用于诊断和治疗实体癌的基于微小rna的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于诊断和治疗实体癌的新的方法和组合物。本发明也提供了鉴定肿瘤发生抑制剂的方法。
【专利说明】用于诊断和治疗实体癌的基于微小RNA的方法和组合物
[0001]本申请是申请号为200780005821.2、申请日为2007年1月3日、发明名称为“用于诊断和治疗实体癌的基于微小RNA的方法和组合物”的中国发明专利申请的分案申请。
[0002]发明人:CarloM.Croce, George A.Calin 和 Stefano Volinia
[0003]政府资助
[0004]本发明全部或部分由来自国立癌症研究所的项目基金P01CA76259，P01CA81534和P30CA56036资助。政府具有本发明的某些权利。
[0005]发明背景
[0006]癌症(恶性细胞的不受控生长)是现代医学纪元的一个主要健康问题，也是发达国家主导死因之一。在美国，四分之一的死亡由癌症造成(Jemal, A.等人，CA CancerJ.Clin.52:23-47(2002))。在癌症中，称作实体癌的源自器官和实体组织的癌症(例如结肠癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，前列腺癌，胰腺癌)属于最常鉴定的人癌症。
[0007]例如，前列腺癌是工业化国家男性中最常诊断出的非皮肤恶性肿瘤，在美国，八名男性中有一名会在他的生命中发 生前列腺癌(Simard, J.等人，Endocrinologyl43 (6):2029-40(2002))。在最近的数十年中，前列腺癌的发病率已经急剧增加，前列腺癌现在是美国和西欧的主导死因(Peschel, R.E.J.ff.Colberg, Lancet4:233-41 (2003) ; Nelson, ff.G.等人，N.Engl.J.Med.349(4):366-81 (2003))。具有前列腺癌的男性的寿命预期平均减少了40%。如果在转移和局部扩散超过包膜之前早期检测到，前列腺癌经常可以治愈(例如使用手术)。但是，如果在从前列腺扩散和转移后诊断出来，前列腺癌通常是具有低治愈率的致命疾病。尽管基于前列腺特异性抗原(PSA)的筛选已经辅助前列腺癌的早期诊断，它既不是高灵敏度的，也不是特异性的(Punglia等人，N.Engl.J.Med.349(4): 335-42 (2003))。这意味着，该测试伴随着高百分比的假阴性和假阳性诊断。结果是许多情况下癌症被漏诊和对没有癌症的那些人的不必要的随访活检。
[0008]乳腺癌仍然是妇女中癌症相关性死亡的第二大病因，在美国其每年影响着超过180，000名妇女。对于北美的妇女，一生中患乳腺癌的概率现在为八分之一。尽管BRCA1和BRCA2的发现在鉴定参与乳腺癌的关键遗传因素中是非常重要的步骤，但已逐渐清楚BRCA1和BRCA2的突变只解释部分对乳腺癌的遗传易感性(Nathanson，K.L.,等人，Human Mol.Gen.10 (7): 715-720 (2001) ; Anglican Breast Cancer StudyGroup.Br.J.Cancer83 (10): 1301-08 (2000);和 Syr jakoski, K.，等人，J.Natl.CancerInst.92:1529-31 (2000))。尽管对乳腺癌的治疗进行了大量研究，但乳腺癌仍然难以有效地诊断和治疗，并且在乳腺癌患者中观察到的高死亡率表明该疾病的诊断、治疗和预防需要改进。
[0009]除外皮肤癌，结肠直肠癌是在美国和加拿大第三最常诊断出的癌症(在女性中，位于肺癌和乳腺癌之后，在男性中，位于肺癌和前列腺癌之后)。美国癌症学会估计，在2005年美国将有约145，000例新诊断出的的结肠直肠癌病例(Cancer Facts andFigures2005.Atlanta, GA:American Cancer Society,2005.可从 www.cancer, org/docroot/STT/stt_0.asp获得，2005年12月19日访问)。结肠直肠癌是美国和加拿大男性和女性癌症死亡的第二大原因(次于肺癌)。
[0010]2004年美国胰腺癌的年发病率几乎等同于年死亡率，分别估计为31，860和31, 270(Cancer Facts and Figures2004.Atlanta,GA:American Cancer Society,2004.可从 www.cancer, org/docroot/ STT/stt_0_2004.asp 获得,2005 年 8 月 21 日访问)。具有局部进展和转移性胰腺癌的患者具有较差的预后，诊断通常对于治疗性手术或放疗而言发生得太迟(Burr，Η.A.，等人，The OncologistlO (3): 183—190, (2005))。化疗可以为有些晚期胰腺癌患者提供症状的缓解，但是迄今为止它对存活率的影响不大。
[0011]在美国，每年有超过20，000人被诊断出胃癌。美国癌症学会估计，在2004年美国将有22，710例新诊断出的的胃癌病例(Cancer Facts and Figures2004.Atlanta,GA: American Cancer Society, 2004.可从www.cancer.0rg/docroot/STT/stt_0_2004.asp获得，2005年8月21日访问)。因为胃癌可以无症状地发生，到诊断作出时其可能已经是晚期。那时治疗旨在使患者更舒服和提高生命质量。
[0012]在世界范围内，肺癌造成比任何其它形式的癌症更多的死亡(Goodman，G.E.，Thorax57:994-999 (2002))。在美国，肺癌是男性和女性癌症死亡的主要原因。在2002年，肺癌死亡率估计是134，900例，超过乳腺癌、前列腺癌和结肠癌的总和。相同出处。肺癌也是所有欧洲国家癌症死亡的主要原因，肺癌-相关死亡的数目在发展中国家也快速增加。
[0013]无论在诊断时的疾病阶段，所有肺癌患者的五年生存率仅是约13%。这与在该疾病仍然在局部时检测出的病例的46%的五年生存率形成对比。但是，在该疾病已经扩散之前，仅16%的肺癌被发现。早期检测是困难的，因为在该疾病已经达到晚期之前经常观察不到临床症状。尽管对该癌症和其它癌症的治疗进行了研究，肺癌仍然难以有效地诊断和治疗。
[0014]显然，负责对特定形式的实体癌(例如前列腺癌，乳腺癌，肺癌，胃癌，结肠癌，胰腺癌)的易感性的标记和基因的`鉴定，是今天肿瘤学面临的主要挑战之一。需要鉴定早期检测具有对癌症的遗传易感性的个体的方法，以便可以为癌症的早期检测和治疗制定更有力的筛选和干预方案。癌基因也可以揭示可以被操纵的关键分子途径(例如使用小或大分子量药物)，且可以导致更有效的治疗，无论在首次诊断出特定癌症时的癌症阶段。
[0015]微小RNA是通过与信使RNA(mRNA)靶杂交并引发对它的翻译抑制或较不常见地引起其降解来控制基因表达的一类小的非编码RNA。miRNA的发现和研究已揭示在生物发育和各种细胞过程例如细胞分化、细胞生长和细胞死亡中发挥重要作用的miRNA介导的基因调控机制(Cheng，Α.Μ.，等人，Nucleic Acids Res.33:1290-1297 (2005))。近年来的研究表明，特定miRNA的异常表达可参与人的疾病,例如神经障碍(Ishizuka, A.，等A, Genes Dev.16:2497-2508 (2002))和癌症。具体地，已在人慢性淋巴细胞性白血病中发现 miR-16-l 和 / 或 miR-15a 的不当表达(Calin, G.A.,等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.99:15524-15529 (2002))。
[0016]显然，本领域非常需要改进的检测和治疗实体癌(例如前列腺癌，乳腺癌，肺癌，胃癌，结肠癌，胰腺癌)的方法。本发明提供了用于诊断和治疗实体癌的新的方法和组合物。
[0017]发明概述
[0018]本发明部分地基于在特定实体癌中具有改变的表达水平的特定miRNA的鉴定。[0019]因此，本发明包括诊断受试者是否患有实体癌或处于发生实体癌的风险中的方法。根据本发明的方法，将受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平与对照样品中的相应的miR基因产物的水平相比较。与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中所述miR基因产物的水平的改变(例如增加，降低)，指示着受试者患有实体癌或处于发生实体癌的风险中。所述实体癌可以是源自器官和实体组织的任意癌症。在某些实施方案中，所述实体癌是胃癌，乳腺癌，胰腺癌，结肠癌，肺癌或前列腺癌。在具体实施方案中，所述实体癌不是乳腺癌，肺癌，前列腺癌，胰腺癌或胃肠癌。
[0020]在一个实施方案中，在测试样品中测量的至少一种miR基因产物选自:miR_21,miR-191，miR-17-5p和其组合。在另一个实施方案中，在测试样品中测量的至少一种miR基因产物选自:miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b_2，miR-223, miR_128b，miR-199a_l，miR-24-1，miR-24-2,miR-146,miR-155,miR-181b-l，miR_20a，miR-107, miR-32, miR-92-2,miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a 和其组合。
[0021]在一个实施方案中，所述实体癌是乳腺癌或肺癌，且在测试样品中测量的至少一种miR基因产物选自:miR-210，miR-213和其组合。
[0022]在另一个实施方案中，所述实体癌是结肠癌，胃癌，前列腺癌或胰腺癌，且在测试样品中测量的至少一种miR基因产物是miR-218-2。
[0023]在一个特定实施方案中，所述实体癌是乳腺癌，且在测试样品中测量的至少一种miR基因产物选自:miR-125b-l, miR-125b_2，miR-145, miR-21和其组合。在一个相关实施方案中，所述实体癌是乳腺癌，且测试样品中的至少一种miR基因产物选自:miR-21，miR-29b-2, miR-146, miR-125b_2， miR-125b_l， miR-10b, miR-145, miR_181a， miR-140,miR-213，miR_29a prec，miR-181b_l，miR_199b，miR-29b_l，miR-Ι30a，miR-155,let_7a_2，miR-205, miR_29c，miR-224, miR-100, miR-31, miR_30c，miR-17_5p，miR-210, miR_122a，miR-16-2和其组合。
[0024]在另一个实施方案中，所述实体癌是结肠癌，且测试样品中的至少一种miR基因产物选自:miR-24-l，miR-29b_2，miR-20a, miR-10a, miR-32, miR-203, miR_106a，miR-17_5p， miR_30c， miR-223, miR-126*, miR-128b, miR-21, miR-24-2, miR_99b prec,miR-155, miR-213, miR-150, miR-107, miR-191, miR-221, miR-9-3 和其组合。
[0025]在另一个实施方案中，所述实体癌是肺癌，且测试样品中的miR基因产物选自:miR-21, miR-205, miR_200b， miR-9-1, miR-210, miR-148, miR-141, miR-132, miR-215,miR-128b, let_7g, miR-16-2, miR-129-l/2prec, miR-126*, miR-142-as, miR_30d,miR-30a_5p，miR-7-2, miR-199a_l, miR-127, miR_34a prec, miR_34a, miR-136, miR-202,miR-196-2, miR-199a_2, let_7a_2，miR-124a_l，miR-149, miR-17_5p，miR-196-lprec,miR-lOa, miR_99b prec, miR-196-1, miR_199b，miR-191, miR-195, miR-155 和其组合。
[0026]在另一个实施方案中，所述实体癌是胰腺癌，且在测试样品中测量的至少一种miR基因产物选自:miR-103-l, miR-103-2, miR-155, miR-204和其组合。在一个相关实施方案中，所述实体癌是胰腺癌，且测试样品中的miR基因产物选自:miR-103-2，miR-103-1, miR-24-2, miR-107, miR-100, miR-125b_2，miR-125b_l，miR-24-1, miR-191,miR-23a, miR-26a_l， miR-125a, miR-130a, miR_26b， miR-145, miR-221, miR-126*,miR-16-2, miR-146, miR-214, miR_99b, miR_128b, miR-155, miR-29b_2, miR_29a, miR-25,miR-16-1，miR_99a，miR-224，miR_30d，miR-92—2，miR-199a_l，miR-223，miR_29c，miR_30b，miR-129-1/2, miR-197, miR-17_5p，miR_30c，miR-7-1, miR-93-1, miR-140, miR-30a_5p，miR-132, miR-181b_l， miR_152prec， miR_23b， miR_20a， miR-222, miR_27a， miR-92-1,miR-21, miR-129-l/2prec，miR-150, miR-32, miR_106a，miR-29b_l 和其组合。
[0027]在另一个实施方案中，所述实体癌是前列腺癌，且测试样品中的miR基因产物选自:let_7d, miR-128a prec, miR-195, miR-203, let-7a-2prec, miR_34a, miR_20a，miR-218-2, miR_29a，miR-25, miR-95, miR-197, miR-135-2, miR-187, miR-196-1, miR-148,miR-191, miR-21, let_7i，miR-198, miR-199a_2，miR_30c，miR-17_5p，miR-92-2, miR-146,miR-181b_lprec， miR-32， miR-206, miR_184prec， miR_29a prec, miR-29b_2， miR-149,miR-181b-l， miR-196-lprec， miR-93-1, miR-223, miR-16-1, miR-101-1, miR-124a_l，miR-26a-l，miR-214, miR_27a，miR-24-1, miR_106a，miR-199a_l 和其组合。
[0028]在另一个实施方案中，所述实体癌是胃癌，且测试样品中的miR基因产物选自:miR-223, miR-21, miR-218-2, miR-103-2, miR-92-2, miR-25, miR-136, miR-191, miR-221,miR-125b-2, miR-103-1, miR-214, miR-222, miR-212prec, miR-125b_l，miR-100, miR-107,miR-92-1, miR-96, miR-192, miR_23a，miR-215, miR-7-2, miR-138-2, miR-24-1, miR_99b,miR-33b, miR-24-2 和其组合。
[0029]使用本领域技术人员众所周知的众多技术(例如，定量或半定量RT-PCR，RNA印迹分析，溶液杂交检测)，可以测量至少一种miR基因产物的水平。在一个具体的实施方案中，如下测量至少一种miR基因产物的水平:从获自受试者的测试样品逆转录RNA，以提供一组靶寡脱氧核苷酸，使所述靶寡脱氧核苷酸与一种或多种miRNA-特异性探针寡核苷酸杂交(例如，与包含几种miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交)，以提供测试样品的杂交谱，并对比测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱。测试样品中至少一种miRNA的信号相对于对照样品的变化指示着受试者患有实体癌或处于发生实体癌的风险中。在一个特定实施方案中，使靶寡核苷酸与包含针对选自下述的一种或多种miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交:miR-21，miR-17-5p，miR-191，miR-29b-2，miR-223，miR-128b，miR-199a-l, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b_l， miR_20a, miR-107,miR-32, miR-92-2, miR-214, miR_30c，miR-25, miR-221, miR_106a 和其组合。
[0030]本发明也包括抑制患有或被怀疑患有实体癌(例如前列腺癌，胃癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，结肠癌)的受试者的肿瘤发生的方法，其中受试者癌细胞中的至少一种miR基因产物失调(例如，减量调节，增量调节)。当至少一种分离的miR基因产物在癌细胞中减量调节时，该方法包括，施用有效量的分离的miR基因产物、分离的变体或miR基因产物或变体的生物活性片段，从而抑制受试者中癌细胞的增殖。在另一个实施方案中，所述至少一种分离的miR基因产物选自:miR-145，miR-155，miR-218-2和其组合。在一个特定的实施方案中，所述miR基因产物不是miR-15a或miR-16-l。当至少一种分离的miR基因产物在癌细胞中增量调节时，该方法包括，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制所述至少一种miR基因产物的表达的化合物(在本文中称作〃抑制miR表达的化合物")，从而抑制受试者中癌细胞的增殖。在一个特定的实施方案中，所述至少一种抑制miR表达的化合物对选自下述的 miR 基因产物是特异性的:miR-21，miR-17_5p，miR-191, miR-29b_2，miR-223,miR-128b, miR-199a_l, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b_l， miR_20a,miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR_30c，miR-25, miR-221, miR_106a 和其组合。
[0031]在一个相关实施方案中，抑制受试者中肿瘤发生的方法另外包括下述步骤:测定受试者癌细胞中至少一种miR基因产物的量，并将细胞中miR基因产物的水平与对照细胞中相应的miR基因产物的水平相对比。如果癌细胞中miR基因产物的表达失调(例如，减量调节，增量调节)，该方法另外包括，改变在癌细胞中表达的所述至少一种miR基因产物的量。在一个实施方案中，在癌细胞中表达的miR基因产物的量小于在对照细胞(例如多个对照细胞)中表达的miR基因产物的量，并将有效量的减量调节的miR基因产物、分离的变体或miR基因产物或变体的生物活性片段施用给受试者。适用于该实施方案的miR基因产物包括miR-145，miR-155，miR-218-2和其组合，以及其它。在一个特定的实施方案中，所述miR基因产物不是miR-15a或miR-16-l。在另一个实施方案中，在癌细胞中表达的miR基因产物的量大于在对照细胞(例如多个对照细胞)中表达的miR基因产物的量，并将有效量的至少一种用于抑制所述至少一种增量调节的miR基因产物的表达的化合物施用给受试者。适用于抑制所述至少一种miR基因产物的表达的化合物包括、但不限于，抑制miR-21，miR-17-5p, miR-191, miR-29b_2，miR-223, miR_128b，miR-199a_l，miR-24-1, miR-24-2,miR-146, miR-155, miR-181b_l, miR_20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR_30c,miR-25, miR-221, miR-106a和其组合的表达的化合物。
[0032]本发明另外提供了用于治疗实体癌(例如前列腺癌，胃癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，结肠癌)的药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种分离的miR基因产物和药学上可接受的载体。在一个特定的实施方案中，所述至少一种miR基因产物对应于在癌细胞中的表达水平比在对照细胞中降低的miR基因产物。在某些实施方案中，所述分离的miR基因产物选自:miR-145，miR-155, miR-218-2和其组合。
[0033]在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种抑制miR表达的化合物和药学上可接受的载体。在一个特定的实施方案中，所述至少一种抑制miR表达的化合物对在癌细胞中的表达大于在对`照细胞中的表达的miR基因产物是特异性的。在某些实施方案中，所述抑制miR表达的化合物对选自下述的一种或多种miR基因产物是特异性的:miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b_2，miR-223, miR_128b，miR-199a_l，miR-24-1,miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b_l，miR_20a，miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214,miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a 和其组合。
[0034]本发明也包括鉴定肿瘤发生抑制剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂，和测量细胞中至少一种miR基因产物的水平。在一个实施方案中，该方法包括，给细胞提供测试试剂，和测量与实体癌(例如前列腺癌，胃癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，结肠癌)中降低的表达水平有关的至少一种miR基因产物的水平。与合适的对照细胞相比，所述细胞中所述miR基因产物的水平的增加，指示着测试试剂是肿瘤发生抑制剂。在一个特定的实施方案中，所述与实体癌细胞中降低的表达水平有关的至少一种miR基因产物选自:miR-145，miR-155,miR-218-2和其组合。
[0035]在其它实施方案中，该方法包括，给细胞提供测试试剂，和测量与实体癌中增加的表达水平有关的至少一种miR基因产物的水平。与合适的对照细胞相比，所述细胞中所述miR基因产物的水平的降低，指示着测试试剂是肿瘤发生抑制剂。在一个特定的实施方案中，所述与实体癌细胞中增加的表达水平有关的至少一种miR基因产物选自:miR-21，miR-17-5p, miR-191, miR-29b_2，miR-223, miR_128b，miR-199a_l，miR-24-1, miR-24-2,miR-146, miR-155, miR-181b_l, miR_20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR_30c,miR-25, miR-221，miR-106a 和其组合。
[0036]附图简述
[0037]本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。含有彩色附图的本专利或专利申请公开的拷贝将在提出请求并支付必要的费用后由官方提供。
[0038]图1描述了代表6种实体癌(顶部)和相应的正常组织的540个样品的聚类分析。在树中包括的miRNA (n=137)代表着其表达水平(减去背景的强度)高于至少50%的分析样品中的阈值(256)的那些。阵列以中位值为中心，并使用Gene Cluster2.0标准化。使用非中心化的关联度量，进行平均关联聚类。颜色指示着每个样品中的微小RNA的表达水平与中位值的差异。
[0039]图2描述了微小RNA表达数据的非监督分析。过滤涵盖乳腺、结肠、肺、胰腺、前列腺和胃(正常组织和肿瘤)的540个样品(在图顶部标明)的微小RNA谱，定中心，并对每个特征标准化。在样品(水平方向)和特征(垂直方向)上对数据进行分级聚类，以平均关联和皮尔森关联作为相似性度量。样品名称指示在图的顶部，miRNA名称在左侧。探针ID指示在括号中，因为相同的微小RNA可以用不同的寡核苷酸测量。颜色指示着每个样品中的微小RNA的表达水平与中位值的差异。
[0040]图3描述了实体癌(顶部)之间差异调节的miRNA的表达。代表了在至少90%的组织实体癌中存在的61种微小RNA(图右侧)。树显示了在log2转化后每个列出的微小RNA的平均绝对表达值。对来自相同组织或肿瘤组织型的所有样品，计算平均值。以基因的平均值为中心，并使用Gene Clusterf.0标准化。使用欧几里德距离法，进行平均关联聚类。
[0041]图4描述了在至少75%的实体瘤中存在的miRNA的表达的倍数变化，其中与正常样品相比，在不同癌样品(顶部)中的至少1个肿瘤绝对值高于2。树显示了平均倍数变化(癌症相对于正常)的log2转化。对来自相同组织或肿瘤组织型的所有样品，计算平均值。以阵列的平均值为中心，并使用Gene Cluster2.0标准化。使用非中心化的关联度量，进行平均关联聚类。
[0042]图5描述了在至少50%的实体瘤的特征中存在的miRNA的表达的倍数变化(癌症相对于正常样品)。树显示了平均倍数变化(癌症相对于正常)的log2转化。对来自相同组织或肿瘤组织型的所有样品，计算平均值。以阵列的平均值为中心，并使用GeneCluster2.0标准化。使用非中心化的关联度量，进行平均关联聚类。
[0043]图6A描述的条形图指示了编码癌蛋白的不同基因的3’ UTR使得能通过微小RNA实现癌调节。将萤火虫萤光素酶表达的相对阻遏(倍数变化)相对于花虫萤光素酶对照标准化。PLAG1，多形腺瘤基因1;TGFBR2，转化生长因子β受体II; Rb，视网膜母细胞瘤基因。pGL-3 (Promega)用作空载体。miR-20a，miR-26a_l 和 miR-106 寡 RNA (有义，混杂)用于转染。在下图中显示了使用每个靶mRNA的突变版本(其缺少5’miRNA-末端互补位点(MUT))作为对照的第二个实验。所有实验一式三份地进行2遍(n=6)。
[0044]图6B描述的蛋白印迹表明，在某些癌症(例如肺癌，乳腺癌，结肠癌，胃癌)中，RBl(Rb)蛋白的水平表现出与miR-106a表达水平的负相关。β -肌动蛋白用作标准化的对照。N1，正常样品；T1和T2，肿瘤样品。 [0045]图7描述的RNA印迹显示了与正常样品相比乳腺癌样品(P系列和编号系列)中miR-145的减量调节(顶部)和miR-21表达的增量调节(底部)。用U6-特异性的探针进行标准化。
[0046]图8描述的RNA印迹显示了与正常样品(K系列)相比，不同内分泌胰腺癌样品(WDET,分化良好的胰腺内分泌肿瘤，WDEC，分化良好的胰腺内分泌癌，和ACC，胰腺腺泡细胞癌)中miR-103的增量调节和miR-155的减量调节(顶部)表达，以及与正常样品(K系列)和不分泌的/无功能的(NF-系列)样品相比，胰岛素瘤(F系列)中miR-204(底部)表达的增量调节。使用对5S RNA特异性的探针，进行标准化。
[0047]发明详述
[0048]本发明部分地基于，与正常的对照细胞相比，在与不同实体癌如结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌有关的癌细胞中的表达发生改变的特定miRNA的鉴定。
[0049]如本文中互换使用的，〃miR基因产物，〃〃微小RNA，〃〃miR，〃或"miRNA"是指来自miR基因的未加工的(例如前体)或加工过的(例如成熟的)RNA转录物。由于miR基因产物不翻译成蛋白，术语"miR基因产物〃不包括蛋白。未加工的miR基因转录物也称作"miR前体〃或"miRprec"，通常包含长度为约70-100个核苷酸的RNA转录物。miR前体可以用RNA酶(例如，Dicer，Argonaut,或RNA酶III (例如，大肠杆菌RNA酶III))消化加工成有活性的19-25个核苷酸的RNA分子。该有活性的19-25个核苷酸的RNA分子也称作〃加工过的"miR基因产物或〃成熟的"miRNA。
[0050]所述有活性的19-25个核苷酸的RNA分子可以通过天然加工途径(例如，使用完整细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如，使用分离的加工酶，例如分离的Dicer，Argonaut,或RNA酶III)从miR前体得到。应当理解，所述有活性的19-25个核苷酸的RNA分子也可以通过生物或化学合成直接生成，不从miR前体加工。当在本文中用名称提及微小RNA时，该名称对应着前体和成熟形式两者，除非另有说明。
[0051]表la和lb描述了特定的前体和成熟人微小RNA的核苷酸序列。
[0052]表la-人微小RNA前体序列
[0053]
【权利要求】
1.诊断受试者是否患有实体癌或处于发生实体癌的风险中的方法，其包括，测量来自受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，其中与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中所述miR基因产物的水平的改变，指示着受试者患有实体癌或处于发生实体癌的风险中。
2.权利要求1的方法，其中所述至少一种miR基因产物选自:miR-21，miR-191,miR-17-5p和其组合。
3.权利要求1的方法，其中所述至少一种miR基因产物选自:miR-21，miR-17-5p，miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR_128b， miR-199a_l, miR-24-1， miR-24-2， miR-146,miR-155, miR-181b_l, miR_20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR_30c, miR-25,miR-221, miR-106a 和其组合。
4.权利要求1的方法，其中所述实体癌选自:前列腺癌，胃癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌和结肠癌。
5.权利要求1的方法，其中所述实体癌是乳腺癌或肺癌，且所述至少一种miR基因产物选自:miR-210，miR-213和其组合。
6.权利要求1的方法，其中所述实体癌是结肠癌，胃癌，前列腺癌，或胰腺癌，且所述至少一种miR基因产物是miR-218-2。
7.权利要求1的方法，其中所述实体癌是乳腺癌，且所述至少一种miR基因产物选自:miR-125b-l, miR125b_2，miR-145, miR-21 和其组合。
8.权利要求1的方法，其中所述实体癌是胰腺癌，且所述至少一种miR基因产物选自:miR-103-l, miR-103-2，miR-155, miR-204 和其组合。
9.权利要求1的方法，其中所述实体癌和所述至少一种miR基因产物选自:(i)所述实体癌是乳腺癌，且所述miR基因产物选自:miR-21，miR-29b_2，miR-146,miR-125b_2, miR-125b_l, miR-10b, miR-145, miR_181a, miR-140, miR-213, miR_29a prec,miR-181b_l, miR_199b, miR-29b_l, miR_130a, miR-155, let_7a_2， miR-205, miR_29c,miR-224, miR-100, miR-31，miR_30c，miR-17_5p，miR-210, miR_122a，miR-16-2 和其组合;(ii)所述实体癌是结肠癌，且所述miR基因产物选自:miR-24-l，miR-29b-2，miR-20a，miR-10a, miR-32, miR-203, miR_106a，miR-17_5p，miR_30c，miR-223, miR-126*，miR_128b,miR-21,miR-24-2,miR-99b prec,miR-155,miR-213,miR-150,miR-107,miR-191,miR-221,miR-9-3和其组合；(iii)所述实体癌是肺癌，且所述miR基因产物选自:miR-21,miR-205, miR_200b,miR-9-1, miR-210, miR-148, miR-141, miR-132, miR-215, miR_128b，let_7g，miR-16-2,miR-129-l/2prec, miR-126*, miR-142-as, miR_30d, miR-30a_5p, miR-7-2, miR-199a_l,miR-127, miR_34a prec, miR_34a, miR-136, miR-202, miR-196-2, miR-199a_2, let-7a_2,miR-124a_l, miR-149, miR-17_5p, miR-196-lprec, miR-10a, miR_99b prec, miR-196-1,miR-199b, miR-191, miR-195, miR-155 和其组合;(iv)所述实体癌是胰腺癌，且所述miR基因产物选自:miR-103-2，miR-103-l,miR-24-2, miR-107, miR-100, miR-125b_2， miR-125b_l， miR-24-1, miR-191, miR_23a,miR-26a_l， miR-125a, miR-130a, miR_26b， miR-145, miR-221, miR-126*, miR-16-2,miR-146, miR-214, miR_99b，miR_128b，miR-155, miR-29b_2，miR_29a，miR-25, miR-16-1，miR-99a, miR-224, miR_30d, miR-92-2, miR-199a_l, miR-223, miR_29c, miR_30b,miR-129-1/2, miR-197, miR-17_5p, miR_30c, miR-7-1, miR-93-1, miR-140, miR-30a_5p,miR-132, miR-181b_l, miR-152prec, miR_23b, miR_20a, miR-222, miR_27a, miR-92-1,miR-21, miR-129-l/2prec, miR-150, miR-32, miR_106a, miR-29b_l 和其组合;(v)所述实体癌是前列腺癌，且所述miR基因产物选自:let-7d,miR-128a prec,miR-195, miR-203,let_7a_2prec，miR_34a，miR-20a,miR-218-2,miR-29a,miR-25,miR-95,miR-197, miR-135-2, miR-187, miR-196-1, miR-148, miR-191, miR-21, let_7i, miR-198,miR-199a_2，miR_30c，miR-17_5p，miR-92-2, miR-146, miR-181b-lprec, miR-32, miR-206,miR-184prec,miR-29a prec,miR-29b_2，miR-149，miR-181b_l，miR-196-lprec，miR-93-1,miR-223, miR-16-1, miR-101-1，miR-124a_l，miR-26a_l，miR-214, miR_27a，miR-24-1,miR-106a, miR-199a_l 和其组合;和 (vi)所述实体癌是胃癌，且所述miR基因产物选自:miR-223，miR-21,miR-218-2,miR-103-2, miR-92-2, miR-25, miR-136, miR-191, miR-221, miR-125b_2， miR-103-1,miR-214, miR-222, miR-212prec, miR-125b_l, miR-100, miR-107, miR-92-1, miR-96,miR-192, miR_23a，miR-215, miR-7-2, miR-138-2，miR-24-1, miR_99b，miR_33b，miR-24-2和其组合。
10.诊断受试者是否患有实体癌或处于发生实体癌的风险中的方法，其包括:(1)从获自受试者的测试样品逆转录RNA，以提供一组靶寡脱氧核苷酸；(2)使所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，以提供测试样品的杂交谱；和(3)对比测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱，其中至少一种miRNA的信号的改变指示着受试者患有实体癌或处于发生实体癌的风险中。
【文档编号】C12N15/113GK103642900SQ201310493368
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2007年1月3日 优先权日:2006年1月5日
【发明者】C·M·克罗斯, G·A·卡林, S·沃林尼亚 申请人:俄亥俄州立大学研究基金会