药典三种秦艽药材的dna条形码鉴别方法
【专利摘要】本发明公开了药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法。该鉴别方法包括DNA提取与对得到的DNA序列拼接两大步骤。其中DNA提取通过增加裂解加热的时间，并且用等体积的酚∶三氯甲烷(1∶1)去除酚及多糖类物质的干扰，得到了较好的提取效果。然后将所得到的DNA序列进行拼接后对秦艽进行鉴定，得到了较好的鉴别效果。
【专利说明】药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法。
【背景技术】
[0002]秦艽为传统常用中药，始载于《神农本草经》，列为“中品”，性平，味辛、苦，归胃、肝、胆经，根入药。传统中医认为其具有祛风湿、清湿热、止痹痛、退虚热的功效。随着现代医药学科技在化学成分，药理药效，临床应用等研究中的迅速发展，秦艽的药理作用被进一步发现，临床应用也越来越广泛。药理研究和临床应用表明，秦艽不仅在抗炎镇痛方面具有明显的作用，还可以调节免疫，抗感冒病毒，抑制念珠菌生长，对心脑血管及肝脏也具有一定的保护作用，对面瘫等神经系统疾病效果也很显著。大叶秦究Gentiana macrophyllaPal1.、粗莖秦究G.crassicaulis Duthie.、和麻花秦究G.straminea Maxim.这三种秦究为中国药典收载品种。
[0003]DNA条形码技术(DNA barcoding)是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段(DNA barcode)自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，它可以对物种进行快速的自动鉴定。DNA Barcoding的概念由加拿大Paul Hebert首次提出。Paul Hebert等有关研究表明，可以用线粒体基因(COI)作为一个标准片段来分辨动物界中的近缘物种，线粒体细胞色素c氧化酶亚基I (Cytochromeeoxdase I，C0I)是一个600bp的DNA序列。据此提出可以用单一的小片段基因来代表物种，这如同超市用以区分成千上万种不同商品的条形码，因此把这种小片段基因序列称作物种的DNA条形码(DNA barcodes)。DNA是生物的遗传信息的载体,遗传信息的不同，决定了生物的多样性。由于每种生物物种的DNA序列都是唯一的，这就给DNA条形码提供了物质基础，DNA每个位点上都有A、T、G、C4种选择，由于DNA序列中碱基的保守性，几十个碱基的长度不能提供足够的编码信息，所 以目前的DNA条形码分析都是基于几百个碱基长度的DNA序列。
[0004]PCR技术即无细胞分子克隆法:是指在微量离心管中，加入适量的缓冲液、模板DNA、四种脱氧单核苷酸、耐热性多聚酶以及一对合成DNA的引物，通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段组成一个循环，每一次循环使特异区段的基因拷贝数增长一倍，一般样品经过30-40次循环，最终使基因放大数百万倍，最终得到扩增了百万倍的特异区段的DNA的方法。这种技术由Kary B.Mullis (穆利斯(美))创建。在此之前Khorana (1971)等曾提出DNA在体外变性后，与适当引物杂交，再用DNA聚合酶延伸，克隆DNA的设想；1983年，Mullis发明了 PCR技术，使Khorana的设想得以实现；1988年Saiki等又将耐热DNA聚合酶(Taq)引入了 PCR技术，使PCR变得更加便捷、高效和经济；1989年美国《Scienee》杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首，曾有人比喻1989年为PCR的爆炸年，Mullis也因此荣获1993年度诺贝尔化学奖。PCR技术具有高度的灵敏性、特异性、操作简便易行的特点，可被用于基因克隆，基因检测，基因配型，基因鉴定等研究领域，从而逐渐而成为人类学研究、法医学检验、基因工程产品、基因治疗、基因诊断中的一种广泛性技术手段。PCR技术的兴起，无疑对DNA条形码鉴定带来了便利，利用了 PCR技术可对需要的目的片段进行扩增，继而进行测序等后续实验。
[0005]目前，DNA条形码已经在动物中得到广泛应用，它不仅可以对动物物种进行鉴定分类，还可以扩充物种的DNA条形码信息，并且可以发现新种和隐存种。其在植物中的研究也正在快速开展，这项技术对于非分类学专业工作者对有关材料进行快速、准确的鉴定，尤其是对于药材的鉴定带来了便捷。除此之外，植物DNA条形码技术还可以用于辨别食草动物日常取食材料、监测植物根系的空间分布格局、发现隐形物种、以及研究入侵植物。但是各种DNA片段在不同类群中的应用效果不同，目前仍未获得统一的植物条形码标准片段，可以运用于各物种的鉴别。因此，当前的研究热点仍然是寻找一种可能的条形码片段，可以进行更大规模的分析和整体评价。许多学者对此进行了积极深入的探索，目前也得出了多种条形码片段或组合方法，但至今仍未达成明确的共识。Kress等通过对核基因ITS 和 9 个质体基因片段(trnK_rpsl6、trnH-psbA、rpl36_rps8、atpB-rbcL、ycf6_psbM、trnV-atpE、trnC_ycf6、psbM-trnD和trnL-trnF)序列进行实验分析,提出了片段组合的方案，他认为ITS+trnH-psbA组合将在有花植物中得到广泛应用。在此之后Chase等提出 rpoCl+rpoB+matK 或 rpoCl+matK+trnH-psbA 片段组合；与此同时 K1-Joong Kim 等提出matK+atpF-atpH+psbK-psbI 或 matK+atpF-atpH+trnH-psbA 片段组合；Kress 和 Erickson同时提出rbcL+trnH-psbA可以对陆生植物进行识别和鉴定。国际植物条形码工作组(TheConsortium for the Barcode of Life Plant Working Group)推荐叶绿体基因 matK 和rbcL作为陆生植物的标准DNA条形码片段。
[0006]有关研究表明ITS (包含ITS2)序列和trnH-psbA序列对葫芦科植物种间鉴定的成功率高，rbcL也可用于种间鉴定，但成功率相对前两者较低。对于锦葵科植物的鉴别，ITS和psbA-trnH也是较适合的DNA条形码序列组合。谭丽盈等研究表明叶绿体基因rbcL序列可用于鉴别十大功劳及其伪品。秦民坚等亦用叶绿体rbcL基因对射干及类似药用植物基因序列进行了分析，结果表明叶绿体rbcL基因序列可以很好的鉴别5种鸢尾科植物。此法现今已经被用于中药秦艽的鉴别，张得钧等通过筛选表明ITS序列适合作秦艽基原植物的DNA分子鉴定，罗焜等已经将ITS2条形码直接用于药材秦艽的鉴别。而组合片段对中药秦艽的鉴别还未见报道，本研究即探索了适合用于秦艽药材的条形码组合片段。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是提供药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法。
[0008]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法，包括以下步骤:
[0009](I)取过60-80目筛的秦艽药材粉末加至离心管中，加入适量预热的Buffer PCB和巯基乙醇并混匀，65°C左右水浴加热35-45min，间或混匀；用等体积的酚:三氯甲烷(I: I)反复混匀，离心后取上清，反复操作2-3次；加入等体积的三氯甲烷，混匀后离心，吸取上层水相至一个干净的离心管中，加入等体积Buffer BD，混匀，再加等体积的无水乙醇，混匀后全部加入到吸附柱中，静置2-5min ;离心，再分别用适量PW Solution和Wash Solution离心，晾干；将吸附柱放入一个干净的离心管中，加入60°C左右预热的TEBuffer，静置一段时间后离心，即得DNA溶液；[0010](2)将提取的DNA序列进行PCR扩增与测序，得到ITS、psbA-trnH和rbcL序列，再将psbA-trnH和rbcL拼接，ITS、psbA-trnH和rbcL拼接,得到两条拼接序列，分别计算遗传距离，并构建系统发育树。
[0011]本发明的有益效果是:
[0012]目前中药DNA条形码研究多是从原植物叶片中提取DNA，但是在实际运用中，我们通常面对的是药材，这无疑为中药材的鉴定工作带来了不便，局限了 DNA用于中药鉴定的范围。本实验在按照Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒说明书基础上提取秦艽样品时，叶类样品中的DNA易于提出，条带清晰，但是药材DNA显示模糊或无条带显示，这可能是由于根类药材不易裂解，并且根类药材中含有多糖、多酚或者一些此生代谢产物干扰了 DNA的提取。针对这一问题，对有关提取步骤作出相应改变，秦艽药材DNA提取得到了较好的效果O
[0013]实验结果表明ITS、psbA_trnH和rbcL三种条形码单独用于秦究的分子鉴定,均存在一些缺陷，rbcL序列过于保守，psbA-trnH序列种间和种内遗传距离有重叠，而ITS序列虽可用作秦艽分子鉴定，其种内遗传距离与种间遗传距离十分接近，难以确保鉴定的准确性。为此，分别将psbA-trnH和rbcL两条序列拼接，将ITS、psbA_trnH和rbcL三条序列拼接，用于秦艽的鉴别，这两组拼接序列构建系统发育树的结构一致。且ITS的变异位点只有10个，而psbA-trnH+rbcL与ITS+psbA-trnH+rbcL变异位点分别为34个和44个，因此认为，组合序列建立的系统发育树，能更准确的表现秦艽的亲缘关系。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1本发明药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法实施例的部分样品的PCR产物检测结果(rbcL)。
[0015]图2是本发明药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法实施例的ITS序列系统树。
[0016]图3是本发明药典三种秦究药材的DNA条形码鉴别方法实施例的psbA-trnH+rbcL序列系统树。
[0017]图4是本发明药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法实施例的ITS+psbA-trnH+rbcL 序列系统树。
[0018]图5是本发明药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法实施例的和市场药材psbA-trnH+rbcL序列系统树。
[0019]图6是本发明药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法实施例的秦艽样品和市场药材ITS+psbA-trnH+rbcL序列系统树。
【具体实施方式】
[0020]I实验仪器与试药
[0021]1.1实验仪器
[0022]DDY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)，T196PCR扩增仪(德国Biometra)，GeCDOCXR凝胶成像系统(美国伯乐Bio-RAD)，HANGPINGJA3003N电子分析天平，KM-15200KUB0TA离心机，eppendorfCentrrfuge5417R超速冷冻离心机(德国eppendorf),国华HH-60数显恒温搅拌循环水箱，BCD-2181E冰箱(荣事达Royalstar) ,Panasonic NM-S553MF微波炉(上海松下微波炉有限公司)，KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，SAXXYO MDF-382E-80°C超低温冰箱(日本)，Aquapro艾科浦AYJ1-0501-U超纯水系统(颐洋企业发展有限公司)，LQP-B-4制冰机(六泉Anke)，PHOTOA干燥箱(上海一恒科技有限公司)，SK-1快速混匀器(国华)，TopPette手动单道可调式移液器(上海汉林实验仪器有限公司)；1.5mL，2.0mL离心管(生工生物工程(上海)有限公司)，PCR薄壁管及薄壁管盖(生工生物工程(上海)有限公司)，微量吸头(10 μ L，200 μ L，1000 μ L)(生工生物工程(上海)有限公司)。
[0023].1.2实验试剂
[0024]Ezup 柱式植物基因组 DNA 抽提试剂盒，5 X TBE，I X TE，DNA marker-D，Green-DNADye 核苷酸胶体染料,6 X Clyerol DNALoading Buffer 缓冲液,琼脂糖(AgaroseB.Low EE0)以上试剂均购于生工生物工程(上海)有限公司，Extaq酶(DRRooATaKaRa)，无水乙醇(AR国药集团化学试剂有限公司)，异丙醇(AR国药集团化学试剂有限公司)，三氯甲烧(AR上海振企化学试剂品有限公司)，β_巯基乙醇(Reanta Scientific TechnologyC0.LTD)，PCR扩增引物合成(生工生物工程(上海)有限公司)。
[0025].1.3样品及来源
[0026]样品来源见表2，其中獐牙菜由全国第四次中药资源普查舒城调查队提供，样品为从标本上取得叶片，其余样品均为秦艽药材采自四川省松潘县 。
[0027]表2样品来源
[0028]
【权利要求】
1.药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法，其特征在于包括以下步骤: (1)取过60-80目筛的秦艽药材粉末加至离心管中，加入适量预热的BufferPCB和β-巯基乙醇并混匀，65°C左右水浴加热35-45min，间或混匀；用等体积的酚:三氯甲烷(1: 1)反复混匀，离心后取上清，反复操作2-3次；加入等体积的三氯甲烷，混匀后离心，吸取上层水相至干净的离心管中，加入等体积Buffer BD,混匀，再加等体积的无水乙醇，混匀后全部加入到吸附柱中，静置2-5min ;离心，再分别用适量PW Solution和WashSolution离心，晾干；将吸附柱放入干净的离心管中，加入60°C左右预热的TE Buffer，静置后离心，即得DNA溶液； (2)将提取的DNA序列进行PCR扩增与测序，得到ITS、psbA-trnH和rbcL序列，再将psbA-trnH和rbcL拼接，ITS、psbA_trnH和rbcL拼接,得到两条拼接序列，分别计算遗传距离，并构建系统发育树。
【文档编号】C12Q1/68GK103509871SQ201310467652
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】方成武, 张明燕, 孟楣, 彭华胜, 马宗华, 黄璐琦, 刘守金, 杨青山, 李庆林 申请人:安徽中医药大学