一种植物磷素营养快速诊断和可视化动态监测方法及其重组表达载体的应用的制作方法【专利摘要】本发明公开了一种植物磷素营养快速诊断和可视化动态监测方法及其重组表达载体的应用。用特异地响应缺磷信号的启动子调控植物花青素合成途径基因表达的重组表达载体转化到植物中获得转基因植物，在磷素供应充足时，转基因植物叶片保持原有绿色；在磷素养分缺乏时，启动子特异的驱动花青素合成基因的过量表达，使转基因植物叶片上花青素大量积累，植物叶片变成深紫色；在重新供应充足磷素养分时，转基因植物可在短期内恢复绿色，从而达到可视化动态监测植物磷素养分的目的。本发明方法可灵敏而专一的监测植物体内磷素养分的动态变化，同时结合遥感技术的应用可实现大面积快速监测植物磷素养分供应状况，从而指导田间合理施肥。【专利说明】一种植物磷素营养快速诊断和可视化动态监测方法及其重组表达载体的应用【
技术领域：
】[0001]本发明属于基因工程【
技术领域：
】，涉及一种植物磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法及其重组表达载体的应用。【
背景技术：
】[0002]磷是植物生长发育过程中最为重要的大量矿质营养元素之一，广泛参与植物体内的能量转移、信号转导、生化合成等代谢过程[1，2]。然而由于磷在土壤中容易被固定和沉淀，且植物从土壤中吸收的主要是无机态正磷酸盐，因此相对于其他营养元素，磷在土壤中的移动性和有效性均很低，这也常常成为农田及自然生态系统中植物生长的主要限制因子之一[3-5]0[0003]施加磷肥是农业耕作系统中解决作物缺磷、提高产量和品质的重要手段。但是80%以上施加的磷肥被土壤矿物固定而不能被植物吸收利用。为了确保作物产量，农民通常在土壤中过度施加磷肥，这样极易造成土壤磷含量超标。过度施用的磷肥随着雨水的冲刷进入水体造成水体富营养化等生态环境污染问题[6]。另一方面，磷矿作为一种非可再生资源，按照目前的开采速度，世界上已探明的磷矿将趋于耗尽[7，8]。因此通过有效的生物技术手段，提高与完善磷肥的使用与管理，减少对不可再生磷资源的利用对于缓解磷资源的危机有重要意义。[0004]在磷素养分供应不足时，植物会出现矮化，生长发育不良，叶色深绿等表型，但这些表型往往出现在缺磷严重并已影响植物生长的情况下，而此时已经滞后于最佳的施肥时间。传统的定性分析磷素养分供应状况的方法是通过测定植株叶片可提取磷含量和土壤有效磷含量来指导施肥[9]。近年来我国大力推行地“测土配方施肥”项目就是以此为基础进行的。然而这种传统的生理检测方法需要破坏性采样，且高度依赖于实验条件和设备，需要专业人员操作，并不适用于大规模简单便捷的田间监测。[0005]随着生物技术的迅速发展，对植物缺磷信号转导途径的分子生物学研究将作物的缺磷诊断深入到了分子水平。将响应缺磷信号的基因启动子融合报告基因后转入受体植物，通过检测报告基因的表达指示植物磷素养分缺乏状况[10]。这一方法同时也应用于突变体筛选。常见的报告基因有三种:GUS(β-glucuronidase)、LUC(Luciferase)和各种荧光蛋白(FluorescentProtein)，如黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)[11]。虽然这些报告基因可灵敏的指示植物磷素养分状况，但是其测定仍然需要依赖于破坏性采样，复杂的实验操作和精密的实验仪器，同样无法实现大规模田间监测。此外由于这些报告基因大多来源于细菌基因组，其对植物体、人体及生态环境的影响具有一定的不确定性。[0006]花青素属于黄酮类物质亚家族，通常存在于植物细胞液泡中[12]。作为植物体内的一种天然色素，花青素可促进植物授粉、种子传播、防止紫外线对植物光合组织的侵害等；在人体内，适量的花青素可抗衰老、预防心脑血管疾病，保护肝脏健康。由于花青素具有吸光性，因此其在植物体内的积累可使植物组织呈现出红、紫、蓝等肉眼易辩的色彩。目前对花青素的研究应用主要集中在培育花卉新品种及研制抗氧化保健食品等领域[13]，将其作为可视的报告基因在生物技术工程领域的应用研究仍是空白。[0007]1.AbelS，TicconiCA,DelatorreCA(2002)Phosphatesensinginhigherplants.PhysiologiaPlantaruml15:1-8.[0008]2.RaghothamaKG(1999)Phosphateacquisition.AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology50:665-693.[0009]3.BarberSA(1980)Soil-plantinteractionsinthephosphorusnutritionofplants.Theroleofphosphorusinagriculture:591-615.[0010]4.HolfordI(1997)Soilphosphorus:1tsmeasurement,anditsuptakebyplants.AustralianJournalofSoilResearch35:227-240.[0011]5.TicconiCA，AbelS(2004)Shortonphosphate:plantsurveillanceandcountermeasures.Trendsinplantscience9:548-555.[0012]6.VanceCPjUhde-StoneCjAllanDL(2003)Phosphorusacquisitionanduse:criticaladaptationsbyplantsforsecuringanonrenewableresource.NewPhytologistl57:423-447.[0013]7.CordellDjDrangertJ-OjWhiteS(2009)Thestoryofphosphorus:Globalfoodsecurityandfoodforthought.GlobalEnvironmentalChangel9:292-305.[0014]8.VanVuurenDjBouwmanA,BeusenA(2010)Phosphorusdemandforthel970-2100period:ascenarioanalysisofresourcedepletion.GlobalEnvironmentalChange20:428-439.[0015]9.WalworthJ，SumnerM(1987)Thediagnosisandrecommendationintegratedsystem(DRIS).Advancesinsoilscience:Springer,pp.149-188.[0016]10.HammondJP，BennettMJjBowenHCjBroadleyMR,EastwoodDC,etal.(2003)ChangesingeneexpressioninArabidopsisshootsduringphosphatestarvationandthepotentialfordevelopingsmartplants.PlantPhysioll32:578-596.[0017]11.ChalfieM，TuYjEuskirchenGjWardWWjPrasherDC(1994)Greenfluorescentproteinasamarkerforgeneexpression.Science263:802-805.[0018]12.Andersen0M，JordheimM(2001)Anthocyanins.eLS:JohnWiley&Sons,Ltd.[0019]13.ForkmannG，MartensS(2001)Metabolicengineeringandapplicationsofflavonoids.CurrentOpinioninBiotechnologyl2:155-160.【
发明内容】[0020]本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种植物磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法。[0021]本发明的另一目的是以水稻磷酸盐转运蛋白基因0sPTl;6的启动子和花椰菜花青素合成基因Pr为例，提供缺磷特异诱导调控花青素合成的植物表达载体。[0022]本发明的技术问题可通过如下技术方案解决:[0023]一种植物磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法，用特异地响应缺磷信号的启动子调控植物花青素合成途径相关基因表达的重组表达载体转化到植物中获得转基因植物，在磷素供应充足时，转基因植物叶片保持原有绿色；在磷素养分缺乏时，响应缺磷信号的启动子特异的驱动花青素合成基因的过量表达，使转基因植物叶片上花青素大量积累，植物叶片变成深紫色；在重新供应充足磷素养分时，转基因植物可在短期内恢复绿色，从而达到快速诊断植物磷素营养状况，以及灵敏地可视化动态监测植物磷素养分的目的。[0024]本发明所述的植物磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法，优选将水稻磷酸盐转运蛋白基因0sPTl;6启动子(为特异地响应缺磷信号的启动子)特异调控花青素合成基因Pr的植物表达载体转化到植物中获得转基因植物，在磷素供应充足时，水稻磷酸盐转运蛋白基因0sPT6启动子无法驱动花青素合成基因Pr表达，转基因植物叶片保持原有的绿色；在磷素缺乏时水稻磷酸盐转运蛋白基因0sPT6启动子特异地驱动花青素合成基因Pr在植物叶片中过量表达，使转基因植物叶片上花青素大量积累，植物叶片变成深紫色；在重新供应充足磷素养分时，转基因植物可在短期内恢复绿色，从而达到快速诊断植物磷素营养状况，以及灵敏地可视化动态监测植物磷素养分的目的。[0025]其中，所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因0sPTl;6启动子特异调控花青素合成基因Pr的植物表达载体为重组表达载体PSlaG-3-0sPT6-Pr，是将0sPT6启动子和Pr基因分别插入到pSlaG-3表达载体的PacI,AscI和AscI,KpnI位点所得。[0026]本发明方法中，植物叶片颜色的变化通过肉眼观测或者高光谱遥感技术测定。[0027]当植物叶片颜色的变化采用高光谱遥感技术测定时，检测波段选自可见光、近红外或中红外波段，优选可见光波段，进一步优选554nm波长。[0028]本发明方法中，当植物叶片颜色的变化采用高光谱遥感技术测定时，当554nm波长的反射率在0.16以下时,表明植物体内可提取磷含量低于40mg/kg,为缺磷状态,此时需施加磷肥；当554nm波长的反射率高于0.16时，植物体内可提取磷含量高于40mg/kg，为磷充足状态，此时不需要施加磷肥。[0029]一种用于植物磷素营养快速可视化诊断的重组表达载体，含有水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPTl;6启动子以及花青素合成基因Pr，且所述的花青素合成基因Pr位于水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPTl;6启动子的下游，受水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPTl;6启动子特异调控。[0030]所述的重组表达载体优选以pSlaG-3质粒为出发质粒，在PacI,AscI酶切位点插入所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPTl;6启动子插入pSlaG-3表达载体的，在AscI,KpnI酶切位点插入所述的花青素合成基因Pr。[0031]所述的植物优选双子叶植物，进一步优选烟草。[0032]本发明所述的重组表达载体的构建方法，以水稻日本晴基因组DNA为模板，以引物0sPT6-G3-F/0sPT6-G3-R克隆得到所述的0sPT6启动子，以花椰菜叶片基因组DNA为模板，以引物Pr-G3-F/Pr-G3-R克隆得到所述的Pr基因，将其分别插入到克隆载体PMD19-T上，分别经PacI,AscI和AscI,KpnI双酶切后依次连接到pSlaG-3表达载体进行两次重组反应而得到。[0033]本发明所述的重组表达载体的构建方法，优选包含以下步骤:[0034]分别提取水稻日本晴和花椰菜基因组DNA，设计引物扩增水稻0sPT6启动子和花椰菜Pr基因片段，[0035]PT6启动子上游引物:[0036]PT6-G3-F:5’-TTAATTAATTCTTTGTTCTTCCTCCAGGCTTTC-3’(SEQIDN0.1)[0037]PT6启动子下游引物:[0038]PT6-G3-R:5’-GGCGCGCCGCCAGCTTAATTGCTTGCTTTGTGA-3’(SEQIDN0.2)[0039]Pr基因上游引物:[0040]Pr-G3-F:5’-GGCGCGCCATGGAGGGTATGTCCAAAGGGTT-3’(SEQIDN0.3)[0041]Pr基因下游引物:[0042]Pr-G3-F:5’-GGTACCTCAAGTTCCAGTTTCTCCATCCAA-3’(SEQIDN0.4)[0043]以水稻日本晴和花椰菜基因组DNA为模板进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到PMD19-T载体，得到0sPT6-T和Pr-T中间载体，转化入大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆对其质粒进行商业化测序，0sPT6启动子序列如SEQIDN0.5所示，花椰菜Pr基因片段序列如SEQIDN0.6所示。[0044]测序验证无误后，用PacI/AscI对0sPT6_T和pSlaG-3载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶定向连接，转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆质粒，得到pSlaG-3-0sPT6重组表达载体；再用Ascl/Kpnl对Pr-T和pSlaG-3_0sPT6表达载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶定向连接，转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆质粒，得到所述的重组表达载体，命名为pSlaG-3-0sPT6-Pr。[0045]本发明所述的重组表达载体在植物磷素养分状况的可视化动态监测中的应用。`[0046]本发明的有益效果:[0047]1、本发明在单子叶和双子叶植物中大量筛选响应植物缺磷信号的启动子和花青素合成基因，从中筛选到单子叶的水稻磷酸盐转运蛋白基因启动子0sPTl;6为缺磷响应启动子，其对缺磷的响应具有特异性和专一性，且在不同物种中具有功能的保守性；筛选到双子叶植物花椰菜的花青素合成途径调控基因关键基因Pr为可视化报告基因，其对多个物种的花青素合成调控途径基因具有保守的调控功能。[0048]2、本发明筛选到的OsPTl;6启动子和Pr基因均来自于植物体(分别来自于水稻和花椰菜)，不是外源基因，因此具有生物安全性。同时花青素作为天然的植物有益色素，其编码合成的花青素对植物体、人体及生态环境都不具有危害性；[0049]3、进一步优选双子叶植物烟草为转化体，其宽大的叶片便于肉眼观测，强大的生命力适用于不同环境区域种植。[0050]4、在此基础上构建了重组表达载体pSlaG-3-0sPT6_Pr，该重组表达载体转化入烟草基因组，在磷素缺乏时水稻磷酸盐转运蛋白基因0sPT6启动子特异地驱动花青素合成基因Pr在烟草叶片中过量表达，使烟草叶片上花青素大量积累，肉眼能够明显观测到烟草叶片变成深紫色；在重新供应充足磷素养分时，转基因烟草可在短期内恢复绿色，从而达到灵敏地可视化动态监测植物磷素养分的目的。[0051]5、本发明所构建的水稻磷酸盐转运蛋白基因0sPTl;6启动子特异调控花青素合成基因Pr的植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，获得缺磷特异表达Pr基因的新种质。[0052]6、对野生型和转基因烟草进行其他养分缺乏及非生物胁迫处理，与野生型相比，转基因烟草未发现肉眼可见的差异，表明该转基因烟草对植物磷素养分状况的指示具有特异性和专一性。[0053]7、应用高光谱遥感技术，波长为554nm的光谱反射率与所述的转基因烟草叶片花青素含量和磷含量均呈现出很好的指数相关性(R2=0.94)，可实现应用高光谱遥感技术大面积快速准确的动态检测植物磷素养分供应状况，从而指导农民合理施肥，提高磷肥利用效率，减少生产投入和环境污染的目的。[0054]8、应用高光谱遥感技术，在土壤环境中验证所述的转基因烟草对植物体内磷含量的指示获得良好效果。当554nm波长的反射率在0.16以下时，植物体内可提取磷含量低于40mg/kg,为缺磷状态,此时需施加磷肥；当554nm波长的反射率高于0.16时,植物体内可提取磷含量高于40mg/kg,为磷充足状态,此时不需要施加磷肥。【专利附图】【附图说明】[0055]图10sPT6基因启动子和Pr基因的琼脂糖凝胶电泳分析。其中1:0sPT6启动子；2:Pr基因；3:0sPT6-T质粒PacI和AscI双酶切；4:pSlaG-3-0sPT6质粒PacI和AscI双酶切；5:Pr-T质粒AscI和KpnI双酶切；6:pSlaG-3-0sPT6-Pr质粒AscI和KpnI双酶切。[0056]图2植物表达载体pSlaG-3-0sPT6-Pr构建方法示意图。[0057]图3野生型和转基因烟草的缺磷指示效果，其中WT:野生型；PT6pm-Pr:转基因烟草；(a):野生型和转基因烟草的缺磷表型；(b):野生型和转基因烟草不同叶位的缺磷表型；(C):野生型和转基因烟草缺磷条件下Pr基因的表达量；(d):野生型和转基因烟草不同叶位的花青素含量；(e):野生型和转基因烟草不同叶位的磷含量。[0058]图4转基因烟草对不同缺磷和恢复供磷时间的响应，其中d:缺磷天数；Rd:恢复供磷天数；红色箭头:第四位叶片；(a):不同缺磷和恢复供磷时间转基因烟草的表型；(b):不同缺磷和恢复供磷时间野生型和转基因烟草第四片叶子的花青素含量。[0059]图5转基因烟草对不同磷浓度的响应，其中红色箭头:第四位叶片；(a):不同磷浓度处理下转基因烟草的表型；(b):不同磷浓度处理下野生型和转基因烟草第四片叶子的花青素含量；(C):不同磷浓度处理下野生型和转基因烟草第四片叶子的磷含量。[0060]图6野生型和转基因烟草中磷含量与花青素含量的相关性，其中灰色公式为野生型烟草的指数相关性方程；黑色公式为转基因烟草的指数相关性方程。[0061]图7缺磷条件下野生型和转基因烟草中内源花青素合成调控基因的表达，(a):烟草中内源花青素合成调控相关基因，(b):缺磷条件下野生型和转基因烟草中内源花青素合成调控基因的相对表达量。[0062]图8缺乏氮、钾、铁及低温、盐、干旱胁迫条件下野生型和转基因烟草的表型。[0063]图9缺磷(OmMPi)和正常供磷(0.8mMPi)条件下野生型和转基因烟草在350-2500nm波长范围内的光谱反射率[0064]图10不同磷浓度梯度条件下野生型和转基因烟草在可见光(350-700nm)范围内的光谱反射率。图a~e为磷浓度分别为0nm、0.2nm、0.4nm、0.6nm、0.8nm下野生型和转基因烟草在可见光(350-700nm)范围内的光谱反射率，横坐标表示波长(nm)，纵坐标表示反射率。[0065]图11野生型和转基因烟草中磷含量与光谱反射率的相关性，其中灰色公式为野生型烟草的指数相关性方程；黑色公式为转基因烟草的指数相关性方程。[0066]图12在土壤环境中验证高光谱遥感预测转基因烟草磷含量的实用性，其中(a):施磷肥(+P)和不施磷肥(-P)土壤中野生型和转基因烟草的表型；(b):施磷肥(+P)和不施磷肥(-P)土壤中转基因烟草的叶片磷含量和光谱反射率的关系。【具体实施方式】[0067]实施例1.0sPT6启动子和Pr基因的克隆:[0068]I)基因组DNA的提取分别取自然条件下正常生长的水稻和花椰菜叶片，迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右样品，用液氮充分研磨转移至2ml离心管中，加入500μIDNA提取缓冲液后，充分涡旋混匀。65°C恒温水浴15-20min，每5min涡旋样品一次。添加500μI氯仿-异戍醇(比例24:1),摇床上慢速混匀10_15min。4°C,7500rpm离心15min。转移上清至新的1.5ml离心管中，用500μI的酚/氯仿(1:1)抽提I次，再用等体积的氯仿抽提一次。小心转移上清至新的1.5ml离心管，添加Iml无水乙醇，上下颠倒几次，放置-20°C下lOmin。7500rpm离心5min，沉淀DNA，弃去多余液体。用75%的乙醇洗涤DNA，弃去乙醇，空气中充分干燥。添加30-50μITER(TE+RNase,RNase终浓度50μg/ml)缓冲液溶解DNA。[0069]2)PCR引物设计与扩增用软件Primer5.0设计引物序列，在0sPT6启动子引物两端分别加上酶切位点PacI(TTAATTAA)和AscI(GGCGCGCC)，在Pr基因引物两端分别加上酶切位点AscI(GGCGCGCC)和KpnI(GGTACC)。[0070]PT6启动子上游引物:[0071]PT6-G3-F:5’-TTAATTAATTCTTTGTTCTTCCTCCAGGCTTTC-3’(SEQIDN0.1)[0072]PT6启动子下游引物:[0073]PT6-G3-R:5’-GGCGCGCCGCCAGCTTAATTGCTTGCTTTGTGA-3’(SEQIDN0.2)[0074]Pr基因上游引物:[0075]Pr-G3-F:5’-GGCGCGCCATGGAGGGTATGTCCAAAGGGTT-3’(SEQIDN0.3)[0076]Pr基因下游引物:[0077]Pr-G3-F:5’-GGTACCTCAAGTTCCAGTTTCTCCATCCAA-3’(SEQIDN0.4)[0078]PCR反应体系均为25μI:PCRBuffer2.5μ1，dNTPMix2μ1，上下游引物各Iμ1，模板Iμ1，Taq酶0.5μI,双蒸水17μI。[0079]PCR程序如下:94°C预变性4min，98°C变性10s，68°C复性延伸2min，30个循环后，720ClOmin,10°C保持。[0080]扩增的PCR产物通过质量比I%琼脂糖凝胶电泳检测，OsPT6启动子大小为2860bp，序列如SEQIDN0.5所示；Pr基因大小为1432bp，序列如SEQIDN0.6所示。[0081]实施例2.植物表达载体pSlaG-3-OsPT6-Pr的构建:[0082]I)0sPT6启动子和Pr基因中间载体的构建将OsPT6启动子和Pr基因的PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，将回收的片段分别与PMD19-T载体连接，酶连体系总体积?ομ1，包含5μI连接液，1μI的pMD19_T载体，3-4μI的PCR纯化产物，用水补足10μ1，然后16°C连接过夜；再转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中涂在含有100μg/mL安苄的LB固体培养基上生长12h-14h后，挑取阳性菌落进行DNA测序。将测序正确的菌液加入等体积体积比30%甘油于_70°C保存备用，分别获得含有OsPT6启动子序列和Pr基因全长序列的重组质粒，命名为OsPT6-T和Pr-T。[0083]2)0sPT6基因启动子特异调控Pr基因植物表达载体的构建用PacI和AscI双酶切0sPT6-T，将0sPT6启动子片段从中间载体切下，回收片段。同时用PacI和AscI双酶切表达载体pSlaG-3(EamensAL,BlanchardCL,DennisES，etal.AbidirectionalgenetrapconstructsuitableforT-DNAandDs-mediatedinsertionalmutagenesisinrice(OryzasativaL.)[J].Plantbiotechnologyjournal,2004，2(5):367-380.),回收剩余的线性片段，与从中间载体上切下的0sPT6启动子片段通过T4DNA连接酶定向连接。连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂在含有50μg/ml壮观霉素的LB固体培养基上生长12h后，挑取阳性克隆，经PacI和AscI酶切验证片段大小无误后(图1)，保存阳性克隆，构建的重组表达载体命名为pSlaG-3-0sPT6。同样的，用AscI和KpnI双酶切Pr-T，将Pr基因片段从中间载体切下，回收片段。同时用AscI和KpnI双酶切重组表达载体pSIaG-3-0sPT6，回收剩余的线性片段，与从中间载体上切下的Pr基因片段通过T4DNA连接酶定向连接。连接产物转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，涂在含有50μg/ml壮观霉素的LB固体培养基上生长12h后，挑取阳性克隆，经AscI和KpnI酶切验证片段大小无误后(图1)，保存阳性克隆，构建的二次重组表达载体命名为pSlaG-3-0sPT6-Pr(图2)。[0084]最后通过电击法将pSlaG-3-0sPT6_Pr质粒转化至农杆菌EHA105的感受态细胞中，涂在含有壮观霉素和链霉素均为50μg/ml的YEP固体培养基上生长48h后，挑取阳性菌落，提取质粒，经PacI/AscI和Ascl/Kpnl两个酶切体系验证无误后，菌液加入等体积30%甘油于-70°C保存，转基因备用。[0085]3)转基因烟草的获得将以上获得的转有PSlaG-3-0sPT6-Pr质粒的农杆菌，侵染烟草外植体，共培养2.5天后转入含50μg/ml潮霉素和250μg/ml羧苄青霉素的选择分化培养，每2周换一次培养基，3-6周后，将分化的小苗切下，转入含有50μg/ml潮霉素和250μg/ml羧苄青霉素的生根培养基中生根，2-4周后开盖炼苗转入营养土中培养至收获，得到Tl代转基因种子。[0086]3.1)各类常用培养基配方(IL)【权利要求】1.一种植物磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法，其特征在于用特异地响应缺磷信号的启动子调控植物花青素合成途径相关基因表达的重组表达载体转化到植物中获得转基因植物，在磷素供应充足时，转基因植物叶片保持原有绿色；在磷素养分缺乏时，响应缺磷信号的启动子特异的驱动花青素合成途径相关基因的过量表达，使转基因植物叶片上花青素大量积累，植物叶片变成深紫色；在重新供应充足磷素养分时，转基因植物可在短期内恢复绿色，从而达到快速诊断植物磷素营养状况，以及灵敏地可视化动态监测植物磷素养分的目的。2.根据权利要求1所述的植物磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法，其特征在于以水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPTl;6的启动子和花椰菜花青素合成基因Pr为例，提供缺磷特异诱导调控花青素合成的植物表达载体转化到植物中获得转基因植物，在磷素供应充足时，水稻磷酸盐转运蛋白基因0sPT6启动子无法驱动花青素合成基因Pr表达，转基因植物叶片保持原有的绿色；在磷素缺乏时水稻磷酸盐转运蛋白基因0sPT6启动子特异地驱动花青素合成基因Pr在植物叶片中过量表达，使转基因植物叶片上花青素大量积累，植物叶片变成深紫色；在重新供应充足磷素养分时，转基因植物可在短期内恢复绿色，从而达到快速诊断植物磷素营养状况，以及灵敏地可视化动态监测植物磷素养分的目的。3.根据权利要求1所述的植物磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法，其特征在于所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因0sPTl;6启动子特异调控花青素合成基因Pr的重组表达载体为重组表达载体pSlaG-3-0sPT6-Pr，是将0sPT6启动子和Pr基因分别插入到pSlaG_3表达载体的PacI，AscI和AscI，KpnI位点所得。4.根据权利要求1所述的植物磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法，其特征在于植物叶片颜色的变化通过肉眼观测或者高光谱遥感技术测定。5.根据权利要求1所述的植物磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法，其特征在于植物叶片颜色的变化采用高光谱遥感技术测定时，检测波段选自可见光、近红外或中红外波段，优选可见光波段，进一步优选554nm波长。6.根据权利要求5所述的植物磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法，其特征在于当554nm波长的反射率在0.16以下时，表明植物体内可提取磷含量低于40mg/kg，为缺磷状态，此时需施加磷肥；当554nm波长的反射率高于0.16时，植物体内可提取磷含量高于40mg/kg,为磷充足状态,此时不需要施加磷肥。7.一种用于植物磷素营养快速可视化诊断的重组表达载体，其特征在于含有水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPTl;6启动子以及花青素合成基因Pr，且所述的花青素合成基因Pr位于水稻磷酸盐转运蛋白基因0sPTl;6启动子的下游，受水稻磷酸盐转运蛋白基因0sPTl;6启动子特异调控；所述的重组表达载体优选以PSlaG-3质粒为出发质粒，在PacI/AscI酶切位点间插入所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPTl;6启动子,在Ascl/Kpnl酶切位点间插入所述的花青素合成基因Pr。8.权利要求7所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于以水稻日本晴基因组DNA为模板，以引物0sPT6-G3-F/0sPT6-G3-R克隆得到所述的0sPT6启动子，以花椰菜叶片基因组DNA为模板，以引物Pr-G3-F/Pr-G3-R克隆得到所述的Pr基因，将其分别插入到克隆载体PMD19-T上，分别经PacI/AscI和Ascl/Kpnl双酶切后依次连接到pSlaG-3表达载体进行两次重组反应而得到。9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于包含以下步骤:(1)设计两对特异性引物OsPT6-G3-F:SEQIDN0.1，OsPT6-G3-R:SEQIDN0.2，以及Pr-G3-F:SEQIDN0.3,Pr-G3-R:SEQIDN0.4；(2)以水稻日本晴基因组DNA为模板，OsPT6-G3-F和OsPT6_G3-R为引物，用高保真酶进行PCR反应，扩增OsPT6启动子，以花椰菜基因组DNA为模板，Pr_G3_F和Pr_G3_R为引物，用高保真酶进行PCR反应，扩增Pr基因片段；(3)分别将这两个PCR产物连接到pMD19-T载体，得到OsPT6_T和Pr-T中间载体，转化大肠杆菌感受态细胞，提取阳性克隆质粒进行测序验证；(4)测序验证无误后，用PacI/AscI对OsPT6_T和pSlaG_3载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶定向连接，转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆质粒，得到pSlaG-3-0sPT6重组表达载体；再用Ascl/Kpnl对Pr-T和pSlaG-3_0sPT6表达载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶定向连接，转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆质粒，得到所述的重组表达载体，命名为pSlaG-3-0sPT6-Pr。10.权利要求6所述的重组表达载体在植物磷素养分状况的可视化动态监测中的应用。`【文档编号】C12N15/84GK103509821SQ201310492155【公开日】2014年1月15日申请日期:2013年10月18日优先权日:2013年10月18日【发明者】徐国华,李依婷,顾冕申请人:南京农业大学