一种安福霉素类化合物及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种安福霉素类化合物及其制备方法，所述方法如下：将链霉菌菌株的单孢子在新鲜的天冬氨酸琼脂斜面培养，菌株斜面培养成熟后接种于种子培养基，再转接入发酵培养基培养，得到发酵液；将发酵液进行大孔树脂吸附柱层析，得到粗提物；将粗提物用水悬浮，用等体积正丁醇萃取，加入等体积蒸馏水，充分振荡混匀后两相分离取水相；将水相液浓缩后进行中压反相硅胶柱层析以获得二次粗产物，并分部收集安福霉素类化合物。本发明通过微生物发酵制得一种新的安福霉素类化合物，其具有抗菌性。
【专利说明】一种安福霉素类化合物及其制备方法
【【技术领域】】
[0001]本发明涉及一种安福霉素类化合物及其制备方法。
【【背景技术】】
[0002]随着抗菌药物的大量使用，不少致病菌出现多重耐药性。例如，由革兰氏阳性菌，如抗万古霉素肠球菌(VRE)和抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和青霉素耐受性肺炎链球菌(PRSP)等引起的感染(包括医院内感染)正在增加。耐药性问题的发生和蔓延已经严重威胁着人类的健康，因此筛选新结构、新作用机制的抗菌药物成为近年来研究的重点。
[0003]环脂肽类抗菌素是一类对抗革兰氏阳性耐药菌非常有效的重要抗菌素。其中，Daptomycin[Debono M, Barnhart M, Carrell C B, et al.A21978C, a complex of newacidic peptide antibiotics:1solation, chemistry and mass spectral structureelucidation[J].J Antibiot, 1980, 42(6):761-777.]是第一个用于临床的环脂肽类抗菌素，于2003年在美国成功上市，具有高杀菌性和快速作用性，对多种耐药菌均有抗菌作用，包括但不限于VRE和MRSA等耐药菌。Daptomycin具有独特的作用机制，耐药株出现几率很低。在钙离子存在的条件下，达托霉素以非共价键的形式结合到细胞膜蛋白上，扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的磷壁(酸)脂质(LTA)的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀灭细菌的目的[Alborn WEJr, Allen NE, Preston DA.Daptomycin disrupts membranepotential in growing Staphylococcus aureus[J].Antimicrob Agent s Chemother, 1991,35(11):2282]。尤为重要的是，daptomycin是近四十年来应用到临床的唯一化学结构和作用机制全新的抗生素，Daptomycin的成功使得环脂肽类化合物,成为当今新抗菌素筛选和研发的热点。
[0004]安福霉素(Amphomycin)[Heinemann B, Kaplan M A, Muir R D, etal.Amphomycin, a new antibiotic [J].Antibiot Chemother, 1953，3:1239 - 1242.]发现于上个世纪50年代，研究表明其具有广泛的抗革兰氏阳性菌作用。随后，研究人员又发现了一系列与其在理化性质、抗菌活性相近的环脂肽化合物，如aspartocin, tsushimycin,laspartocin, friulimicin B 等[Baltz R.H., Miao V.&ffrigley S.K.(2005).Naturalproducts to drugs:daptomycin and related lipopeptide antibiotics.Nat.Prod.Rep.22(6),717-741.]。这一类化合物均由氨基酸组成环脂肽结构，只是氨基酸种类以及数量，或侧链脂肪链不尽相同。Amphomycin因其有溶血作用而不能用药,但其与daptomycin相比，具有更好的治疗指数[V.J.Leea.Ant1-gram positive agents of naturalproduct origin[J].Co mprehensive Medicinal Chemistry II.2007，7，653-671.]。以amphomycin结构为骨架，对其进行修饰，有助于发现更多有效的抗菌药物。Cameron 等[ffacowich-Sgarbi,S A,Boyd V A,Cameron D R, et al.Synthesis andStructure - Activity Relationship (SAR) Studies on Dab-9Substitutions of theLipopeptide Antibiotic Amphomycin.229th American ChemicalSociety Meeting, SanDiego, CA, Mar 13 - 17, 2005; Abs367.]对 amphomycin 结构中 9 位的 Dab 以及脂肪链进行修饰，得到化合物M-1396，其抗菌活性与daptomycin相当。温哥华MIGENIX生物制药公司研发了 amphomycin 半合成衍生物 MX-2401 [MIGENIX Inc.MIGENIX Reports.Effectiveness ofMX-2401in Pneumonia Model[R].Vancouver, BC, Canada&San Diego, CA, USA, 2005, June23/PRNewswire.]，其结构与amphomycin相似，仅侧链脂肪酸和肽环中一个氨基酸有差异。Rubinchik 等[Rubinchik E, Schneider T, et al.Mechanism of Action andLimited Cross-Resistance of New Lipopeptide MX-2401.Antimicrob[J].AgentsChemother, 2011, 55(6):2743 - 2754.]对MX-2401的作用机制进行了研究，发现其通过结合十一戊烯磷酸基质(C55-P)来抑制肽聚糖的合成，抑制细胞壁前体Iipid I和lipid II以及细胞壁磷酸前体lipid III的合成，与达托霉素机制不同。Dominique等[Dominique
D,Haiyan Y, et al.Antimicrobial Properties of MX-2401, an Expanded-SpectrumLipopeptide Active in the Presence of Lung Surfactant[J].Antimicrob AgentsChemother, 2011，55(8):3720 - 3728.]研究了 MX-2401 的抗菌活性，结果表明 MX-2401 对VRE, MRSA、MSSA、MRSE等具有很好的抗菌能力，并且对支气管肺泡肺炎动物模型有良好的治疗作用。再者，MX-2401与daptomycin相比，具有更长的抗生素后效应和半衰期,减少了给药次数，从而减少了药物毒性，有望成为另一个临床运用的环脂肽类化合物。因此，amphomycin及其类似物的研究对新药开发具有极其重要的意义。
【
【发明内容】
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[0005]本发明要解决的技术问题之一，在于提供一种安福霉素类化合物，其为一种新的安福霉素类化合物，具有抗菌性。
[0006]本发明是这样实现上述技术问题之一的:
[0007]—种安福霉素类化合物， 所述安福霉素类化合物的分子结构式如下:
[0008]
【权利要求】
1.一种安福霉素类化合物，其特征在于:所述安福霉素类化合物的分子结构式如下:
2.根据权利要求1所述的一种安福霉素类化合物的制备方法，其特征在于:包括如下步骤: 步骤一:将暗灰链霉菌菌株(Streptomyces canus) FIM-0916的单孢子在新鲜的天冬氨酸琼脂斜面培养，菌株斜面培养成熟后接种于种子培养基，再转接入发酵培养基培养，得到暗灰链霉菌菌株(Streptomyces canus) FIM-0916发酵液； 步骤二:将步骤一所获得的暗灰链霉菌菌株(Streptomyces canus)FIM-0916发酵液进行大孔树脂吸附柱层析，得到粗提物； 步骤三:将步骤二所获得的粗提物用水悬浮，调PH至2-3，用等体积正丁醇萃取，正丁醇层调PH至7-8，加入等体积蒸馏水，充分振荡混匀后两相分离取水相； 步骤四:将步骤三所获得的水相液浓缩后进行中压反相硅胶柱层析以获得二次粗产物，进行中压反相硅胶柱层析时，先采用体积分数为10%乙腈含0.1%三氟乙酸的水溶液为流动相平衡20分钟后，然后流动相采用体积比10%~70%的乙腈-90%~30%含0.1%三氟乙酸的水溶液系统梯度洗脱120min，分部收集安福霉素类化合物，流动相的流速为5ml/min ;最后根据高效液相色谱检测分部收集液； 所述暗灰链霉菌菌株(Streptomyces canus)FIM-0916,于2013年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC N0.7792。
3.根据权利要求2所述的一种安福霉素类化合物的制备方法，其特征在于:所述步骤一具体为: 将暗灰链霉菌菌株(Streptomyces canus)FIM-0916的单孢子在新鲜的天冬氨酸琼脂斜面30°C培养7-10天；待暗灰链霉菌菌株(Streptomyces canus) FIM-0916斜面培养成熟后接种于种子培养基中，并将其置于恒温摇床中振荡培养40~48h，温度30°C，转速250r/min ;然后按1.0%的移种量将所获得的种子液转接入已消毒灭菌的发酵培养基培养110~130h，温度 28°C，转速 250r/min。
4.根据权利要求2或3所述的一种安福霉素类化合物的制备方法，其特征在于: 所述斜面培养基的组分及其含量如下:酵母提取物4.0%，麦芽提取物10.0%，葡萄糖4.0%，琼脂18.0%，蒸馏水IL ;且所述斜面培养基的pH为7.3-7.5，所述斜面培养基组分中的百分数均为质量分数。
5.根据权利要求2或3所述的一种安福霉素类化合物的制备方法，其特征在于:所述种子培养基的组分及其含量如下:蔗糖30.0%，KNO3L 0%，K2HPO4L 0%，蛋白胨5.0%，酵母膏2.0%, KC10.5%, MgSO4.7Η200.5%, FeSO4.7Η200.01%,且所述种子培养基 pH 为 7.3-7.5，所述种子培养基组分中的百分数均为质量分数。
6.根据权利要求2或3所述的一种安福霉素类化合物的制备方法，其特征在于:所述发酵培养基的组分及其含量如下:黄豆粉10.0%，葡萄糖10.0%，NaC15.0%，KNO3L 0%，CaCO3L 0%，且所述发酵培养基pH为7.3-7.5，所述发酵培养基组分中的百分数均为质量分数。
7.根据权利要求2所述的一种安福霉素类化合物的制备方法，其特征在于:所述步骤四中的高效液相色谱检测条件为:分析柱为ODS C18，其中C18粒径为5 μ m，分析柱长度乘以内径为250X4.6mm ;流动相为体积比35:65的含0.1%三氟乙酸的水-乙腈，流速为1.0ml/min ;柱温为40° C ; 检测波长为210nm。
【文档编号】C12R1/465GK103554230SQ201310428077
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】郑卫, 杨煌建, 张祝兰, 周剑, 黄凯, 王德森 申请人:福建省微生物研究所