检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因第一内含子倒位的引物、方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一内含子倒位的方法、引物和试剂盒，包括：扩增凝血因子Ⅷ基因Intlh-1区域的引物SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3；扩增凝血因子Ⅷ基因Intlh-2区域的引物SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4。利用该方法和试剂盒可以简便、高效、特异地检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一内含子倒位。
【专利说明】检测甲型血友病凝血因子WI基因第一内含子倒位的引物、方法和试剂盒
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属生命科学和生物【技术领域】，特别涉及检测甲型血友病凝血因子珊基因的第一内含子的引物、方法和试剂盒，利用长片段PCR扩增技术可以对甲型血友病凝血因子珊基因的第一内含子倒位进行检测。
[0003]
【背景技术】
[0004]血友病是一组遗传性凝血因子缺乏引起的出血性疾病，包括血友病A(甲型)、血友病B (乙型)和遗传性因子XI缺乏症(丙型)。前两者为性连锁隐性遗传，后者为常染色体不完全隐性遗传。
[0005]甲型血友病是一种由于凝血因子VDI (Factor VIII，F VDI)基因缺陷导致患者产生严重凝血障碍的X染色体连锁隐性遗传病，男女均可发病，但绝大部分患者为男性。
[0006]?珊基因位于乂928，长度约186kb，含有26个外显子和25个内含子。F VDI基因不仅结构庞大，而且导致血友病A的基因突变种类繁多，其中最常见的是由FVDI基因第22号内含子倒位突变引起的F VDI严重缺乏，它是45%~50%重型血友病A患者的分子发病机制，而F VDI基因第I号内含子 倒位是另一常见突变，约5%的重型血友病A是由该突变所致。
[0007]F VDI基因第I号内含子倒位与F VDI抑制物形成的关系:自1996年Brinke等首次发现了 FVDI基因第I号内含子可发生倒位以来，近年来越来越多的研究报道，FVDI第I号内含子倒位是仅次于第22号内含子倒位导致重型血友病A的常见原因。目前认为，第I号内含子倒位发生率为1.2^5%之间。最近，Schroder等对德国的1127例血友病A患者的研究结果显示，有23例患者发生第I号内含子倒位，占2.04% ( 23/ 1127 )，抑制物阳性率为26.09%,明显高于其他国家。
[0008]FVDI基因在其第I号内含子倒位产生的分子机制与第22号内含子倒位的分子机制非常相似，其本质都是由于基因组水平上F VDI基因内部和外部靠近远端的高度同源序列发生基因重组，从而影响F VDI基因mRNA的形成，造成正常蛋白严重缺乏而导致重型血友病A的发生。FVDI基因在其第I号内含子内有一段1041bp的序列(丨社111-1)，和与？珊基因相隔约140kb处的另一段序列(intlh-2)的同源性高达99.9%。Intlh-2区域位于C6.1A基因和VBPI基因之间，其方向与intlh-Ι完全相反(如图1所示)。Inilh-1和inilh_2发生基因重组后形成两个嵌合的mRNA:—个mRNA包含F VDI基因的第I号外显子及后续的VBPI基因第2号外显子到第6号外显子，受F VDI基因的启动子调控；另一个mRNA包含C6.1A基因几乎所有编码区及后续的F珊基因部分第I号内含子和第2号外显子到第26号外显子，受C6.1A基因的启动子调控。由于F VDI基因大部分编码区位于C6.1A基因终止密码子的下游并与F珊基因信号肽分离，因而即使这种嵌合的mRNA能够稳定存在并在肝脏中足量合成，也不可能有F VDI蛋白分泌至外周血中。
[0009]
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供用一种检测甲型血友病凝血因子VDI基因的第一内含子倒位的引物序列，利用该引物序列可以简便、高效、特异的检测甲型血友病凝血因子珊基因的第一内含子倒位。
[0011]本发明提供检测甲型血友病凝血因子珊基因的第一内含子倒位的引物，其特征在于，包括:
(i )扩增 FVDI 基因 Intlh-1 区域的引物 SEQ ID N0.USEQ ID N0.2, SEQ ID N0.3，其碱基序列为:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.2:GCTCAAGCTAGGATGGCTCTGC
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA ；
(ii )扩增 F VDI基因 Intlh-2 区域的引物 SEQ ID N0.USEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4，其碱基序列为:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA
SEQ ID N0.4:TG GGTGATATAAGCTGAGCTA。
[0012]进一步地，引物SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 使用浓度分别为 2 μ M、2 μ M 和 2 μ Mo
[0013]进一步地，引物SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 使用浓度分别为 2 μ Μ、2 μ M 和 2 μ Mo
[0014]本发明还提供检测甲型血友病凝血因子VDI基因的第一内含子倒位的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:
(i ) PCR扩增反应试剂；
(?)权利要求1所述引物序列。
[0015]进一步地，所述PCR扩增反应试剂包括dNTP、2*PCR缓冲液、Mg2+、Taq酶。
[0016]进一步地，Mg2+反应终浓度为1.0mM ；dNTP反应终浓度为3.0mM。
[0017]本发明还提供了一种检测甲型血友病凝血因子珊基因的第一内含子倒位的方法，包括如下步骤:
(i )采集待测血液样本，提取DNA ；
(? )以该DNA为模板，进行LD-PCR扩增，得到PCR反应产物，其中所述PCR引物为扩增 F VDI基因 Intlh-1 区域的引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 ;其碱基序列为:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.2:GCTCAAGCTAGGATGGCTCTGC
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA ；
扩增 F VDI基因 Intlh-2 区域的引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 ;其碱基序列为:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA
SEQ ID N0.4:TGGGTGATATAAGCTGAGCTA ；
(iii)步骤(ii )中获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析检测结果。
[0018]进一步地，步骤(ii )的PCR反应按以下条件进行扩增:94°C 2min预变性；94°C30s、64°C 30s,72°C 3min，30 个循环；72°C IOmin0
[0019]进一步地，扩增分为两管完成，第一管包含3条引物，分别为SEQ ID N0.USEQ IDN0.2,SEQ ID N0.3 ;第二管包含3 条引物，分别为 SEQ ID N0.USEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4。
[0020]进一步地，第一管中的引物SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3使用浓度分别为 2μΜ、2μΜ和 2μΜ;第二管中的引物 SEQ ID N0.USEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4 使用浓度分另lJ为2 μ Μ、2 μ M和2 μ Μ。
[0021]应用PCR检测F VDI基因第I号内含子倒位的方法包括inilh-Ι和intlh-2两个扩增体系，每个扩增体系包括三条不同的引物。Intlh-1扩增体系包含针对inilh-Ι区域的引物9F和9cR，另外加上引物intlh-2F，其扩增产物经1.5%琼脂糖电泳后在第I号内含子倒位阴性患者中会产生一条1908bp的条带,而在第I号内含子倒位阳性患者会产生一条1323bp的条带,该倒位的女性携带者会出现1908bp和1323bp的两条条带。Intlh-2扩增体系包含针对intlh-2区域引物intlh-2F和intlh_2R，另外加上引物9F，该反应产物在第I号内含子倒位阴性者会产生一条1191bp的条带，而在第I号内含子倒位阳性患者会产生一条1776bp的条带,而该倒位的女性携带者可出现1191bp和1776bp两条条带。
[0022]本发明的有益效果:本发明采用长片段PCR扩增技术(Long-distance PCR,
0)-?00对？珊基因Intlh-1以及Intlh-`2区域进行多重LD-PCR，可保障引物与模板杂交发生在最互补的目的扩增片段之间，因此大大提高了特异性目的扩增片段的扩增效率；由于采用的单管多重LD-PCR技术，因此可以实现单管即可检测野生型、携带型、倒位型，从而节省了人力、物力以及时间成本，操作起来也更简洁方便。
[0023]
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是F VDI基因第I号内含子倒位发生机制及其引物示意图。
[0025]图2是临床样本第I管和第II管引物扩增样本的PCR电泳结果。
[0026]
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:比如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0028]实施例1
用于体外诊断甲型血友病凝血因子VDI基因的第一内含子的试剂盒，包括:dNTP、2*PCR缓冲液、MgCl2、Taq酶；按一定比例混合的多重引物A液和B液；使用说明书。[0029]其中，MgCl2反应终浓度为1.0mM, dNTP反应终浓度为3.0mM。
[0030]A 液(I 管)包括:扩增 F VDI基因 Intlh-1 区域的引物 9F (SEQ ID N0.l)q9R (SEQID N0.2)、Intlh-2F (SEQ ID N0.3);其碱基序列为:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.2:GCTCAAGCTAGGATGGCTCTGC
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA ；
B 液(II管)包括:扩增 F VDI基因 Intlh-2 区域的引物 9F(SEQ ID N0.l)、Intlh_2F(SEQID N0.3)、Intlh-2R (SEQ ID N0.4);其碱基序列为:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA
SEQ ID N0.4:TGGGTGATATAAGCTGAGCTA。
[0031]I管预混液中引物的终浓度:9F为2 μ M、9R为2 μ M、Intlh_2F为2 μ Μ。
[0032]II管预混液中引物的终浓度:9F为2 μ M、Intlh_2R为2 μ M、Intlh_2F为2 μ Μ。
[0033]阴性对照:正常男性血液样本DNA抽提产物。
[0034]阳性对照:甲型血友病凝血因子VDI基 因的第一内含子倒位患者的血液样本DNA抽提产物。
[0035]实施例2:试剂盒的使用方法
I)样本DNA抽提(根据天根血液/细胞/组织基因DNA提取试剂盒说明书):抽提人血液标本DNA，样本抽提方法如下。
[0036]1.1抽取300uL血液加入900uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。1000Orpm离心I分钟(若离心机最高转速不允许,可3000rpm离心5min),吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。加入20 μ I蛋白酶K溶液，混匀。
[0037]1.2加入200 μ I缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶液应变清亮，
简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0038]1.3加人200 μ I无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简
短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0039]1.4将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000 rpm (13，400 Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
[0040]1.5向吸附柱CB3中加入500 μ I缓冲液⑶(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000 rpm (13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0041]1.6向吸附柱CB3中加入700 μ I漂洗液PW (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000 rpm (13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0042]1.7 向吸附柱 CB3 中加入 500 μ I 漂洗液 PW，12，000 rpm (13, 400 Xg)离心 30秒，倒掉废液。
[0043]1.8将吸附柱CB3放回收集管中，12，000 rpm(13，400Xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0044]1.9将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μ I洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000 rpm (13，400Xg)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
[0045]2)实验过程
2.1引物混合液配制
I管预混液中引物的终浓度:9F为2 μ M、9R为2 μ M、Intlh_2F为2 μ Μ。
[0046]II管预混液中引物的终浓度:9F为2 μ M、Intlh_2R为2 μ M、Intlh_2F为2 μ Μ。
[0047]配置好的引物混合液放置4°C待用，若长期不使用请置于_20°C，如有可能分装成小包装。
[0048]2.2按样品数η =待测样本数+阴性对照I个+空白对照I个；取预混PCR反应液，每管23 μ I分装于反应管中。
[0049]2.3将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照各取2μ I分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，具体反应体系如表1和表2所示。
[0050]表1.1管预混液配置表
【权利要求】
1.检测甲型血友病凝血因子VDI基因的第一内含子倒位的引物，其特征在于，包括: (i )扩增 F VDI基因 Intlh-1 区域的引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3，其碱基序列为:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.2:GCTCAAGCTAGGATGGCTCTGC
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA ； (ii )扩增 F VDI基因 Intlh-2 区域的引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4，其碱基序列为:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA
SEQ ID N0.4:TGGGTGATATAAGCTGAGCTA。
2.如权利要求2所述的引物，其特征在于，引物SEQID N0.K SEQ ID N0.2、SEQ IDN0.3使用浓度分别为2 μ Μ、2 μ M和2 μ M。
3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，引物SEQID N0.K SEQ ID N0.3、SEQ IDN0.4使用浓度分别为2 μ Μ、2 μ M和2 μ Μ。
4.检测甲型血友病凝血因子珊基因的第一内含子倒位的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: (i ) PCR扩增反应试剂； (? )权利要求1所述引物序列。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增反应试剂包括dNTPs、2*PCR缓冲液、Mg2+、Taq酶。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，Mg2+反应终浓度为1.0mM ；dNTP反应终浓度为3.0mM。
7.检测甲型血友病凝血因子珊基因的第一内含子倒位的方法，包括如下步骤: (i )采集待测血液样本，提取DNA ； (? )以该DNA为模板，进行LD-PCR扩增，得到PCR反应产物，其中所述PCR引物为扩增 F VDI基因 Intlh-1 区域的引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 ;其碱基序列为:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.2:GCTCAAGCTAGGATGGCTCTGC
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA ； 扩增 F VDI基因 Intlh-2 区域的引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 ;其碱基序列为:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA
SEQ ID N0.4:TGGGTGATATAAGCTGAGCTA ； (iii)步骤(ii )中获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析检测结果。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(ii)的PCR反应按以下条件进行扩增:94°C 2min 预变性；94°C 30s、64°C 30s,72°C 3min，30 个循环；72°C IOmin0
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，扩增分为两管完成，第一管包含3条引物，分别为 SEQ ID N0.USEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3 ;第二管包含 3 条引物，分别为 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，第一管中的引物SEQID N0.K SEQ IDN0.2,SEQ ID N0.3使用浓度分别为2μΜ、2μΜ和2μΜ;第二管中的引物SEQ ID N0.USEQID N0.3、SEQ ID N0.4 使用浓度分别`为 2 μ Μ、2 μ M 和 2 μ Μ。
【文档编号】C12N15/11GK103820539SQ201310455416
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】宋坤, 周晓犊, 王淑一, 孙翠莲 申请人:长沙艾迪康医学检验所有限公司