水稻双t-dna转基因非连锁整合的分子标记检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种水稻双T-DNA转基因非连锁整合的分子标记检测方法。通过本发明的方法，转基因T0代即可鉴定出目标基因与选择标记基因是否连锁整合，淘汰连锁整合的转基因克隆，从而极大地提高无选择标记基因水稻的培育效率。
【专利说明】水稻双T-DNA转基因非连锁整合的分子标记检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种水稻双T-DNA转基因非连锁整合的分子标记检测方法。
【背景技术】
[0002]在大力发展农业基因工程时，转基因植物的安全性问题己日益引起人们的重视。要对选择标记基因及其产物进行安全性评价，将耗费大量物力、财力及时间，影响转基因植物投入市场。因此，转基因植物中如何去除选择标记基因成为基因工程急切需要解决的问题。对于这个问题，目前广泛采用的方式是转化时仍使用选择标记基因，转基因植株再生成功后，在其释放大田前将选择标记基因剔除。去除选择标记基因的策略，常见的主要有四种:一是基于农杆菌介导的共转化系统，二是位点特异性重组系统，三是利用转座子成分使外源基因在基因组间重新定位，四是MAT载体系统。
[0003]通过农杆菌介导的共转化系统去除选择标记基因的其中一种策略是双T-DNA转基因。这种策略是构建双T-DNA植物表达载体，选择标记基因和目标基因分别位于两个独立的T-DNA结构域内，通过农杆菌介导的转基因方法将标记基因和目标基因共整合入植物细胞中，当两个基因被整合到足够多的非连锁位点时，在下一代中通过有性繁殖过程目的基因和选择标记基因可得到分离，从而获得无选择标记的转基因植株。
[0004]中国科学院遗传与发育生物学研究所朱桢研究小组构建了双T-DNA植物表达载体pCDMAR-Hyg(参见中国专利ZL02107429.1)，其为目标基因和选择标记基因分别位于两个独立T-DNA结构域且带核基质结合区MAR序列的单子叶植物表达载体。目前为止，关于利用该载体构建的目标基因表达载体的双T-DNA转基因培育无选择标记植物的方法，是通过分别在目标基因和选择标记基因序列区域设计标记，对转基因Ttl代进行检测，选择两个基因共整合的克隆，在T1代利用两个基因标记再次检测，从而获得无选择标记的转基因植株。该检测方法工作量大、效率低。以一个品种转化获得200个独立的共整合Ttl代植株为例，每个Ttl代植株至少需要筛选50个以上T1代植株才能保证获得无选择标记转化体，常规的做法必须先利用PCR方法对近10000个植株进行选择标记基因的筛选，然后再对经筛选确认不带选择标记基因的植株作PCR筛选含目的基因的植株。
【发明内容】
[0005]本发明旨在提供一种水稻双T-DNA转基因非连锁整合的分子标记检测方法，其特征在于包括如下步骤:
[0006](1)将以双T-DNA表达载体pCDMAR-Hyg构建的任意目的基因的表达载体，通过农杆菌介导转化到水稻中，获得Ttl代独立转化子，对独立转化子转基因苗利用潮霉素基因标记和目的基因标记进行基因型分析，筛选得到两个基因共整合的转化子；
[0007](2)分别提取上述筛选得到的两个基因共整合转化子的叶片DNA，利用特异分子标记Link-1对所提取的DNA进行PCR扩增，标记Link-1引物序列如下:[0008]正向引物(5' -3 ; )GCATTTGTAGGTGCCACCTTC ；
[0009]反向引物(5' -3 ; )CCAAGGGCTGCAGGAATTAAT ；
[0010](3)经PCR反应扩增共整合植株DNA，进行电泳观测，如果转基因植株在2516bp位置无任何条带，则说明双T-DNA为非连锁整合，如果在2516bp位置出现目标条带，则说明双T-DNA为连锁整合。
[0011]在本发明的一个优选实施方式中，所述的水稻为明恢86或者其它水稻品种。
[0012]在本发明的一个优选实施方式中，于所述的PCR扩增工艺为:
[0013]20ulPCR 反应体系包含:10 X Buffer2uL,弓丨物 2uL (终 0.5pm)，dNTPs2uL (终浓度200uM)，Tap 酶 0.2uL(l.5U)，DNAluL,以 ddH20 补足体系；
[0014]PCR反应程序为:95°C预变性5min，94°C预变性50s，60°C退火50s，72°C延伸
2.5min，32个循环，最后72°C延伸5min。
[0015]在本发明的一个优选实施方式中，所述的DNA提取工艺为:
[0016]I)取5cm长水稻叶片，剪成小段置入1.5mL管中；
[0017]2)打开管盖装入液氮后，用速冻过的玻璃棒将叶片磨成粉末；
[0018]3)加入预热的2 X CTAB500uL,混合均匀；
[0019]4)65°C水浴中反应3 0min,每五分钟颠倒混匀一次；
[0020]5)每管加入一倍体积(550uL)的氯仿:异戊醇(24:1)，充分震荡，室温12000rpm，离心8min，上清液移至新离心管中；
[0021]6)加入两倍体积的无水乙醇，于_20°C静置30min以上；
[0022]7)室温12000rpm，离心7min后弃上清，用70 %的酒精洗涤两次，最后风干加入50uL的TE或去离子水，于-20°C保存待用。
[0023]通过本发明的方法，转基因Ttl代即可鉴定出目标基因与选择标记基因是否连锁整合，淘汰连锁整合的转基因克隆，从而极大地提高无选择标记基因水稻的培育效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1:表达载体pCUEP-102的结构示意图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体的实例对本发明做进一步的说明。
[0026]1、材料与方法
[0027]1.1表达载体:利用以双T-DNA载体pCDMAR-Hyg构建的抗除草剂表达载体pCUEP-102构建过程:将由BstXI / Pme I双酶切获得的含Ubiqutin启动子和抗除草剂基因的全基因表达结构，插入到双T-DNA植物转化载体pCDMAR-Hyg的Sma I位点，得到植物表达载体PCUEP102，该表达载体的结构如图1所示。各元件说明见表1
[0028]表1抗除草剂表达载体pCUEP-102元件说明
[0029]
【权利要求】
1.水稻双T-DNA转基因非连锁整合的分子标记检测方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将以双T-DNA表达载体pCDMAR-Hyg构建的任意目的基因的表达载体，通过农杆菌介导转化到水稻中，获得Ttl代独立转化子，对独立转化子转基因苗利用潮霉素基因标记和目的基因标记进行基因型分析，筛选得到两个基因共整合的转化子； (2)分别提取上述筛选得到的两个基因共整合转化子的叶片DNA，利用特异分子标记Link-1引物对所提取的DNA进行PCR扩增，标记Link-1引物序列如下: 正向引物(5' -3' )GCATTTGTAGGTGCCACCTTC 反向引物(5' -3' )CCAAGGGCTGCAGGAATTAAT ； (3)经PCR反应扩增共整合植株DNA，进行电泳观测，如果转基因植株在2516bp位置无任何条带，则说明双T-DNA为非连锁整合，如果在2516bp位置出现目标条带，则说明双T-DNA为连锁整合。
2.权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的水稻为明恢86或者其它水稻品种。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的PCR扩增工艺为: 20ulPCR 反应体系包含:10 X Buffer2uL,弓丨物 2uL (终 0.5pm)，dNTPs2uL (终浓度200uM)，Tap 酶 0.2uL(l.5U)，DNAluL,以 ddH20 补足体系； PCR反应程序为:95°C预变性5min，94°C预变性50s，60°C退火50s，72°C延伸2.5min，32个循环，最后72°C延伸5min。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的DNA提取工艺为: 1)取5cm长水稻叶片,剪成小断置入1.5mL管中； 2)打开管盖装入液氮后，用速冻过的玻璃棒将叶片磨成粉末； 3)加入预热的2XCTAB500uL，混合均匀； 4)65°C水浴中反应30min,每五分钟颠倒混匀一次； 5)每管加入一倍体积(550uL)的氯仿:异戊醇(24: 1)，充分震荡，室温12000rpm，离心8min，上清液移至新离心管中； 6)加入两倍体积的无水乙醇，于_20°C静置30min以上； 7)室温12000rpm，离心7min后弃上清，用70%的酒精洗涤两次，最后风干加入50uL的TE或去离子水，于-20°C保存待用。
【文档编号】C12Q1/68GK103468792SQ201310289844
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年7月11日 优先权日:2013年7月11日
【发明者】沈显华, 黄仁良, 熊宏亮, 严松, 朱珊 申请人:江西省农业科学院水稻研究所