专利名称:重型血友病a致病基因突变检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术与生物医药领域，具体涉及检测重型血友病A致病基因内含子22和内含子I倒位突变的试剂盒。
背景技术：
血友病A (hemophilia A, HA)又称甲型血友病，是最为常见的X连锁隐性遗传性出血性疾病，其主要病因是由于凝血因子VIII (FVIII)基因突变而引起的FVIII含量不足或功能缺陷。HA患者常自发性或外伤性出血不止，出血可发生在任何部位，但以关节出血最为多见。反复多次关节出血可导致患者致残，甚至危及生命。临床上根据患者血浆FVIII促凝活性及症状严重程度将HA分为重型、中型和轻型，其中50%为重型。
我国HA的发病率在男性人群中约为1/5000。血友病根据所缺乏凝血因子的不同分为血友病A和血友病B (hemophilia B, HB), HA约占全部血友病的80%_85%，HB则约占15%-20%且在临床上通常为中型和轻型。HA的人群患病率无种族和地区差异，可能与较高的基因自发突变率相关。由于是X连锁隐性遗传，女性HA患者及其罕见。
FVIII基因全长186kb，位于X染色体长臂远端(Xq28)，含有26个外显子和25个内含子，编码2351个氨基酸。随着人们对HA分子基础的认识不断深入，该病基因诊断的技术也得到了很大发展。截止2012年已经报道基因突变1400多种，主要是点突变、插入、缺失和倒位，其中内含子22倒位(Inversion 22，Inv22)突变约占全部重型血友病A的45%。1996年，Brinke等在一对同卵双生的重型HA双胞胎患者中第一次发现了 FVIII基因第I号内含子倒位(Inversionl, Invl)突变,在大样本重型HA患者中进行了该倒位的筛查，发现第I号内含子倒位是重型HA中仅次于第22号内含子倒位的突变热点。约50%的重型HA患者是由于内含子22倒位和内含子I倒位突变造成，这是近年来HA发病机制中重要的进展。
目前血友病规范化诊断已建立了包括临床诊断、家系调查、实验检测等系列技术平台。实验检测分为基因诊断和非基因间接诊断。目前市场上所有的血友病诊断产品均采用非基因间接诊断，包括活化部分凝血活酶时间(APTT)、血浆凝血酶原时间(PT)、血浆FVIII C以及FVIII抗原检测等。这些产品可以对HA进行确诊，但无法确定HA患者的基因突变类型更无法检出携带者。因此，开发可以方便、准确诊断HA的基因分型产品，有效应用于产前诊断，对避免重型血友病胎儿出生，减低HA发病率具有重要意义。
Single tube PCR assay for detection of chromosomal mutations application tothe inversion hotspot in the factor VIII gene including optionaluse of subcyclingPCR，该专利由 Qiang Liu 和 Steven S Sommer 发明，于 2002 年公开，专利号为US6355422B1。提出利用长距离PCR (Long Distance PCR，LD-PCR)法检测血友病A内含子22倒位突变。优势一管PCR法，直接分型检测血友病A患者、携带者和野生型；缺限成本高昂、耗时长、仅能检测内含子22倒位，检测系统不稳定，试剂需现用现配，无法作为临床检测产品应用。[0007]由上海佰真生物技术有限公司申请，2011年公开，专利公开号为CN102230002A的中国发明“血友病致病基因检测试剂盒及应用”公开的技术方案主要针对FVIII和FIX因子外显子区设计PCR和测序引物。优势同时检测血友病A与血友病B致病基因，覆盖全长序列；缺陷测序反应耗时长、成本高昂，70%-80%血友病A的FVIII基因突变呈高度异质性，突变形式复杂，测序结果难以分析。
目前，血友病A基因检测方法主要有
LD-PCR法长距离PCR，一般指扩增片断超过5kb的PCR方法，但反应体系无法满足稳定性和低成本要求。
Southern blot技术检测HA内含子22倒位,将待测的基因组DNA经限制性核酸内切酶消化后，琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，凝胶经碱处理使DNA变性，再将其从凝胶中印迹到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，以放射性或非放射性标记的DNA探针与固相支持体上的DNA杂交，根据探针的标记特性用相应方法显示杂交条带，对待测DNA进行分析。操作复杂、灵敏度低，已很少使用。
反向PCR法检测HA内含子22倒位，利用限制性内切酶Bcl I消化基因组后突变体片段存在差异，通过酶切产物进行自连，再利用PCR扩增，电泳分析。该方法耗时长达48h以上、操作复杂、对技术要求高，不适合开发产品。
直接测序(DS):通过DNA测序仪对FVIII全基因直接进行测序，找出基因突变的确切位置。但由于FVIII全基因片段很长，测序工作量大，时间长，限制了其在HA诊断上的广泛应用。
单链构象多态性(SSCP):通过PCR-单链构象多态性分析法检测小片段PCR产物< 200bp，可筛查出点突变等的70%-95%。但当PCR产物片段> 400bp时检出率不足50%，要保证检出率而使用小片段检测大大限制了此法在HA诊断上的应用。
变性梯度凝胶电泳(DGGE):利用野生型和突变型基因DNA在变性梯度凝胶过程中迁移率不同来检测基因突变，当检测片段< 600bp时检出率可达95%。DGGE比SSCP可靠、精准、且检测片段较长。
变性高效液相色谱(DHPLC):通过分离柱进行突变DNA片段的分离和分析，对FVIII基因突变的检出率达96%。此法快速高效，易于自动化，被检片段可达1500bp，但费用昂贵，与SSCP、DGGE法一样需经测序才能确定突变的具体位置。
综上，现有技术中LD-PCR法由于反应体系无法满足稳定性和低成本要求，仅能检测内含子22倒位突变而无法开展广泛临床应用；测序法无法将结果分析与临床诊断进行有效结合；反向PCR法操作繁琐；SSCP仅适合检测点突变，DGGE和DHPLC操作繁琐、费用高昂、需测序确定突变的具体位置。
发明内容
本发明的目的是运用LD-PCR法快速灵敏地检测HA患者的FVIII基因内含子22和内含子I倒位，可检出50%的重型HA患者。
本发明的技术方案为提供一种重型血友病A致病基因突变检测试剂盒，所述试剂盒包括Inv22PCR反应液和InvlPCR反应液；
I)所述Inv22PCR反应液包括检测重型血友病A致病基因内含子22基因倒位的引物3条，分别为
引物A22 :SEQ ID NO :1
引物B22 :SEQ ID NO :2
引物C22 :SEQ ID NO :3
2)所述InvlPCR反应液包括检测重型血友病A致病基因内含子22基因倒位的引物3条，分别为
引物IF= SEQIDNO[0025]引物IR= SEQIDNO[0026]引物2F= SEQIDNO6。
优选的，上述重型血友病A致病基因突变检测试剂盒中所述Inv22PCR反应液还包括Taq DNA聚合酶抑制剂，所述InvlPCR反应液还包括Taq DNA聚合酶抑制剂。
优选的，上述重型血友病A致病基因突变检测试剂盒中所述Taq DNA聚合酶抑制剂为 Taq-Antibody。
优选的，上述重型血友病A致病基因突变检测试剂盒中所述试剂盒还包括Inv22阳性参考品、Invl阳性参考品和阴性参考品，所述Inv22阳性参考品为Inv22杂合子混合质粒，所述Invl阳性参考品为Invl杂合子混合质粒，所述阴性参考品为去离子水。
优选的，上述重型血友病A致病基因突变检测试剂盒中，所述的Inv22PCR反应液各组分含量为
2XGC buffer 25μ L ；
IOmM dATP、dCTP、dTTP 的等体积混合液2. O μ L ;
IOmM dGTP :1· 5μ L ;
ΙΟμΜ 引物 Α22 :1· 25μ L ;
ΙΟμΜ 引物 Β22 :0.625yL ;
ΙΟμΜ 引物 C22 :0.625yL ;
5U/ μ L LA taq DNA 聚合酶I. 0 μ L ;
5U/ μ L Taq-Antibody I. 0 μ L ；
去离子水11.5μ L ;
所述的InvlPCR反应液各组分含量为
10XPCR buffer 2. 5μ L ；
2. 5mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP 的等体积混合液4 μ L ;
ΙΟμΜ 引物 IF :0· 5μ L ;
ΙΟμΜ 引物 IR :0· 5μ L ;
10y]/^_2F:0.5yL;
5U/ μ L Hotstar Taq 酶1· O μ L ;
5U/ μ L Taq-Antibody :0· 5 μ L ;
去离子水13.5μ L。
本发明有益效果为按照基因倒位原理，在FVIII基因内含子22和内含子I同源序列两端分别设计特异性引物，基因重组后，引物对发生交叉扩增，从而获得不同长度的扩增片段。本发明采用多重LD-PCR法开发高特异性的HA基因诊断产品。其优点如下第一，解决Inv22长片断扩增稳定性、检测灵敏度、PCR产物量和电泳检测丰度的问题，提高对高GC片断的扩增效率、筛选dNTP浓度增强扩增特异性、筛选电泳条件提高检测PCR产物条带亮度；第二，通过添加Taq DNA聚合酶抑制剂解决试剂保存时间、温度耐受等问题，提高本发明的临床应用的稳定性。
图I为本发明Inv22PCR产物电泳图；其中I :Inv22杂合突变，携带者；2 :Inv22纯合突变，HA患者；3 wild type ；4 Inv22阳性参考品；5 :阴性参考品；
图2为本发明InvlPCR产物电泳图；其中I :Invl杂合突变，携带者；2 wildtype ；3 =Invl纯合突变，HA患者；4 =Invl阳性参考品；5 :阴性参考品；6 =Marker (2000bp,IOOObp,750bp,500bp,200bp,IOObp)。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。
现有技术中LD-PCR法由于反应体系无法满足稳定性和低成本要求、仅能检测内含子22倒位突变而无法开展广泛临床应用；本发明利用LD-PCR技术，同时检测重型血友病A内含子22和内含子I倒位突变，这两类突变覆盖50%的重型血友病A患者。通过添加保护剂，解决试剂稳定性问题；优化反应体系，降低试剂成本，使产品真正应用于临床，填补国内外血友病基因诊断广品空白。
在FVIII基因内含子22中有两个基因FVIIIA和FVIIIB，而X染色体远端另有两个与FVIIIA同源的基因。FVIIIA可与两个同源基因之一发生同源重组，从而使FVIIIA基因内含子22倒位至基因外远端。内含子I倒位分子机制与Inv22相似在FVIII基因的I号内含子内intlh21序列和基因外远端intlh22序列同源性高达99. 9%。Intlh21和intlh22发生基因重组后可形成两个嵌合的mRNA，FVIII基因转录被终止并与信号肽分离，导致FVIII蛋白合成与分泌失败。
按照基因倒位原理，在FVIII基因内含子22和内含子I同源序列两端分别设计特异性引物，基因重组后，引物对发生交叉扩增，从而获得不同长度的扩增片段。据此，采用多重LD-PCR法开发高特异性的HA基因诊断产品。本发明从两个角度进行开发，第一，解决Inv22长片断扩增稳定性、检测灵敏度、PCR产物量和电泳检测丰度，提高对高GC片断的扩增效率、增强扩增特异性并提高电泳检测分辨率；第二，为解决临床应用产品的稳定性，通过添加Taq DNA聚合酶抑制剂解决试剂保存时间、温度耐受等问题。
抑制剂在保存液状态抑制PCR反应液内Taq DNA聚合酶活性，在PCR反应开始后失活抑制剂，并恢复Taq DNA聚合酶活性，从而提高了 Taq DNA聚合酶对环境温度耐受性。本发明选择的Taq DNA聚合酶抑制剂为Taq-Antibody(Ap),它是一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体，通过与Taq DNA聚合酶结合抑制酶活性，有效抑制引物二聚体的形成和非特异性扩增，同时增强了酶的温度耐受能力。
实施例I本发明试剂盒组成
本发明试剂盒特征包括Inv22PCR反应液、InvlPCR反应液、Inv22阳性参考品、Invl阳性参考品、阴性参考品。
Inv22PCR 反应包括 Taq DNA 聚合酶、PCR buffer、Deaza-dGTP、dNTP、引物和Taq-Antibody (Ap)；
InvlPCR 反应液包括 Taq DNA 聚合酶、PCR buffer、dNTP、引物和 Ap ；
Inv22阳性参考品是含有Inv22PCR扩增产物全部片断的混合质粒；
Invl阳性参考品是含有Invl PCR扩增产物全部片断的混合质粒；
阴性参考品的成分为ddH20 ；
I、引物序列设计
根据已报道重型血友病A的FVIII基因倒位机制和序列，对相应引物进行了大量实践的筛选，包括增加或减少引物长度，并设计系列引物覆盖特异性区域，通过正交试验最终确定检测HA内含子22基因倒位引物3条，如表I所示，分别为A22，B22和C22 ;检测HA内含子I基因倒位引物3条，分别为1F、1R和2F。
权利要求
1.重型血友病A致病基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Inv22PCR反应液和InvlPCR反应液；1)所述Inv22PCR反应液包括检测重型血友病A致病基因内含子22基因倒位的引物3条，分别为引物 A22 SEQ ID NO 1 ；引物 B22 SEQ ID NO :2 ；引物 C22 SEQ ID NO :3 ；2)所述InvlPCR反应液包括检测重型血友病A致病基因内含子22基因倒位的引物3条，分别为引物IFSEQIDNO4；引物IRSEQIDNO5 ；引物2FSEQIDNO:60
2.如权利要求
I所述的重型血友病A致病基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述Inv22PCR反应液还包括Taq DNA聚合酶抑制剂，所述InvlPCR反应液还包括Taq DNA聚合酶抑制剂。
3.如权利要求
2所述的重型血友病A致病基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述TaqDNA聚合酶抑制剂为Taq-Antibody。
4.如权利要求
I所述的重型血友病A致病基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Inv22阳性参考品、Invl阳性参考品和阴性参考品,所述Inv22阳性参考品为Inv22杂合子混合质粒，所述Invl阳性参考品为Invl杂合子混合质粒，所述阴性参考品为去离子水。
5.根据权利要求
I所述的重型血友病A致病基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的Inv22PCR反应液各组分含量为2XGC buffer 25μ L ；IOmM dATP、dCTP、dTTP 的等体积混合液2. O μ L ;IOmM dGTP 1. 5μ L ；ΙΟμΜ 引物 Α22 1. 25μ L ；ΙΟμΜ 引物 Β22 0. 625μ L ；10yM^|^C22 0. 625μ L ；5U/ μ L LA taq DNA 聚合酶I. O μ L ;5U/μ L Taq-Antibody 1. O μ L ；去离子水11. 5μ L ；所述的InvlPCR反应液各组分含量为IOXPCR buffer 2. 5μ L ；2.5mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP 的等体积混合液4μ L ；ΙΟμΜ 弓丨物 IF 0. 5μ L ；ΙΟμΜ 弓丨物 IR 0. 5μ L ；ΙΟμΜ 弓丨物 2F 0. 5μ L ；5U/ μ L Hotstar Taq I. O μ L ；5U/μ L Taq-Antibody 0.5 μ L ；去尚子水13. 5 μ L0
专利摘要
本发明属于生物技术与生物医药领域，具体涉及检测重型血友病A致病基因内含子22和内含子1倒位突变的试剂盒。本发明的技术方案为提供一种重型血友病A致病基因突变检测试剂盒，包括Inv22PCR反应液和Inv1PCR反应液，所述Inv22PCR反应液包括检测重型血友病A致病基因内含子22基因倒位的引物3条，所述Inv1PCR反应液包括检测重型血友病A致病基因内含子22基因倒位的引物3条。本发明提高了Inv22长片断扩增稳定性、检测灵敏度、PCR产物量和电泳检测丰度，并进一步通过添加Taq DNA聚合酶抑制剂解决试剂保存时间、温度耐受等问题，提高本发明的临床应用的稳定性。
文档编号C12Q1/68GKCN102943114SQ201210494686
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月28日
发明者刘晶晶, 王小薇, 朱玉华, 任维 申请人:亚能生物技术(深圳)有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan