离法，利用高氏一号培养基(可溶性淀粉20g, KNO3L 0g, K2HPO40.5g，MgSO4.7Η200.5g，FeSO4.7Η200.01g，琼脂15 - 20g，蒸馏水1000mL, ρΗ7.2-7.4)分离获得11株放线菌，从中筛选获得一株对苹果轮纹病菌具有显著拮抗效果的菌株，命名为A - 1，通过平板对峙培养法对A -1菌株的拮抗活性进行初步测定，结果如图1所示，表明:A -1菌株在生长过程中对苹果轮纹病菌表现出了显著的抑制作用，具有明显的营养竞争和持续分泌抗生物质产生拮抗作用的能力。
[0032]上述平板对峙培养法所用的培养基为PDA培养基，其组分及配方如下:马铃薯削皮后称取200g，切成小块在水中煮沸15~20min，四层纱布过滤后加入葡萄糖20g，琼脂粉15g,定容至1000mL, pH值天然,在121°C高压蒸汽灭菌20min。
[0033]实施例2
[0034]生防菌A -1菌株的鉴定
[0035](1)形态特征:A -1菌株在高氏一号培养基上培养7 - 14d后，菌落致密，表面及边缘光滑平坦，呈灰黄色，如图2所示。显微镜下可清晰地观察到A-1的菌丝和孢子(丝)，A-1菌丝无横隔、不断裂、多分枝，如图3中D所示，气生菌丝形成孢子链，孢子丝呈波曲形，孢子椭圆形，表面光滑，如图3中C所不。
[0036](2)生理生化特性:采用《链霉菌鉴定手册》和《放线菌分类学》所推荐的培养基及试验方法进行，菌株A -1能分解纤维素、能使明胶液化、淀粉水解、能使牛奶凝固，但不能产生硫化氢和利用酪氨酸产生黑色素；能较好的利用葡萄糖、果糖、鼠李糖、甘露糖、乳糖等碳源，不能利用蔗糖和山梨醇。
[0037]A-1菌株的保存方法按周德庆主编，《微生物学实验技术手册》，上海科学技术出版社，1986版介绍的方案进行操作。
[0038](3)16S rDNA序列分析:采用CTAB法提取放线菌基因组DNA，采用通用引物PrimerF:5，- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3，，Primer R:5，- AAGGAGGTGATCCAGCCGCA - 3，对 DNA 模板进行PCR扩增；PCR扩增反应体系(25 μ L):2.5 μ LlO X Taq酶缓冲液，0.2 μ mo I/L引物，2 μ L200mmol/L dNTPs, 20ng DNA 模板，IUTaq 酶(TaKaRa)，17 μ L ddH20。PCR 扩增程序:94°C预变性5min，94°C变性lmin，56°C复性lmin，72°C延伸2min，进行30个循环，72°C延伸5min。扩增产物(8 μ L)经1.2%的琼脂糖电泳进行检测。PCR扩增结果如图4所示。
[0039]PCR扩增产物经切胶回收后，直接送交上海生物工程有限公司进行序列测定。测定序列的分析结果表明16S rDNA扩增片段长度为1518bp，其序列如序列表SEQ ID NO:1所示。将所得序列采用NCBI数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)中的BLAST软件与GenBank中的核酸序列进行比对,与娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei) NRRL B-1559菌株(Accession No:EF626598.1)的相应序列同源性为100%。
[0040]结合以上3点，形态学特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析，将菌株A -1鉴定为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)。
[0041]实施例3
[0042]娄彻氏链霉菌A -1对多种果树病原真菌的抑制作用
[0043]娄彻氏链霉菌A -1对苹果炭疽病菌、核桃炭疽病菌、苹果干腐病菌、桃褐腐病菌、苹果腐烂病菌、梨干腐病菌、苹果枝枯病菌等主要果树病原真菌具有显著的抑制作用，表现出良好的广谱抗菌特性，结果见表1。
[0044]表1娄彻氏链霉菌A -1对果树主要病原真菌的抑制作用
[0045]
【权利要求】
1.一种防治苹果果实轮纹病的生防菌娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)A_l,于2012年I月12日保藏于:中国典型培养物保藏中心，保藏号=CCTCC N0:M2012008。
2.—种利用权利要求1所述的娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)A-1制备的生防菌剂。
3.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于用于防治苹果果实轮纹病。
4.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于所述生防菌剂的制备方法如下: 1)培养基的制备: 高氏一号培养基:可溶性淀粉 20g, KNO3L Og, K2HPO40.5g，MgSO4.7Η200.5g，FeSO4.7Η200.01g，琼脂 15 - 20g，蒸馏水 1000mL, ρΗ7.2 - 7.4，121 °C高压蒸汽灭菌 .20min ； 发酵培养基:黄豆饼粉10.0g，葡萄糖10.0g, NaCl2.5g，CaC032.0g，蛋白胨3.0g，蒸馏水lOOOmL，pH值调节为7.0-7.2，分装于250mL三角瓶中，装液量为80mL，121°C高压蒸汽灭菌20min ； 2)娄彻氏链霉菌株的活化:将菌株按无菌操作要求划线接种于高氏一号培养基中，.28 °C恒温培养5 - 7d ； 3)娄彻氏链霉菌菌株的液体培养:挑取步骤2)中活化的菌株，接种于所述的发酵培养基中，28°C、180r/min 振荡培养72h，得到发酵种子液。将所述种子液按10%的接种量接种到所述的发酵培养基中，28°C、180r/min，继续振荡培养72h，获得浓度为106cfu/mL的娄彻氏链霉菌菌株细胞培养液； 4)娄彻氏链霉菌生防制剂的制备:将步骤2)中活化的菌株打取直径6_的菌饼；将步骤3)中制备的细胞培养液，在4°C条件下，12000r/min离心lOmin，收集上清液经0.22 μ m微孔滤膜过滤，上清液即为无菌发酵滤液；沉淀用无菌水重新悬浮，得到106cfu/mL的菌悬液； 5)步骤4)中所述的菌饼、发酵滤液和菌悬液均为生防制剂。
【文档编号】C12N1/20GK103789222SQ201310289746
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年7月11日 优先权日:2013年7月11日
【发明者】王彩霞, 李桂舫, 李保华, 张清明, 董向丽 申请人:青岛农业大学