专利名称：一种肿瘤特异性靶向给药系统及其在制备治疗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种特异性靶向给药系统，具体地说，涉及一种可将各种治疗效应剂特异性导向肿瘤细胞的给药系统。
本发明还涉及该靶向给药系统在制备治疗肿瘤药物中的应用。
癌症从一开始就是一种全身疾病，特别是在手术切除原发病灶后，局部的复发以及远处的转移已成为限制疗效提高的主要原因，癌症的治疗在很大程度上取决于微小癌症的控制及清除。传统的辅助治疗如化疗、放疗、生物因子治疗，以及目前已在开展临床试验的基因治疗及免疫治疗等，均非特异性地针对肿瘤细胞，由于缺乏靶向性，引起对正常细胞的明显损伤。因这种损伤所带来的严重毒副作用往往限制了这些方法的使用及疗效的充分发挥。因此迫切需要一种靶向肿瘤细胞的导向性给药途径。这一靶向性的给药途径不仅可减少甚至避免对正常细胞带来的损伤，而且可将提高效应因子在肿瘤局部的浓度而提高疗效。
肿瘤的靶向治疗是肿瘤治疗最理想的用药途径，即通过全身用药并将效应剂如化疗药物、放射性核素、毒素及基因等特异性地靶向到肿瘤病灶发挥作用，而对正常组织损伤很小。自1975年成功建立单克隆抗体以来，单克隆抗体就成为导向药物靶向部分的首选对象。单抗导向药物面临的一个重要问题是由于肿瘤血流自身的动力学特点(血管淤曲、血流紊乱及组织静水压高)以及完整单克隆抗体或其Fab段分子量大、组织穿透力差等多方面的原因，导向性药物到达肿瘤细胞尤其是实体瘤深部细胞的数量有限。并且由于具有免疫原性，易为免疫系统识别清除，限制了其反复使用，因此抗体的小型化及低免疫原性成为发展趋势。近十余年来随着基因工程技术的迅速发展以及抗体工程和噬菌体展示技术的出现及发展，人们开始使用抗体的可变区scFv(即结合抗原的区域)作为靶向分子。单链抗体可变区(scFv)是用基因工程方法将重链可变区VH和轻链可变区VL通过连接肽(Linker)连接而成的重组蛋白，它是保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的最小功能性片段，具有在非靶向组织中滞留时间短、免疫原性弱、肿瘤穿透力强及制备经济等优点，因此在靶向给予药物、毒素及放射性核素、靶向性基因治疗和肿瘤的特异性诊断等领域具有重要应用潜力。早期从杂交瘤细胞株克隆出Fv区基因而获得的scFv由于效价的下降而使其亲和力较完整抗体低。随着噬菌体呈现文库技术的发展，特别是通过从大的噬菌体文库(＞109转化株)筛选出的scFv具有高亲和力，其亲和力相当于甚至超过再次免疫或三次免疫产生的抗体。但目前所能查到的基于scFv的基因导向系统均将scFv构建于病毒的表面，必然也避免不了病毒性载体的病原体感染的威胁和炎症反应等毒副作用。在scFv用于靶向给药方面，目前报道较多的是构建重组单链抗体免疫毒素，虽然其较传统具有免疫原性较低、易于穿透组织及更高疗效等优点，但由于其仅具有单效价抗原结合部位，其入胞率较低，并成为限制其疗效的主要原因。目前关于scFv与化疗药物及放射性核素结合的报道很少，有研究用将scFv与阿霉素等药用化学方法共轭结合，虽然融合分子能较好地导向肿瘤并进入细胞，但其在细胞内涵体及溶酶体中与抗体的解离程度及水解方式部分制约了其功效的充分发挥。
脂质体是目前所知的一种优良的运载载体，它可有效地将治疗基因、药物、毒素及放射性核素等治疗所需的效应物包裹并进行运输，其运输效率高，毒性低，若能将脂质体和单克隆抗体有效地结合在一起，则可构建特异性的靶向给药系统。
本发明的另一目的在于提供本发明的靶向给药系统在制备治疗肿瘤药物中的应用。
根据本发明的一方面，肿瘤特异性的靶向给药系统包括一抗体，一脂质体以及一连接抗体和脂质体的接头，在该系统中，抗体用于识别并结合肿瘤细胞表面的抗原，脂质体用于包裹并运输治疗效应剂，接头用于连接抗体和脂质体。
根据本发明的另一方面，用于识别并结合肿瘤细胞表面抗原的抗体可以为任何能与肿瘤细胞表面存在的抗原结合的单链抗体，优选为抗癌胚抗原(CEA)抗体、抗铁血蛋白-2(Her2)抗体、抗MAG(Myelin-Associated Glycoprotein)抗体、抗运铁蛋白(TFR)抗体等，最优选为抗运铁蛋白抗体。为提高药物的导向性并降低免疫原性，优选使用单链抗体的可变区scFv作为与肿瘤细胞表面抗原结合的抗体。
根据本发明的再一方面，脂质体可以使用任何适于包装和运输治疗效应物的脂质体，优选为阳离子脂的脂质体，这些脂质体可以商购或采用本领域技术人员已知的方法合成。
根据本发明的又一方面，提供本发明的靶向系统在制备治疗肿瘤药物中的应用，本发明的靶向系统可以包裹各种化疗药物、放射性核素、各种免疫毒素、以及肿瘤基因治疗的抑癌基因、反义核酸等治疗效应物，制备成治疗肿瘤的药物，在肿瘤的化疗、放疗和生物治疗中发挥作用。
本发明通过一个特异的接头将针对肿瘤表面抗原的scFv偶联到脂质体上，通过脂质体可较方便地将治疗基因、药物、毒素及放射性核素特异地导入肿瘤细胞，具有高效性、靶向性、低毒性等的优势，使其成为目前较理想的靶向给药系统。本发明的靶向给药系统具有以下优势1.安全性高，运用人源化的抗体片段及脂质体，具有毒副作用低及避免了使用异种蛋白及病毒等载体带来的炎症性及生物性危害。
2.靶向性高，针对肿瘤细胞特异给药，对正常细胞几乎无影响。
3.高效的导入效率。
4.设计方便经济，易于合成。采用基因工程合成抗体大大简化了生产工艺。
5.广阔的应用前景，运用脂质体可以很方便地包裹基因、反义核酸、化疗药物、毒素及放射性核素、6.适用于多种肿瘤病人手术后预防复发及晚期肿瘤患者的综合治疗。
附图简述
图1为本发明一个实施方案中靶向给药系统连接示意图；图2为本发明另一实施方案中靶向给药系统连接示意图。
发明的详细描述本发明靶向给药系统的构建基于抗原抗体特异性结合的原理，运用针对运铁蛋白TFR的抗Fv区(anti-TFRscFv)将脂质体包裹的效应因子特异性地导向肿瘤细胞。经研究发现，处于高代谢和高增殖率的肿瘤细胞膜表面异常高表达运铁蛋白(TFR)，它在各种肿瘤细胞中均广泛地表达增强，因此成为构建靶向抗体的理想因子。运用这一非特异性抗原单抗的效果明显优于运用更特异的肿瘤抗原单抗(如CEA，Her2，MAG等)，并且实验发现这种导向系统并不将效应因子导向骨髓、肠粘膜等正常组织，其原因可能是TFR虽然在正常组织中有表达，但其表达量远远低于肿瘤组织，当相应的抗体进入体内，往往优先与肿瘤细胞结合。本发明运用噬菌体呈现文库技术从经免疫的转基因小鼠中克隆并筛选抗TFR的scFv基因，并采用亲和力成熟技术提高抗体的亲和能力。设计了特殊的接头首次将scFv抗体连接于脂质体，通过脂质体可以很方便地包裹多种效应因子(如基因、化疗药物、放射性核素及毒素等)，实现靶向给药。这一系统较其它导向系统具有以下优点①由于scFv分子小，很易与脂质体一道通过渗透性增加的肿瘤毛细血管进入组织间隙，以scFv为导向的免疫脂质体在肿瘤组织中具有较高的组织传送力；②人化的scFv及脂质体均无免疫原性，不会因在机体内产生抗体而限制其重复使用；③脂质体较易通过内吞作用或与细胞膜融合作用入胞，在细胞内药物的释放容易，并且不存在抗体偶联药物改变了药物结构的问题。④实验还发现TFR-scFv能增强脂质体的入胞作用。
下面，结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明本发明实施例1脂质体的制备阳离子脂[Dioleoy]trimethylammonium propane(DOTAP)anddioleoyl phosphalidylothanolamine(DOPE)]的脂质体复合物按文献方法合成(Journal fo Controlled Release 61(1999)233-240)。
实施例2单链抗体的制备从经免疫的Fv区转基因小鼠中提取mRNA，用V区特异性启动子扩增VH和VL序列，并用亲和成熟技术提高抗体亲和力。将VH、VL用接头连接并克隆入噬菌体载体PCNTAB6(Pharmacia)，构建scFv抗体基因库。用TFR抗原包被的免疫柱筛选分离噬菌体抗体库，强酸洗脱结合抗原的噬菌体，感染大肠菌扩增噬菌体，并经多次筛选获得高亲和力的TfRscFv。纯化细菌膜上经脂修饰的TFRscFv得到一活性分子，它能与通过一种嵌入的脂标签连接到脂质体。脂修饰的TFRscFv是从细菌表达宿主SFH0F的膜上分离的。并通过金属整合层析从去污剂溶解的膜中纯化。TTRscFv免疫脂质体的基本制备方法见deKruif等人的描述。以干胶片形式制成的脂(DOTAP/DOPE)与脂修饰的TFRscFv一起用1％的n-辛基β-D-葡萄糖苷溶解。
实施例3抗体与脂质体的连接参见图1和图2，以上制备得到的单链抗体与脂质体和接头进行连接，构建靶向给药系统。
实施例4靶向性化疗临床使用的抗癌药物最大的副作用就是对正常增殖细胞亦有杀伤作用，特别是对骨髓、肠道粘膜、肝脏及肾脏等器官的毒性常常限制了化疗的继续运用甚至直接给病人带来生命危险。运用anti-TFRscFv-lipob将药物特异导向肿瘤细胞，可明显提高肿瘤局部药物浓度，降低药物用量，实验发现对骨髓及肠粘膜无明显损害。我们用anti-TFRscFv-lipob包裹阿霉素治疗接种了肺癌细胞的荷瘤小鼠，结果发现治疗组小鼠肺部病灶的数目及大小均显著减小，85.9％的小鼠病灶完全消失，全部小鼠长期存活(170d)，而不用特异性导向的对照治疗组未有长期存活者。用anti-TfRscFv-lipob包裹柔红霉素的实验取得了类似结果。我们初步的实验结果显示该靶向系统可明显增强以下化疗药物的疗效阿霉素、柔红霉素、苯丁酸氨芥、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、顺铂、三亚胺醌、长春地辛、左旋苯丙酸氮芥、炭疽菌素、maytansioids、长春新碱及博安霉素。
实施例5靶向基因治疗大量的研究表明，正常细胞的恶性转化涉及到癌基因和抑癌基因的相互消长，一方面是癌基因的异常激活和过渡表达，另一方面是抑癌基因产物的缺失或失活。而基因治疗是生物治疗方向，通过导入基因使这些细胞正常生长，分泌有效因子，以调节各种抗癌免疫活性细胞或直接作用于癌细胞或调节肿瘤对其它治疗措施如化、放疗的敏感性。目前肿瘤基因治疗临床实验效果不理想，最关键的问题是缺乏具有导向性的高效载体系统。
我们应用anti-TTRscFv-lipo介导野生型p53(wtp53)基因转染治疗前列腺癌的荷瘤小鼠，通过静脉用药约50％肿瘤细胞被转染(明显高于腺病毒wtp53局部注射的转染率)，配合放疗，实验组小鼠肿瘤完全消退，小鼠全部长期生存，效果明显优于单独放疗及腺病毒介导的wtp53基因治疗。我们运用该导向系统转染wtp53治疗了10例其它治疗方法无效的晚期肺癌病人，其中1例病人癌灶完全消失，3例癌灶明显缩小，4例肿瘤大小停止发展。疗效令人满意。
我们用anti-TFRscFv-lipo介导联合转染自杀基因RSV-tk及IL-2基因治疗结肠癌肝转移的动物模型，发现肿瘤细胞基因转移率达65％，联合转染组肿瘤完全消退，单独转染IL-2及RSV-tk的肿瘤面积分别为120mm2和25mm2。
我们还运用该转染系统介导反义构建的Bcl-2基因治疗晚期鼻咽癌，反义Bcl-2基因转染联合肿瘤病灶的放射治疗，可较单独放疗提高有效率30％，接受联合治疗的26例肿瘤完全消退的病例中至今无一例发现肿瘤复发，最长的已无病生存26月。疗效非常满意。
该导向系统可被用于以下几个方面的基因治疗(包括联合基因治疗)1、免疫因子体系TNF、IL-2、GM-CSF、IL12等2、抑癌基因wtp53、Rb、p16、p21等3、组织相容性抗原及共刺激因子如HLA及B7等4、自杀基因治疗单纯疱疹病毒胸甘激酶HSV-tk，胞嘧啶脱胺酶CD、大肠杆菌硝基还原酶等。
5、反义基因治疗如bcl-2、c-myc、k-ras等实施例6放射性核素靶向治疗放射免疫治疗应用特异性抗体将放射性核素导向肿瘤病灶局部，发挥局部杀伤作用，具有选择性杀伤及针对微小病灶的优点，一直备受关注。但以往的抗体免疫复合物存在多个主要缺陷，由于复合物分子较大，较大肿瘤内放射性核素摄取率大约仅为0.001-0.01％ID/g；抗体与核素结合较紧密，存在入胞后降解和脱卤的问题；由于非人源性抗体，应用后体内产生抗体，限制了其多次使用。我们的这一导向系统较好地克服了上述缺陷。我们用anti-TFRscFvg-lipo包裹Y90治疗肺癌的荷瘤小鼠，发现在3cm大小的肿瘤内摄取率可达到1％ID/g，该病灶内吸收剂量达20000cGy，平均照射剂量大约为289cGy/hr。所有荷瘤小鼠病灶完全消退，小鼠长期无病生存，并且未发现有明显毒副作用。
适合用于该系统核素导向治疗的核素包括131I、125I、33P、198Au、90Y、188Re等。
实施例7用于免疫毒素治疗免疫毒素由于结合了天然毒素的高效的细胞毒性及抗体的特异性靶向作用，具有诱人的使用前景。但常规的方法是将毒素与抗体交联，交联过程往往复杂困难，又需要白蛋白中间引桥，这就引起了许多问题一是抗体和毒素的生物学活性受到影响甚至消失；二是交联物往往不稳定，保存时间短；三是交联物分子相对较大，体内应用易被清除循环系统；四是交联物是不易纯化。这些严重影响了交联物的使用。我们这一系统将毒素包裹与免疫脂质体之内，避免了交联所引起的以上问题。我们应用anti-TFRscFv-lipo导向假单胞菌属外毒素A(PE)治疗裸鼠体内的移植卵巢癌，可使肿瘤全部消退，长期无病生存。较常用的生物毒素包括假单胞菌属外毒素(PE)/蓖麻毒素(RA)。
权利要求
1.一种肿瘤特异性靶向给药系统，其特征在于，它包括一抗体，用于特异性识别并结合肿瘤细胞的表面抗原；一脂质体，用于包裹并运输治疗效应剂；以及一接头，用于连接所述抗体与所述脂质体。
2.根据权利要求1所述的给药系统，其特征在于所述抗体为单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的给药系统，其特征在于所述单克隆抗体为抗癌胚抗原抗体、抗铁血蛋白抗体、抗MAG抗体、抗运铁蛋白抗体。
4.根据权利要求3所述的给药系统，其特征在于所述抗体为抗运铁蛋白抗体。
5.根据权利要求3所述的给药系统，其特征在于所述抗体使用单链抗体的可变区scFv。
6.根据权利要求1所述的给药系统，其特征在于所述脂质体为阳离子脂的脂质体。
7.根据权利要求1所述的给药系统，所述治疗效应剂选自化疗药物、放射性核素、免疫毒素、抑癌基因、反义核酸的至少一种或几种。
8.肿瘤特异性靶向给药系统在制备治疗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种可将各种治疗效应剂特异性导向肿瘤细胞的给药系统。包括一抗体，一脂质体以及一连接抗体和脂质体的接头，在该系统中，抗体用于识别并结合肿瘤细胞表面的抗原，脂质体用于包裹并运输治疗效应剂，接头用于连接抗体和脂质体。本发明的给药系统安全性高、靶向性高、具有高效的导入效率，而且设计方便经济，易于合成，具有广阔的应用前景。
文档编号A61K51/00GK1448183SQ0210545
公开日2003年10月15日 申请日期2002年4月4日 优先权日2002年4月4日
发明者周向阳 申请人:深圳市生尔易实业发展有限责任公司